Nguyên lý:
Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện diện di SDS-PAGE. Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzym (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của protein ngoại lai sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.
Tiến hành:
Chạy điện di protein (SDS-PAGE). Chuẩn bị các dung dịch: 1x đệm lai + methanol ở 4 C; methanol ở -20 C, sữa gầy. Cắt màng PVDF có kích thước bằng bản gel, ngâm màng trong methanol lạnh trong 5 phút, để tách màng ra lấy lớp ở giữa. Ngâm bộ chuyển màng trong 1x đệm lai trong 5 phút
Chuyển màng: chuyển protein sau khi chạy SDS-PAGE sang PVDF. Bộ chuyển màng được sắp xếp theo thứ tự: (1) bản đen (-); (2) xốp; (3) giấy thấm; (4) gel; (5) PVDF; (6) giấy thấm; (7) xốp; (8) bản đỏ (+). Chạy 100 V trong 2 h ở 4 C.
Thu lại màng PVDF. Rửa ba lần bằng nước khử ion. Sau đó phủ màng bằng 5% sữa gầy trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 4ºC. Rửa ba lần bằng 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắc protein 50 vòng/phút. Tiếp tục rửa tiếp ba lần bằng 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắc protein 50 vòng/phút.
Nhuộm màng bằng kháng thể 1 (KT1) pha loãng 500 lần trong 5% sữa gầy, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 1x TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắc protein 50 vòng/phút. Rửa tiếp ba lần bằng 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắc protein 50 vòng/phút.
Nhuộm màng bằng kháng thể 2 (kháng kháng thể 1) gắn enzym cộng hợp kháng thể pha loãng 10.000 lần trong 5% sữa gầy, lắc trong 2-3 h. Rửa ba lần bằng 1x TTBS,
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 41
mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắcprotein 50 vòng/phút. Rửa tiếp ba lần bằng 1x TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút bằng máy lắc gel 50 vòng/phút.
Hiện màng: nghiền 1 viên cơ chất trong 10 ml nước cất. Ủ màng với dung dịch cơ chất và chờ đến khi màu hiện lên rõ thì đổ bỏ và rửa lại bằng nước khử ion.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 42
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus và nhân dòng gen seb 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số S. aureus
Để thu được DNA hệ gen của S. aureus, vi khuẩn S. aureus được nuôi lắc trong môi trường LB lỏng ở 37 oC qua đêm và tiến hành tách chiết theo quy trình tách chiết ở mục 2.2.1. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng SDS. Protein liên kết với DNA và một số protein khác được phân giải bằng proteinase K. Protein có khối lượng lớn còn lại sau khi xử lí với enzym được loại bỏ bằng cách ly tâm, protein nhỏ hòa tan vào dung dịch Chloroform/ Isoamyl nằm ở pha dưới. DNA tổng số ở pha trên được tủa lại bằng cồn và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả tách chiết DNA tổng số được trình bày trên hình 3.1.
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số của chủng S. aureus
1, 2, 3: Sản phẩm tách DNA tổng số của chủng S. aureus
Kết quả kiểm tra trên điện di đồ cho thấy, DNA là một băng rõ nét, sạch, đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen seb bằng kĩ thuật PCR.
3.1.2. Nhân dòng gen seb
Đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên wtSEB được khuếch đại từ DNA tổng số của S. aureus bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEB-F và SEB-R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho kết quả là một băng vạch đặc hiệu,
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 43
rõ nét và không có vạch phụ kèm theo, có kích thước khoảng 534 bp phù hợp với tính toán lý thuyết của cặp mồi thiết kế (Hình 3.2). Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch, xử lý đầu bằng, gắn vào vector pJET1.2/blunt bằng enzym ligase T4 để hình thành plasmid tái tổ hợp pJET/seb và biến nạp vào chủng khả biến E. Coli DH5α. Các khuẩn lạc được nuôi cấy và tách DNA plasmid để cắt kiểm tra bằng hai enzym hạn chế
EcoRI và HindIII để chắc chắn vector mang đoạn gen đích. Kết quả kiểm tra sơ bộ các plasmid tách từ các thể biến nạp cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp đều có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng (Hình 3.3). Điều đó chứng tỏ các dòng plasmid này đã có gen ngoại lai gắn vào. Khi cắt các dòng plasmid tái tổ hợp bằng hai enzym trên đều cho một băng DNA tương ứng với kích thước của gen seb (khoảng 534 bp) và một băng tương ứng với kích thước của vector pJET1.2 (khoảng 3000 bp) (Hình 3.4). Như vậy, gen seb đã được nhân dòng thành công trong vector pJET1.2.
