Đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên wtSEB được khuếch đại từ DNA tổng số của S. aureus bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEB-F và SEB-R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho kết quả là một băng vạch đặc hiệu,
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 43
rõ nét và không có vạch phụ kèm theo, có kích thước khoảng 534 bp phù hợp với tính toán lý thuyết của cặp mồi thiết kế (Hình 3.2). Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch, xử lý đầu bằng, gắn vào vector pJET1.2/blunt bằng enzym ligase T4 để hình thành plasmid tái tổ hợp pJET/seb và biến nạp vào chủng khả biến E. Coli DH5α. Các khuẩn lạc được nuôi cấy và tách DNA plasmid để cắt kiểm tra bằng hai enzym hạn chế
EcoRI và HindIII để chắc chắn vector mang đoạn gen đích. Kết quả kiểm tra sơ bộ các plasmid tách từ các thể biến nạp cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp đều có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng (Hình 3.3). Điều đó chứng tỏ các dòng plasmid này đã có gen ngoại lai gắn vào. Khi cắt các dòng plasmid tái tổ hợp bằng hai enzym trên đều cho một băng DNA tương ứng với kích thước của gen seb (khoảng 534 bp) và một băng tương ứng với kích thước của vector pJET1.2 (khoảng 3000 bp) (Hình 3.4). Như vậy, gen seb đã được nhân dòng thành công trong vector pJET1.2.
1 2 3
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen seb từ DNA tổng số của S. aureus
M. Thang chuẩn DNA 1 kb 1, 2: Sản phẩm PCR gen seb
Hình 3.3. Điện di đồ plasmid mang gen seb
được tách chiết từ thể biến nạp 1: plasmid pJET1.2/blunt
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 44