Nguyên lý:
Tạo đột biến điểm định hướng theo phương pháp Mega-primer là một phương pháp truyền thống trong tạo đột biến điểm bằng kỹ thuật PCR. Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên các cặp mồi được thiết kế có chứa các vị trị cần tạo đột biến. Sản phẩm DNA mang đột biến sẽ được nhân lên trong các phản ứng PCR.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 32
Để tạo gen SEB mang đột biến điểm bằng phản ứng PCR, các cặp mồi được thiết kế phải chứa trình tự nucleotide cần thay đổi đó. Trên đoạn gen seb cần tạo 4 đột biến điểm tại các codon 12, 32, 105 và 121 làm biến đổi amino acid histidine thành tyrosine, theo đó tại 4 condon này các nucleotide mã hóa cho histidine cần được biến đổi thành các nucleotide mã hóa cho tyrosine và được viết như sau: CAC(12)TAC, CAT(32)TAT, CAT(105)TAT, CAT(121)TAT tương ứng với sự thay thế His12Tyr, His32Tyr, His105Tyr, His121Tyr (H12Y, H32Y, H105Y, H121Y). Đoạn gen seb đột biến được tạo ra bằng cách thay đổi lần lượt từ 1 đến 4 vị trí của Histidine thành Tyrosine. Từng điểm đột biến được tạo ra trên gen phải thực hiện 2 phản ứng PCR kế tiếp nhau (Barik, 1993). Phản ứng PCR lần 1 được tiến hành với các thành phần như sau: 10-100 ng DNA plasmid khuôn; 50 pmol mồi xuôi; 50 pmol mồi đột biến; 10 μl dNTPs dung dịch gốc để đạt nồng độ cuối là 0,2 mM; 2,5 U Pfu DNA polymerase; 10 μl đệm PCR 10X, bổ sung nước khử ion để tổng thể tích phản ứng đạt 100 μl. Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như sau: 94oC trong 3 phút; 30 đến 35 chu kỳ (94oC: 1 phút; 55oC: 2 phút; 72oC: 1 phút); 72oC: 7 phút. Sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm PCR lần 1. Tiếp tục thực hiện hiện phản ứng PCR lần 2 như sau: Chuẩn bị 100 μl phản ứng gồm đệm PCR 10X (10 μl); 2 mM dNTPs; DNA khuôn (1-2 μg); 20-30 pmol mồi megaprimer; mồi ngược (0,2-0,4 μg); 2,5 U Pfu DNA polymerase; nước khử ion. Chu trình nhiệt cho PCR lần 2 tương tự như lần 1 nhưng nhiệt độ gắn mồi cao hơn. Sản phẩm PCR lần 2 được kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose. Sản phẩm PCR chứa các đột biến điểm được đưa vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào vector tách dòng E. coli DH5α.