Tương tự như 2 thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành tiêm cho lô 4, 7 với liều tiêm 10xLD50. Kết quả cho thấy ở liều tiêm 10xLD50 (= 25 µg/g) của dung dịch wtSEB khi phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g thì 100% số chuột chết sau tiêm (lô 4) (hình 3.21) và không xuất hiện chuột chết ở lô 7 khi tiêm Actinomycin D liều 0,5 µg/g phối hợp với dung dịch mtSEB ở liều tiêm 10xLD50 (= 25 µg/g).
Bảng 3.5. So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB ở liều tiêm10xLD50
Lô chuột thí nghiệm Số chuột chết/tổng số chuột Số chuột chết
(%)
Lô 4 (tiêm ActD và M2 = 10xLD50) 10/10 100
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 62
Hình 3.21. Kết quả tiêm chuột ở lô 4 với liều tiêm 10xLD50 sau 7 ngày theo dõi Như vậy, sau 7 lô thử nghiệm kết quả đánh giá độc tính của protein SEB như sau: Protein tái tổ hợp mtSEB có độc tính thấp không gây chết động vật thí nghiệm ở cả 3 liều tiêm (1xLD50; 3xLD50 và 10xLD50) khi được dùng phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g trọng lượng cơ thể trong khi protein wtSEB có độc tính cao gây chết 50% số chuột thí nghiệm ở liều tiêm 1xLD50 và gây chết 100% số chuột thí nghiệm ở liều 3xLD50 và 10xLD50 khi được dùng phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g trọng lượng cơ thể.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 63
KẾT LUẬN
1. Nhân dòng và xác định được trình tự của gen seb tự nhiên có kích thước khoảng 534 bp từ chủng S. aureus phân lập ở Việt Nam.
2. Tạo được gen seb đột biến điểm ở 04 vị trí bộ ba mã hóa lần lượt là 12, 32, 105 và 121 để thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine trên gen seb tự nhiên. 3. Thiết kế và biểu hiện thành công mtSEB với vector pET22b(+) trong E. coli
BL21. Với nhiệt độ là 37oC, nồng độ IPTG là 0,5 mM và thời gian cảm ứng là 5 giờ là các điều kiện để tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein mtSEB.
4. Tinh sạch thành công protein mtSEB sử dụng cột Ni – NTA với nồng độ trung bình 1 mg/ml. Protein mtSEB tái tổ hợp đã phản ứng đặc hiệu với kháng thể đa dòng thông qua kỹ thuật Western blot.
5. Độc tố của protein mtSEB không gây chết chuột ở mức liều tương đương 10xLD50 (25 µg/g) trong khi protein wtSEB có độc tính cao gây chết 50% số chuột thí nghiệm ở liều tiêm 1xLD50 (2,5 µg/g) và gây chết 100% số chuột thí nghiệm ở liều 3xLD50 (7,5 µg/g) và 10xLD50 (25 µg/g).
KIẾN NGHỊ
Tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB và đánh giá hiệu giá và tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009) Dược điển học Việt Nam. Xuất bản lần 4, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn, Bùi Thị Kim Dung (2005) Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật trên một số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán tại các chợ ở Tp.Hồ Chí Minh trong 3 năm 2002-2004. Trung tâm y tế dự phòng Tp.Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm. <http://www.vfa.gov.vn/Default.aspx>]
3. Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Kiều Nương (2003) Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2002.Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Thành phố Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm.
4. Trần Linh Thước (2002) Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nxb Giáo dục. 230 trang.
5. Phan Hữu Tôn (2010) Giáo trình sinh học phân tử. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 179 trang. <http://www.textbookofbacteriology.net/staph.html>ư
Tiếng nƣớc ngoài
6. Agrawal R, Singh PK, Sharma SK, Kamboj DV, Goel AK, Singh L (2012) Highly expressed recombinant SEB for antibody production and development of immunodetection system. Indian J Microbiol 52: 191–196.
7. Arcuri EF, Angelo FF, MartinsGuimar˜ aEsetal MF (2010) Toxigenic status of
Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk and Minas frescal cheese in Brazil. J Food Prot 73(12): 2225–2231.
8. Balaban N, Rasooly A (2000) Staphylococcal enterotoxins. Int J Food Microbiol 61: 1-10.
9. Barber MA (1914) Milk poisoning due to a type of Staphylococcus albusoccurring in the udder of a healthy cow. Philipp J Sci 9: 515–519.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 65
10.Barik S (1993) Site-directed mutagenesis by double polymerase chain reaction.
Methods Mol Biol 15: 277-286.