1 2 3
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen seb từ DNA tổng số của S. aureus
M. Thang chuẩn DNA 1 kb 1, 2: Sản phẩm PCR gen seb
Hình 3.3. Điện di đồ plasmid mang gen seb
được tách chiết từ thể biến nạp 1: plasmid pJET1.2/blunt
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 44
3.1.3. Xác định trình tự gen seb
Trong quá trình tiến hành PCR, sai sót có thể xảy ra trong sản phẩm PCR, đặc biệt là sự biến đổi nucleotide trong thành phần gen seb. Mặc dù những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gen. Sự thay thế nucleotide không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotide dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, để kiểm tra gen seb đã được tách dòng chính xác là gen mong muốn, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen seb trong vector pJET1.2. Đoạn gen seb của chủng S. aureus nghiên cứu đã được xác định trình tự nucletide trên máy đọc tự động ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi có trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với những kết quả đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc và so sánh trình tự được trình bày ở hình 3.5 và bảng 3.1.
1 ccagatgagt tgcacaaagc gagtaaattc actggtttga tggaaaatat gaaagttttg 61 tatgatgata atcatgtatc agcaataaac gttaaatcta tagatcaatt tctatacttt 121 gacttaatat attctattaa ggacactaag ttagggaatt atgataatgt tcgagtcgaa 181 tttaaaaaca aagatttagc tgataaatac aaagataaat acgtagatgt gtttggagct 241 aattattact atcaatgtta tttttctaaa aaaacgaatg atattaattc acatcaaact 301 gacaaacgaa aaacttgtat gtatggtggt gtaactgagc ataatggaaa ccaattagat 361 aaatatagaa gtattactgt tcgggtattt gaagatggta aaaatttatt atcttttgac 421 gtacaaacta ataagaaaaa agtgactgct caagaattag attacctaac tcgtcactat 481 ttggtgaaaa ataaaaaact ctatgaattt aacaactcgc cttatgaaac ggga
Hình 3.5. Trình tự gen seb của chủng S. aureus
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/seb
bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII M: Thang chuẩn DNA 1 kb
1, 2: Sản phẩm cắt pJET1.2/seb bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 45
Bảng 3.1. Độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)
TT Tên trình tự gen tƣơng đồng với gen seb Mã số trên
NCBI
Tỉ lệ tƣơng đồng (%)
1 Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity
island, strain: IVM10 AB716349.1 100%
2 Staphylococcus aureus strain F136 enterotoxin
B precursor (seb) gene, partial cds DQ997828.1 100%
3 Staphylococcus aureus partial seb gene for
staphylococcal enterotoxin B precursor (SEB) AM158256.1 100%
4 Staphylococcus aureus strain 339E enterotoxin
seb variant gene, partial cds AY196689.1 100%
5
Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity island SaPITokyo12413, complete sequence, strain: Tokyo12413
AB860415.1 99%
6 Staphylococcus aureus strain 2395 USA500,
complete genome CP007499.1 99%
Kết quả giải trình tự gen seb trong vector tách dòng pJET1.2 cho thấy, gen seb
chứa khoảng 534 nucleotide và tương đồng 100% với gen seb mã số DQ997830.1, AM158256.1, AB716349.1 trên ngân hàng gen quốc tế; tương đồng 99% với gen seb
mã số AB860416.1, CP003166 và nhiều mã số khác trên ngân hàng gen quốc tế. Như vậy, các dòng tế bào E. coli DH5α đã mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa cho kháng nguyên SEB. Gen seb tự nhiên được sử dụng để tạo đột biến điểm trên gen nhằm tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp không độc.
3.2. Tạo đột biến điểm trên gen seb3.2.1. Tạo gen seb đột biến 3.2.1. Tạo gen seb đột biến
Dựa trên các đặc tính giống nhau về mặt cấu trúc giữa amino acid histidine và tyrosine, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tạo đột biến thay thế các amino acid histidine tại các codon đầu tiên trong chuỗi polypeptide SEB bằng các amino acid tyrosine đã làm giảm hoàn toàn độc tố của SEB (non-toxic SEB protein) nhưng vẫn
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 46
giữ được tính đặc hiệu gắn kết trực tiếp vào các phân tử phức hợp tương mô nhóm II (MHC) (Korolev et al., 2003; Savransky et al., 2004). Từ vector tái tổ hợp mang đoạn gen seb tự nhiên (wtSEB) được dùng làm khuôn trong phản ứng khuếch đại tạo mega- primer. Theo tính toán lý thuyết sản phẩm tạo thành có kích thước lần lượt là 59 bp, 122 bp, 339 bp và 383 bp tương ứng với các mega-primer mang đột biến H12Y, H32Y, H105Y, H121Y. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Trên hình 3.6 là minh họa về quy trình tạo đột biến ở vị trí codon 12. Tạo đột biến tại các codon tiếp theo 32, 105 và 121 cũng được thực hiện tương tự như tại codon 12. Chúng tôi đã nhân được các đoạn mega-primer mang các trình tự đột biến đúng theo như tính toán lý thuyết. Trên hình 3.7A là kết quả điện di của hai trong số bốn các mega-primer được tạo ra sau phản ứng PCR lần 1. Các mega-primer này được tinh sạch và sử dụng làm mồi để khuếch đại đoạn gen seb hoàn chỉnh có kích thước khoảng 534 bp trong phản ứng PCR lần 2 và sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.7B). Kết quả điện di trên hình 3.7B cho thấy, sản phẩm PCR là một băng đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Điều đó chứng tỏ thành phần và chu trình nhiệt cho PCR tạo các đột biến là đặc hiệu với gen seb. Nhưng để chắc chắn rằng gen seb đột biến được tạo ra chứa chính xác bốn vị trí mã bộ ba cần thay đổi, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định trình tự gen seb đột biến này.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 47
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %. A. Sản phẩm PCR lần 1; B. Sản phẩm PCR lần 2. 1, 2: Các mega-primer H32Y, H121Y; 3: Thang DNA chuẩn 100 bp; 4: Thang DNA chuẩn 1 kb; 5-8: Các dòng gen mang đột biến H12Y, H32Y, H105Y, H121Y.
