Cấu trúc chung của một hệ biểu hiện cần có đặc điểm như chứa đựng promoter mạnh, phù hợp với tế bào biểu hiện, chứa đựng trình tự khởi đầu và trình tự kết thúc của phiên mã, chứa vùng đa nối với vị trí cắt duy nhất trong vector đối với từng enzym hạn chế, chứa một đoạn peptid tín hiệu để làm dấu hiệu cho sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngoài tế bào chất và mang một vài dấu chuẩn chọn lọc để phục vụ cho mục đích sàng lọc thể biến nạp.
Vector biểu hiện pET22(b+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng - cơ bản như một plasmid như sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào. Ngoài ra, hệ vector pET22(b+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, phù hợp cho việc biểu hiện gen như: Gen ngoại lai được điều khiển bởi T7 promoter đây là promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn chiếm 10 – 30% tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng nên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Trên vector còn có vị trí đa tách dòng (Multiplex cloning site-MCS) tạo thuận lợi cho việc ghép nối gen và vector, có trình tự dẫn pelB để đưa protein ra ngoài khoang chu chất, có chỉ thị cho chọn lọc dòng là ampicillin. Quá trình phiên mã được điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG. Sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 amino acid Histidine tiện lợi cho việc tinh sạch protein tái tổ hợp theo phương pháp sắc ký ái lực. Do đó chúng tôi đã lựa chọn vector này để biểu hiện cho protein tái tổ hợp của gen ngoại lai
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 26
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Chủng vi sinh vật:
- Chủng Escherichia coli DH5α (Invitrogen, Mỹ). - Chủng Escherichia coli BL21 (DE3) (Invitrogen, Mỹ). - Chủng S. aureus do Học Viện Quân Y cung cấp.
Plasmid:
- Plasmid pJET1.2/blunt có kích thước 2974 bp, [T7 promoter, Ampr] (Fermentas, Mỹ).
- Plasmid pET22b(+), kích thước 5493 bp, [T7 promoter, T7 terminater, N-terminal T7•Tag sequence, C-terminal His•Tag sequence, Ampr] (Novagen, Mỹ).
Mồi:
Bảng 2.1. Các mồi sử dụng
Tên mồi Trình tự (5′ 3′) Ghi chú
SEB – F SEB – R
ccg GAATTC atg CCA GAT GAG TTG CAC AAA ccc AAGCTT tca TCC CGT TTC ATA AGG CGA
Mồi nhân dòng đoạn gen seb
SEB Exp – F SEB Exp – R
ccg GAATTC atg CCA GAT GAG TTG CAC AAA ccc AAGCTT tca gtggtggtggtggtggtg TCC CGT TTC ATA AGG CGA
Mồi biểu hiện với vector pET22b(+) H12Y-R
H32Y-R H105Y-R H121Y-R
TACTCGATTTGTACAACTCATC CGTTTATTGCTGATACATAATTATC CGTTTGTCAGTTTGATAGAAT GGTTTCCATTATACTCAGTTAC
Mồi tạo đột biến điểm trên gen seb
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: Agar từ Serva (Pháp); agarose, Trypton, Trisbase, Cao nấm men từ Biobasic (Canada); acrylamide, APS; TEMED, chloroform : isoamyl aclohol (24:1), imidazole, EDTA, urea, anti-
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 27
mouse IgG, 5-Bromo-4-chloro3-indolyl phosphate, Hybond-P polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes, Coomassie Brilliant Blue R-250, Coomassie Brilliant Blue G-250, Reagent Bradford từ Sigma (Mỹ); IPTG, Ethidium bromide, Taq
polymerase, proteinase K, RNase, BSA, thang chuẩn DNA từ Fermentas (Mỹ); mồi từ IDT (Mỹ); enzym hạn chế từ NEB (Mỹ); T4 ligase, Ni-NTA agarose từ Invitrogen (Mỹ), ampicillin từ Mekopha (Việt Nam); giấy Whatman, thang chuẩn protein từ GE Healthcare (Mỹ); Glycine, Trisbase, SDS, Methanol, Skim milk, KCl, NaCl, Na2HPO4, KH2PO4 từ Merck (Đức).