11.Bayles KW, Iandolo JJ (1989) Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal enterotoxin D.J Bacteriol 171(9): 4799-806.
12.Bennett SD, Walsh KA, Gould LH (2013) Foodborne disease outbreaks caused by Bacillus cereus, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus - United States, 1998–2008. Clin Infect Dis 57: 425–433.
13.Bergdoll MS (1989) Staphylococcus aureus. In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed). Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA: 463-523.
14.Betley MJ, Mekalanos JJ (1988) Nucleotide sequence of the type A staphylococcal enterotoxin gene. J Bacteriol 170(1): 34-41.
15.Bohach GA, Schlievert PM (1987) Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins. Mol Gen Genet
209(1): 15-20.
16.Bohach GA, Schlievert PM (1989) Conservation of the biologically active portions of staphylococcal enterotoxins C1 and C2. Infect Immun 57(7): 2249- 2252.
17.CAST (1994) Foodborne Pathogens: Risks and Consequences. Task Force Report No. 122.
18.Chaibenjawong P, Foster SJ (2011) Desiccation tolerance in Staphylococcus aureus. Arch Microbiol 193(2): 125–135.
19.Chen JY, Qiao Y, Komisar JL, Baze WB, Hsu IC, Tseng J (1994) Increased susceptibility to staphylococcal enterotoxin B intoxication in mice primed with actinomycin D. Infect Immun 62(10): 4626-4631.
20.Chiang YC, Chang LT, Lin CW, Yang CY, Tsen HY (2006) PCR primers for the detection of staphylococcal enterotoxins K, L, and M and survey of
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 66
staphylococcal enterotoxin types in Staphylococcus aureus isolates from food poisoning cases in Taiwan. J Food Prot 69(5): 1072-1079.
21.Chiang YC, Liao WW, Fan CM, Pai WY, Chiou CS, Tsen HY (2008) PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan.Int J Food Microbiol 121(1): 66-73.
22.Coffman JD, Zhu J, Roach JM, Bavari S, Ulrich RG, Giardina SL (2002) Production and purification of a recombinant Staphylococcal enterotoxin B vaccine candidate expressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif 24 (2): 302 – 312.
23.Collins CH, Patricia ML, Grange JM (1995) Staphylococcus and Micococcus. Collines and Lyne’s Microbiological Methods: 353-359.
24.Couch JL, Betley MJ (1989) Nucleotide sequence of the type C3 staphylococcal enterotoxin gene suggests that intergenic recombination causes antigenic variation. J Bacteriol 171(8): 4507-10.
25.Couch JL, Soltis MT, Betley MJ (1988) Cloning and nucleotide sequence of the type E staphylococcal enterotoxin gene. J Bacteriol 170(7): 2954-60.
26.Dack GM, Cary WE, Woolpert O, Wiggers H (1930) An outbreak of food poisoning proved to be due to a yellow hemolytic staphylococcus. J Prev Med
4: 167–175.
27.De Buyser ML, Dufour B, Maire M, Lafarge V (2001) Implication of milk and milk products in food-borne diseases in France and in different industrialized countries. Int J Food Microbiol 67: 1–17.
28.Denys J (1894) Pre´sence de Staphylocoque dans une viande qui a de´termine ´ des cas d’empoisonnement. Bull Acad R Med Belg 8: 496.
29.Do Carmo LS, Dias RS, Linardi VR, Sena MJ, Santos DA, Faria E, Pena EC, Jett M, Heneine LG (2002) Food poisoning due to enterotoxigenic strains
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 67
Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiol 19(1): 9-14.
30.Genigeorgic CA (1989). Present state of knowledge on staphylococcal intoxication. Int J Food Microbiol 9: 327-360.
31.Gleason BA (2011) CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B.
http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview
32.Haeghebaert S, Le QF, Gallay A, Bouvet P, Gomez M, Vaillant V (2002) Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000. Bull Epidémiol Hebdo 23:105-109.
33.Hanson BM, Dressler AE, Harper AL, R. P. Scheibel RP, S. E. Wardyn SE, L. K. Roberts LK, J. S. Kroeger JS, T. C. Smith TC (2011) Prevalence of
Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) on retail meat in Iowa. Journal of Infection and Public Health 4(4): 169–174.
34.Haran KP, Godden SM, Boxrud D, Jawahir S, Bender JB, Sreevatsan S (2012) Prevalence and characterization of Staphylococcus aureus, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus, isolated from bulk tank milk from Minnesota dairy farms. J Clin Microbiol 50(3): 688–695.
35.Henghold WB (2004) Other biologic toxin bioweapons: ricin, staphylococcal enterotoxin B, and trichothecene mycotoxins, 2nd. Dermatol Clin 22(3): 257- 262.
