Phương pháp phân lập và nuôi cấy
Phương pháp phân lập và nuôi cấy trên môi trường thích hợp và sử dụng các tính chất hoá sinh học để xác định chủng loại vi sinh chẳng hạn như huyết thanh học, hình thái học, nhuộm tiêu bản .... Đây là phương pháp thường sử dụng trong xét nghiệm đầu tiên và làm cơ sở cho các xét nghiệm tiếp theo.
Ưu điểm: Dựa trên tính chất sinh lý, sinh hóa, hình thái của vi khuẩn nên phương pháp nuôi cấy được coi là phương pháp chuẩn để phân lập, xác định vi sinh vật.
Nhược điểm: Phương pháp chỉ được thực hiện trong phòng thí nghiệm, đòi hỏi nhiều trang thiết bị, hóa chất và mất nhiều thời gian.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 18
Phương pháp PCR và Real- time PCR, Quick PCR dựa trên các đoạn DNA đặc hiệu của các chủng vi sinh vật. Đoạn DNA đặc trưng của tác nhân được nhân lên nhờ chu trình nhiệt và đoạn DNA được giới hạn bởi cặp mồi. Đây là phương pháp cho kết quả chính xác cao là cơ sở để kết luận xác định loại vi khuẩn. Trên cơ sở này một số hãng đã thiết kế thành các thiết bị PCR dã chiến có thể tiến hành tại hiện trường đề phục vụ công tác phát hiện tác nhân sinh học:
Ưu điểm: Phát hiện trực tiếp tác nhân gây bệnh, đây là một phương pháp chuẩn trong chẩn đoán có độ chính xác cao.
Nhược điểm: Đòi hỏi phải thao tác trong phòng thí nghiệm, cần nhiều thiết bị; Đòi hỏi người xét nghiệm phải có tay nghề và có chuyên môn vững vàng; Các hoá chất cho một mẫu thử đắt tiền; Tính cơ động và sự tiện lợi kém; Mất nhiều thời gian để phát hiện.
Các phương pháp chẩn đoán dựa trên nguyên tắc miễn dịch
Dựa trên nguyên lý phản ứng kháng nguyên – kháng thể, chẩn đoán mầm bệnh thông qua phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Thường dùng động vật để gây miễn dịch bằng kháng nguyên hoặc độc tố của vi sinh vật nhằm tạo ra kháng thể đặc hiệu. Để có chẩn đoán chính xác, kháng thể thu được phải có tính đặc hiệu chỉ với kháng nguyên của mầm bệnh. Tuy nhiên, khả năng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể còn phụ thuộc vào độ ổn định của kháng nguyên dưới tác động của các yếu tố như nhiệt độ, chất bảo quản, acid, muối hoặc các hoá chất khác có trong thực phẩm.
Các phương pháp xác định nội độc tố dựa trên phân loại huyết thanh với các kháng thể là một kỹ thuật hữu ích, nó như một công cụ dịch tễ học trong việc điều tra các bệnh truyền nhiễm khác nhau. Tuy nhiên, huyết thanh ít nhậy đối với lượng nhỏ các SE so với phương pháp dựa trên DNA, hơn nữa nó tương đối phức tạp, tốn nhiều thời gian và không thiết thực cho phát hiện và xác định một nhóm lớn các SE liên quan với các kháng nguyên tương đồng (King et al., 1999).
Phát hiện nội độc tố SE trên môi trường dịch nổi bằng phương pháp phân loại khuyếch tán miễn dịch, ngưng kết và ELISA thường tốn nhiều thời gian, phải thao tác trong phòng thí nghiệm, chi phí hoá chất xét nghiệm đắt và đòi hỏi cán bộ nghiên cứu
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 19
phải có trình độ chuyên môn cao và khéo về thao tác thí nghiệm. Sử dụng phương pháp ELISA phát hiện SEB trong phomat ở nồng độ thấp từ 0,1 đến 1 ng/ml nhưng quá trình phát hiện hoàn thành mất 3,5 giờ (Korolev et al., 2003).
- Kỹ thuật ELISA (Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay)
ELISA là kỹ thuật phân tích sử dụng enzym liên kết với kháng thể để nhận diện và liên kết kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn. Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được gắn vào đáy bản nhựa 96 giếng, chất cần phát hiện nằm trong mẫu thử được trộn lẫn cùng chất chuẩn có liên kết enzym. Khi cho hỗn hợp vào các giếng trên đĩa, giếng nào có chất cần phát hiện trong mẫu sẽ cạnh tranh với chất chuẩn làm cho giếng đó sau khi bắt màu sẽ nhạt hơn. So kết quả với giếng chuẩn chỉ có chất chuẩn sẽ biết được lượng chất cần phát hiện trong mẫu thử là bao nhiêu. ELISA được sử dụng nhiều trong chẩn đoán Y học, vi sinh vật học.