3.2.2. Xác định trình tự gen seb đột biến
Gen seb sau khi tạo đột biến điểm tại 4 vị trí codon 12, 32, 105 và 121 bằng phản ứng PCR được tinh sạch và tách dòng vào vector pJET1.2/bunt. Chọn ra một số dòng khuẩn lạc mang gen đột biến đã được tách chiết và cắt kiểm tra bằng enzym hạn chế để đọc trình tự trên máy ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Trình tự gen
seb đột biến được phân tích, xử lý bằng phần mềm CLC Sequence Viewer, BioEdit và dịch mã thành trình tự amino acide để so sánh với trình tự amino acid ban đầu của dòng chưa đột biến (wtSEB). Kết quả tại vị trí codon số 12; 32; 105; 121 đã có sự thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine (Hình 3.8). Như vậy, chúng tôi đã tạo ra các dòng gen seb chứa các điểm đột biến tại các vị trí mong muốn.
Hình 3.8. Trình tự amino acid sai khác giữa dòng đột biến (mtSEB) và dòng chưa đột biến (wtSEB)
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 48
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen seb đột biến
3.3.1. Thiết kế vector pET22(b+) mang gen seb đột biến
Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen seb, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET22(b+) và vector tách dòng pJET1.2/bunt, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym cắt hạn chế là EcoRI và HindIII không có trong trình tự gen seb, vector pJET1.2/bunt và có trong vùng đa tách dòng vector pET22(b+). Chính vì vậy, khi thiết kế mồi cho PCR chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự của enzym EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen seb (đầu 5’và đầu 3’), nhằm nhân được đoạn gen seb có chứa trình tự của hai enzym này ở hai đầu. Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET22(b+) từ vị trí mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 amino acid histidine và kết thúc ở bộ ba kết thúc. Đầu tiên, gen seb được nhân dòng trong pJET1.2/blunt với cặp mồi SEB Exp-F và SEB Exp-R với mục đích tạo được protein tái tổ hợp hoàn chỉnh, không bị lẫn một số amino acid nằm trong vùng đa nối của vector pET22b(+). Tiếp theo, đoạn gen seb và vector biểu hiện pET22(b+) được cắt mở vòng bằng hai enzym EcoRI và HindIII để tạo đầu so le, sau đó được tinh sạch và ghép nối với nhau tạo vector tái tổ hợp pET22(b+) mang gen seb đột biến nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 rồi chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc và cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng hai enzym hạn chế.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp pET22b+/mtSEB. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1: Đối chứng âm; 2-4: Sản phẩm PCR trực tiếp của các dòng khuẩn lạc khác nhau mang gen seb đột biến
M 1 2 3 4 534 500 250 1000 bp
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 49
Kết quả PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR) với cặp mồi đặc hiệu của gen mtSEB (SEB Exp-F và SEB Exp-R) cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước khoảng 534 bp (Hình 3.9), kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết.
Tiếp tục kiểm tra các dòng có colony-PCR dương tính bằng phương pháp cắt plasmid bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII. Kết quả thu được trên hình 3.10 cho thấy ở các giếng 1, 2, 3 sản phẩm cắt phân thành 2 băng tương ứng với kích thước của vector pET22b(+) khoảng 5500 bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 534 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET22b(+)/mtSEB. Gen seb đột biến trong vector biểu hiện sẽ được giải trình tự để khẳng định lại gen đích.
3.3.2. Giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện
Để chắc chắn vector biểu hiện chúng tôi thiết kế mang đoạn gen seb đột biến, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen dòng khuẩn lạc số 1. Kết quả xác định trình tự gen seb đột biến từ khuẩn lạc dòng số 1 và sau khi được xử lý bằng phần mềm Bioedit được trình bày trong hình 3.11.
Hình 3.10. Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, HindIII. M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-3: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp của các dòng mang gen seb đột biến M 1 2 3 534 250 500 1000 ~5500 bp
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 50
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của wtSEB và mtSEB
Theo hình 3.11 chúng tôi đã tạo được các đột biến thay thế nucleotide C bằng T ở các bộ ba mã hóa cho histidine và tyrosine như theo lý thuyết. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa vào các thiết bị tự động cho kết quả rõ ràng. Như vậy, chúng tôi kết luận đã thiết kế thành