36.Hennekinne JA, De Buyser ML, Dragacci S (2012) Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev 36: 815–836.
37.Hovde CJ, Hackett SP, and G.A. Bohach GA (1990) Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C3 gene: sequence comparison of all three type C staphylococcal enterotoxins. Mol Gen Genet 220(2): 329-33.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 68
38.Jablonski LM, Bohach GA (1997) Staphylococcus aureus. Food Microbiology Fundamentals and Frontiers (Doyle MP, Beuchat LR & Montville TJ, eds). American Society for Microbiology Press, Washington, DC: 353–357.
39.Jackson CR, Davis JA, Barrett JB (2013) Prevalence and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from retail meat and humans in Georgia. J ClinMicrobiol 51: 1199–1207.
40.Jones CL, Khan SA (1986) Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus. J Bacteriol 166(1): 29–33.
41.Jordan EO, Burrows W (1934) Further observations on staphylococcus food poisoning. Am J Hyg 20: 604.
42.Ju J, Kheterpal I, Scherer JR, Ruan C, Fuller CW, Glazer AN, Mathies RA (1995) Design and synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA sequencing and analysis. Anal Biochem
231(1): 131-140.
43.Kappler J, Kotzin B, Herron L, Gelfand EW, Bigler RD, Boylston A, Carrel S, Posnett DN, Choi Y, Marrack P (1989) Vβ specific stimulation of human T cells by toxins. Science 244: 811–813.
44.Kijek TM, Rossi CA, Moss D, Parker RW, Henchal EA (2000) Rapid and
sensitive Immunomagnetic-electrochemiluminescent detection of
Staphyloccocal Enterotoxin B. J Immunol Methods 236(1-2): 9–17.
45.King KD, Anderson GP, Bullock KE, Regina MJ, Saaski EW, Ligler FS (1999) Detecting Staphylococcal Enterotoxin B using an automated fiber optic biosensor. Biosens Bioelectron 14(2):163–170.
46.Korolev S, Pinelis D, Savransky V, Komisar J, Vogel P, Fegeding K (2003) Toxicity of the Staphylococcal Enterotoxin B Mutants with Histidine-to- tyrosine Substitutions. Toxicology 187(2-3): 229–238.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 69
47.Kusumaningrum HD, Van Putten MM, Rombouts FM, Beumer RR (2002) Effects of antibacterial dishwashing liquid on foodborne pathogens and competitive microorganisms in kitchen sponges. J Food Protect 65(1): 61–65. 48.Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
49.Leggiadro RJ (2000) The threat of biological terrorism: a public health and infection control reality. Infect Control Hosp Epidemiol 21(1): 53-56.
50.Ler SG, Lee FK, Gopalakrishnakone P (2006). Trends in detection of warfare agents. Detection methods for ricin, staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin. J Chromatogr A 1133(1-2): 1-12.
51.Letertre C, Perelle S, Dilasser F, Fach P (2003) Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus. J Appl Microbiol 95(1): 38-43.
52.Li H, Llera A, Tsuchiya D, Leder L, Ysern X, Schlievert PM, Karjalainen K, Mariuzza RA (1998) Three-dimensional structure of the complex between a T cell receptor beta chain and the superantigen staphylococcal enterotoxin B. Immunity 9(6): 807-816.
53.Loir YL, Baron F, Gautier M (2003) Staphylococcus aureus and food poisoning. Genet and Mol Res 2: 63-76.
54.Marrack P, Blackman M, Burgert HG, McCormack JM, Cambier J, Finkel TH, Kappler J (1989) T-cell repertoire and thymus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54: 105-110.
55.Marrack P, McCormack J, Kappler J (1989) Presentation of antigen, foreign major histocompatibility complex proteins and self by thymus cortical epithelium.Nature 338(6215): 503-505.
56.Martin MC, Fueyo JM, Gonzalez-Hevia MA, Mendoza MC (2004) Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 70
aureus from three food poisoning outbreaks. Int J Food Microbiol 94(3): 279- 286.
57.Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV (1999) Food-Related Illness and Death in the United States. Emerg Infecti Dis 5(5): 607-625.
58.Minor TE, Marth EH (1972) Staphylococcus aureus and staphylococcal food intoxications. A review. IV. Staphylococci in meat, bakery and other foods. J Milk Food Technol 35: 228–241.
59.Monaco M, Pedroni P, Sanchini A, Bonomini A, Indelicato A, Pantosti A (2013) Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus
responsible for human colonization and infection in an area of Italy with high density of pig farming.BMC Infect Dis 13(1): 258.