Dung dịch và đệm
Các loại dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch
Dung dịch Thành phần, nồng độ
10x đệm lai 30 g Tris base; 144,13 g glycine, định mức bằng nước cất đến 1000 ml 1x đệm lai + 100% methanol 100 ml 10x đệm lai; 200 ml 100% methanol; 700 ml H2O 1x TBS 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 100 mM NaCl chỉnh pH 7,5 1x TTBS 50 ml TBS 10x; 250 µl Tween 20; 450 ml H2O
Dung dịch nhuộm protein 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid, 40% (v/v) nước khử ion Dung dịch rửa nhuộm 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid, 40% nước khử ion Dung dịch nhuộm DNA 0,1 g/ml ethidium bromide
Cồn rửa DNA 70% ethanol
Đệm tách chiết DNA 10% (v/v) Tris-HCl 1M (pH 8), 20% (v/v) EDTA 0,5 M (pH 8), 10% (v/v) NaPP 1M (pH 8), 23,4% (v/v) NaCl 5 M, 1% (w/v) CTAB
Đệm TE 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0
Đệm 1x TAE 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8,4 Đệm 6x tra mẫu DNA 0,09% brommophenol blue, 0,09% xylene xyanol (FF), 60%
glycerol
Đệm 5x tra mẫu protein 4% SDS, 20%glycerol, 0,02% brommophenol blue, 1/10 β- mercaptoethanol, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 28
Phosphate buffer Saline 1X
1,4 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4
Dung dịch imidazole 3 M imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM natri phosphate, pH 6,0 Đệm rửa biến tính 5 M urea, đệm 1x PBS, 20 mM Imidazole
Đệm thôi biến tính 5 M urea, đệm 1x PBS, 400 mM Imidazole Sữa gầy 5% sữa gầy pha trong dung dịch 1x TBS
Tris-HCl 1M 24,288 g Trisbase, định mức bằng nước cất đến 200 ml, pH 6,8 Tris-HCl 1,5 M 36,342 g Trisbase, định mức bằng nước cất đến 200 ml, pH 8,8 Sol I 50 mM glucose; 25 mM tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0
Sol II 0,2 N NaOH, 1% SDS
Sol III 60% CH3COOK, 11,5% acetic acid nguyên chất, 28,5% nước cất
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men, 1% (w/v) NaCl, pH 7,5. Môi trường rắn được bổ sung 2% (w/v) agar. Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid bổ sung 100 g/ml ampicillin.
2.1.4. Thiết bị máy móc
Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy đo pH (ThommasScientific, Mỹ), máy lắc ổn nhiệt (N-Biotek, Hàn Quốc), bể ổn nhiệt (N-Biotek, Hàn Quốc), thiết bị siêu âm (Eppendorf, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Nguyên tắc:
Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân, (2) Loại protein, (3) Tủa DNA.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 29
Tiến hành:
Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000 v/p trong 7 phút, thu cặn loại bỏ dịch. Bổ sung 540 μl đệm tách chiết vào mỗi mẫu rồi votex kĩ để hòa tan tế bào. Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37oC trong 90 phút. Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn. Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới. Lặp lại bước này thêm 1 lần nữa. Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa. Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu cặn. Làm khô DNA bằng máy hút chân không Mi-vac 110 V, sau đó hòa tan DNA trong nước khử ion và bảo quản mẫu ở -20oC.
2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên lý:
Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát triển năm 1986. Phương pháp này được ứng dụng trong sinh học phân tử để khuếch đại in vitro số lượng lớn một trình tự DNA bằng enzym polymerase và một cặp mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) qua phản ứng chuỗi trong một chu kì nhiệt (Mullis et al., 1986).
Tiến hành:
Gen seb được nhân bản với các cặp mồi tương ứng (bảng 2.1) trong phản ứng PCR có thành phần như trong bảng 2.3 và chu trình nhiệt ở bảng 2.4.