Ưu điểm: Phương pháp ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Nhược điểm: Phải thao tác trong phòng thí nghiệm, chi phí hoá chất xét nghiệm đắt và đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có trình độ chuyên môn, khéo về thao tác thí nghiệm và mất nhiều thời gian.
- Kỹ thuật Western Blot (immunoblot)
Western Blot là kỹ thuật có thể sử dụng để phát hiện các kháng nguyên protein đặc hiệu của vi khuẩn, qua đó có thể nhận dạng được chúng. Hỗn hợp protein trong màng tế bào được chạy điện di trên gel polyacrylamid để phân tách theo trọng lượng. Các protein sau khi phân tách bằng phương pháp điện di được điện chuyển sang màng lai có thể là màng PVDF, các protein được cố định trên màng. Sau khi các protein chuyển sang màng lai, màng được phủ bằng dung dịch blocking để khoá các gốc tự do. Sử dụng kháng thể thứ nhất để liên kết đặc hiệu với kháng nguyên trên màng lai sau đó, sử dụng kháng thể thứ 2 cộng hợp enzym cho lên màng lai để liên kết với kháng thể 1. Sau đó bổ sung cơ chất tương ứng với enzym, phản ứng màu xuất hiện và xác định được protein cần phát hiện.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 20
Nhược điểm: Đòi hỏi phải tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhiều thao tác và mất nhiều thời gian; Đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có chuyên môn về kỹ thuật phòng thí nghiệm; Giá thành chi phí về nguyên vật liệu và hoá chất đắt.
- Phương pháp phát hiện nhanh dạng que nhúng (lateral flow test strip)
Để phát hiện nhanh và khá chính xác các tác nhân sinh học cụ thể là vi khuẩn virus, bào tử vi khuẩn... ngay tại hiện trường cho kết quả trong vài phút hiện nay chủ yếu là các test nhanh trên cơ sở sắc kí miễn dịch (Immunochoromatography test hay lateral flow test strip). Đây cũng là dạng que thử được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán bệnh trong Y học, phát hiện các chất gây nghiện, dấu vết trong khoa học hình sự, phát hiện độc chất...
Que thử dạng sắc kí miễn dịch mà cơ sở là phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu của nó. Phản ứng được thực hiện trên màng mỏng theo kiểu sắc kí nên dạng que thử này được gọi là sắc kí miễn dịch. Trong đó kháng nguyên cần phát hiện là yếu tố đặc hiệu của vi khuẩn hay bào tử vi khuẩn. Kháng thể phát hiện (detector) thường là một kháng thể đơn dòng di động trên màng. Một kháng thể khác có thể là kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng cố định trên màng. Phản ứng kết hợp giữa phức hợp – kháng nguyên - kháng thể di động và kháng thể cố định trên màng để tạo thành vạch T (Test line) vạch C (control line) theo dạng “bánh mỳ kẹp” (Sandwich assay).
Kết quả là khi mẫu cần phát hiện có vi khuẩn, độc tố trên que thử sẽ xuất hiện hai vạch mầu đỏ gạch tại vị trí vạch kiểm tra (test line "T") và trên vạch đối chứng “C”, nếu không có trên que thử chỉ xuất hiện một vạch tại vùng “C”.
Ưu điểm của que thử sắc kí miễn dịch: Test có kết cấu gọn nhẹ chỉ dưới dạng một “que nhúng” cho kết quả nhanh (không quá 10 phút) với độ nhạy cỡ ng/ml và độ đặc hiệu cao.
Tính tiện lợi: Que thử miễn dịch áp dụng kiểm tra mẫu tại hiện trường, cách sử dụng rất dễ dàng với thao tác đơn giản, vận chuyển và bảo quản test dễ dàng.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 21
Phạm vi áp dụng: Que thử miễn dịch có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực, Y, Dược, khoa học hình sự, kiểm tra các chất gây nghiện…Đặc biệt là với công tác phát hiện các vi sinh vật độc hại trong phòng dịch và trong phòng chống khủng bố thì đây là một giải pháp lí tưởng.
Nhược điểm: Kết quả phân tích bằng test thử nhanh mang tính chất định tính có ý trong sàng lọc mẫu nhanh.
Ngoài ra, có một phương pháp miễn dịch khác sử dụng các hạt từ tính gắn kháng thể, các hạt này có nhiệm vụ gắn (bắt giữ) với tế bào và tập trung các tế bào từ mẫu thực phẩm. Các tế bào đã bị bắt giữ sau đó được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật, trong đó có kỹ thuật sử dụng các biosensor.