60.Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51: 263-273.
61.Munson SH, Tremaine MT, Betley MJ, Welch RA(1998) Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from
Staphylococcus aureus. Infect Immun 66(7): 3337-3348.
62.Murphy BP, O’Mahony E, Buckley JF, O’Brien S, Fanning S (2010) Characterization of Staphylococcus aureus isolated from dairy animals in ireland. Zoonoses Public Hlth 57(4): 249–257.
63.Neder VE, Canavesio VR, Cal vinho LF (2011) Presence of enterotoxigenic
Staphylococcus aureus in bulk tank milk from Argentine dairy farms. Rev Argent Microbiol 43(2): 104–106.
64.Normanno G, Firinu A, Virgilio S, Mula G, Dambrosio A, Poggiu A, Decastelli L, Mioni R, Scuota S, Bolzoni G, Di Giannatale E, Salinetti AP, La Salandra G, Bartoli M, Zuccon F, Pirino T, Sias S, Parisi A, Quaglia NC, Celano GV (2004)
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 71
Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. Int J Food Microbiol 98: 73-79.
65.O’Brien AM, Hanson BM, Farina SA, Wu JY, Simmering JE, Wardyn SE, Kulick M, Wallinga DB, Smith TC (2012) MRSA in conventional and alternative retail pork products. PLoS ONE 7(1):e30092.
66.Omoe K, Ishikawa M, Shimoda Y, Hu DL, Ueda S, Shinagawa K (2002) Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates Harboring seg, seh, or sei genes. J Clin Microbiol 40(3): 857-62.
67.Papageorgiou AC, Acharya KR (2000) Microbial superantigens: from structure to function. Trends Microbiol 8(8): 369-375.
68.Papageorgiou AC, Tranter HS, Acharya KR (1998) Crystal structure of microbial superantigen staphylococcal enterotoxin B at 1.5 A resolution: implications for superantigen recognition by MHC class II molecules and T-cell receptors.J Mol Biol 277(1): 61-79
69.Peles F, Wagner M, Varga L, Hein I, Rieck P, Gutser K, Keresztúri P, Kardos G, Turcsányi I, Béri B, Szabó A (2007) Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from Bovine Milk in Hungary. Int J Food Microbiol 118 (2): 186-193.
70.Pu S, Han F, Ge B (2009) Isolation and characterization of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus strains from louisiana retail meats. Appl Environ Microb
75(1): 265–267.
71.Rose WC, Bradley SG (1971) Enhanced toxicity for mice of combinations of antibiotics with Escherichia coli cells or Salmonella typhosa endotoxin. Infect. Immun 4(5): 550-555.
72.Rosec JP, Gigaud O (2002) Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. Int J Food Microbiol 35: 61-70.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 72
73.Rusnak JM, Kortepeter M, Ulrich R, Poli M, Boudreau E (2004) Laboratory Exposures to Staphylococcal Enterotoxin B. Emerg Infect Dis 10: 1544-1549. 74.Sande MK, McKillip JL (2002) Virulence and recovery of Staphylococcus
aureus to the food industry using improvement on traditional approaches. Food control 15: 5-10.
75.Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74 (12): 5463-5467.
76.Savransky V, Pinelis D, Korolev S, Ionin B, Fegeding K (2004) Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice.Toxicon 43(4): 433-438.
77.Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones JL, Griffin PM (2011) Foodborne illness acquired in the United States- major pathogens. Diseases 17(1): 7–15.
78.Scherrer D, Corti S, Muehlherr JE, Zweifel C, Stephan R (2004) Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk- tank milk samples of goats and sheep. Vet Microbiol 101(2): 101–107.
79.Schmitt M, Schuler-Schmid U, Scmidt-Lorenz W (1990) Temperature limits off growth, Tnase, and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strain isolated from food. Int J Food Mcrobiol 11: 1-19.
80.Sedmak JJ, Grossberg SE (1977) A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250. Anal Biochem (79): 544-552. 81.Shih YP, Kung WM, Chen JC, Yeh CH, Wang AHJ, Wang TF (2002) High-
throughput screening of soluble recombinant proteins. Protein Sci Publ Protein Soc 11: 1714–1719.
82.Shin CS, Hong MS, Bae CS, Lee J (1997) Enhanced production of human mini- proinsulin in fed-batch cultures at hight cell density of Escherichia coli BL21 (DE3) [pET-3aT2M2]. Biotechnol Prog 13: 249-257.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 73
83.Stelma GN, Bergdoll MS (1982) Inactivation of staphylococcal enterotoxin A by chemical modification. Biochem Biophys Res Commun 105(1): 121-126.