Bảng 2.3. Thành phần PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
Đệm 10x 1X 2,50
MgCl2 2,5 mM 2,50
dNTP 2 mM 2,00
Mồi xuôi 10 pmol/µl 1,00
Mồi ngược 10 pmol/µl 1,00
Taq-polymerase 5 U/µl 0,25
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 30
H2O khử ion vô trùng 14,75
Tổng thể tích 25,00
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các PCR
Phản ứng PCR Chu trình nhiệt
Nhân gen seb 94°C/3 phút, 32 chu kỳ (94°C/30 giây, 61°C/45 giây,
72°C/45 giây); 72°C/10 phút Nhân gen seb để biểu
hiện trong pET22b(+)
95°C/5 phút, 30 chu kỳ (95°C/45 giây, 55°C/30 giây, 72°C/30 giây); 72°C/10 phút
2.2.3. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR)
Nguyên lý:
Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA được thay thế bằng DNA plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94oC đến 95oC, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.
Tiến hành:
Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25 µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 5 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.2.
2.2.4. Tách dòng bằng vector pJET1.2/blunt
Nguyên lý:
pJET1.2/blunt là vector chọn lọc có kích thước 2974 bp, có khả năng tiếp nhận các đoạn chèn có kích thước từ 6 bp đến 10 kb. Đầu 5’ của vị trí tách dòng chứa các nhóm phosphoryl, do đó, không cần phosphoryl hóa các mồi PCR. Vector pJET1.2/blunt nếu không được chèn đoạn DNA ngoại lai sẽ biểu hiện enzym giới hạn
Eco47IR gây chết và không hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy sau quá trình biến nạp. Do đó, chỉ có những dòng tái tổ hợp chứa đoạn chèn mới mọc được trên môi trường nuôi cấy.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 31
Tiến hành:
Thực hiện phản ứng cắt tạo đầu bằng trên đá với thành phần phản ứng gồm 10 µl 2X Reaction Buffer, 1 µl Sản phầm PCR sau tinh sạch, thêm nước khử ion đến 17 µl rồi thêm 1 µl DNA Blunting Enzym. Hỗn hợp phản ứng được làm tan trong thời gian ngắn và li tâm trong 3 đến 5 giây, sau đó được ủ 70oC trong 5 phút rồi cắm vào đá. Thêm 1 µl vector nhân dòng pJET1.2/blunt (50 ng/µl) và 1 µl T4 DNA Ligase vào ống phản ứng, làm tan nhẹ rồi li tâm 3 đến 5 giây. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng (22oC) trong 5 phút, sau đó có thể được sử dụng trực tiếp cho biến nạp.
2.2.5. Xác định trình tự acid nucleic
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) (Sanger et al., 1977) dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp vào đầu 3'-OH, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide được xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và không gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide (Ju et al., 1995).
Plasmid nhân dòng pJET1.2/SEB, plasmid biểu hiện pET22b(+)/SEB tinh sạch theo phương pháp chuẩn dùng làm khuôn chạy PCR để đọc trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Phần mềm Bioedit và BLAST được sử dụng phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid.
2.2.6. Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer
Nguyên lý:
Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer là một phương pháp truyền thống trong tạo đột biến điểm bằng kỹ thuật PCR. Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên các cặp mồi được thiết kế có chứa các vị trị cần tạo đột biến. Sản phẩm DNA mang đột biến sẽ được nhân lên trong các phản ứng PCR.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 32
Để tạo gen SEB mang đột biến điểm bằng phản ứng PCR, các cặp mồi được thiết kế phải chứa trình tự nucleotide cần thay đổi đó. Trên đoạn gen seb cần tạo 4 đột biến điểm tại các codon 12, 32, 105 và 121 làm biến đổi amino acid histidine thành tyrosine, theo đó tại 4 condon này các nucleotide mã hóa cho histidine cần được biến đổi thành các nucleotide mã hóa cho tyrosine và được viết như sau: CAC(12)TAC, CAT(32)TAT, CAT(105)TAT, CAT(121)TAT tương ứng với sự thay thế His12Tyr, His32Tyr, His105Tyr, His121Tyr (H12Y, H32Y, H105Y, H121Y). Đoạn gen seb đột biến được tạo ra bằng cách thay đổi lần lượt từ 1 đến 4 vị trí của Histidine thành Tyrosine. Từng điểm đột biến được tạo ra trên gen phải thực hiện 2 phản ứng PCR kế tiếp nhau (Barik, 1993). Phản ứng PCR lần 1 được tiến hành với các thành phần như sau: 10-100 ng DNA plasmid khuôn; 50 pmol mồi xuôi; 50 pmol mồi đột biến; 10 μl dNTPs dung dịch gốc để đạt nồng độ cuối là 0,2 mM; 2,5 U Pfu DNA polymerase; 10 μl đệm PCR 10X, bổ sung nước khử ion để tổng thể tích phản ứng đạt 100 μl. Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như sau: 94oC trong 3 phút; 30 đến 35 chu kỳ (94oC: 1 phút; 55oC: 2 phút; 72oC: 1 phút); 72oC: 7 phút. Sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm PCR lần 1. Tiếp tục thực hiện hiện phản ứng PCR lần 2 như sau: Chuẩn bị 100 μl phản ứng gồm đệm PCR 10X (10 μl); 2 mM dNTPs; DNA khuôn (1-2 μg); 20-30 pmol mồi megaprimer; mồi ngược (0,2-0,4 μg); 2,5 U Pfu DNA polymerase; nước khử ion. Chu trình nhiệt cho PCR lần 2 tương tự như lần 1 nhưng nhiệt độ gắn mồi cao hơn. Sản phẩm PCR lần 2 được kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose. Sản phẩm PCR chứa các đột biến điểm được đưa vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào vector tách dòng E. coli DH5α.
2.2.7. Phản ứng nối ghép gen
Nguyên lý:
Enzym T4 ligase được tách chiết từ các tế bảo E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4. Enzym này có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm OH ở đầu 3’ và nhóm phosphat đầu 5’ trên mạch DNA hoặc RNA.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 33
Phản ứng gắn dính bao gồm 4 µl đệm gắn dính 5x; 3 µl DNA plasmid; 9 µl đoạn chèn DNA; 2,5 µl T4 ligase; 1,5 µl nước khử ion; tổng thể tích 20 µl phản ứng. Trộn hỗn hợp phản ứng cẩn thận và ủ qua đêm ở 16°C.
2.2.8. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến Escherichia coli
Nguyên lý:
Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 và BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, sử dụng sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ để tác động lên cấu trúc thành tế bào, tạo điều kiện cho DNA ngoại lai đi vào trong tế bào.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 4 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Chuyển 1 ml dịch nuôi vào bình 100 ml LB lỏng, tiếp tục nuôi lắc ở 37°C trong 3-3,5 giờ để đạt OD600nm 0,5-0,6. Dịch nuôi cấy để lạnh hoặc cắm trong đá 10 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Thu cặn tế bào, úp ngược ống trên giấy phơi khô trong 1 phút. Hòa tế bào bằng cách khuấy hoặc vortex nhẹ trong 30 ml dung dịch MgCl2- CaCl2 lạnh (80 mM MgCl2; 20 mM CaCl2). Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để thu cặn tế bào, sau đó úp ngược phơi khô trong 1 phút. Tiếp tục hòa tế bào trong 2 ml CaCl2 0,1 M với 50 ml môi trường gốc. Sử dụng tế bào này cho biến nạp, nếu chưa dùng ngay thì bổ sung glycerol 70% theo tỷ lệ 2 CaCl2: 1 glycerol 70% rồi đặt vào tủ âm 80 để dùng dần.
Biến nạp plasmid vào E. coli: Đưa tế bào khả biến từ -80oC ra xốp đá. Để tan từ từ (trong khoảng 20 phút). Cho 40 µl tế bào khả biến và 3 µl dung dịch sau phản ứng nối