3.2.1. Tạo gen seb đột biến
Dựa trên các đặc tính giống nhau về mặt cấu trúc giữa amino acid histidine và tyrosine, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tạo đột biến thay thế các amino acid histidine tại các codon đầu tiên trong chuỗi polypeptide SEB bằng các amino acid tyrosine đã làm giảm hoàn toàn độc tố của SEB (non-toxic SEB protein) nhưng vẫn
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 46
giữ được tính đặc hiệu gắn kết trực tiếp vào các phân tử phức hợp tương mô nhóm II (MHC) (Korolev et al., 2003; Savransky et al., 2004). Từ vector tái tổ hợp mang đoạn gen seb tự nhiên (wtSEB) được dùng làm khuôn trong phản ứng khuếch đại tạo mega- primer. Theo tính toán lý thuyết sản phẩm tạo thành có kích thước lần lượt là 59 bp, 122 bp, 339 bp và 383 bp tương ứng với các mega-primer mang đột biến H12Y, H32Y, H105Y, H121Y. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Trên hình 3.6 là minh họa về quy trình tạo đột biến ở vị trí codon 12. Tạo đột biến tại các codon tiếp theo 32, 105 và 121 cũng được thực hiện tương tự như tại codon 12. Chúng tôi đã nhân được các đoạn mega-primer mang các trình tự đột biến đúng theo như tính toán lý thuyết. Trên hình 3.7A là kết quả điện di của hai trong số bốn các mega-primer được tạo ra sau phản ứng PCR lần 1. Các mega-primer này được tinh sạch và sử dụng làm mồi để khuếch đại đoạn gen seb hoàn chỉnh có kích thước khoảng 534 bp trong phản ứng PCR lần 2 và sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.7B). Kết quả điện di trên hình 3.7B cho thấy, sản phẩm PCR là một băng đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Điều đó chứng tỏ thành phần và chu trình nhiệt cho PCR tạo các đột biến là đặc hiệu với gen seb. Nhưng để chắc chắn rằng gen seb đột biến được tạo ra chứa chính xác bốn vị trí mã bộ ba cần thay đổi, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định trình tự gen seb đột biến này.
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 47
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %. A. Sản phẩm PCR lần 1; B. Sản phẩm PCR lần 2. 1, 2: Các mega-primer H32Y, H121Y; 3: Thang DNA chuẩn 100 bp; 4: Thang DNA chuẩn 1 kb; 5-8: Các dòng gen mang đột biến H12Y, H32Y, H105Y, H121Y.
3.2.2. Xác định trình tự gen seb đột biến
Gen seb sau khi tạo đột biến điểm tại 4 vị trí codon 12, 32, 105 và 121 bằng phản ứng PCR được tinh sạch và tách dòng vào vector pJET1.2/bunt. Chọn ra một số dòng khuẩn lạc mang gen đột biến đã được tách chiết và cắt kiểm tra bằng enzym hạn chế để đọc trình tự trên máy ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Trình tự gen
seb đột biến được phân tích, xử lý bằng phần mềm CLC Sequence Viewer, BioEdit và dịch mã thành trình tự amino acide để so sánh với trình tự amino acid ban đầu của dòng chưa đột biến (wtSEB). Kết quả tại vị trí codon số 12; 32; 105; 121 đã có sự thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine (Hình 3.8). Như vậy, chúng tôi đã tạo ra các dòng gen seb chứa các điểm đột biến tại các vị trí mong muốn.
Hình 3.8. Trình tự amino acid sai khác giữa dòng đột biến (mtSEB) và dòng chưa đột biến (wtSEB)
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 48
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen seb đột biến
3.3.1. Thiết kế vector pET22(b+) mang gen seb đột biến
Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen seb, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET22(b+) và vector tách dòng pJET1.2/bunt, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym cắt hạn chế là EcoRI và HindIII không có trong trình tự gen seb, vector pJET1.2/bunt và có trong vùng đa tách dòng vector pET22(b+). Chính vì vậy, khi thiết kế mồi cho PCR chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự của enzym EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen seb (đầu 5’và đầu 3’), nhằm nhân được đoạn gen seb có chứa trình tự của hai enzym này ở hai đầu. Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET22(b+) từ vị trí mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 amino acid histidine và kết thúc ở bộ ba kết thúc. Đầu tiên, gen seb được nhân dòng trong pJET1.2/blunt với cặp mồi SEB Exp-F và SEB Exp-R với mục đích tạo được protein tái tổ hợp hoàn chỉnh, không bị lẫn một số amino acid nằm trong vùng đa nối của vector pET22b(+). Tiếp theo, đoạn gen seb và vector biểu hiện pET22(b+) được cắt mở vòng bằng hai enzym EcoRI và HindIII để tạo đầu so le, sau đó được tinh sạch và ghép nối với nhau tạo vector tái tổ hợp pET22(b+) mang gen seb đột biến nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 rồi chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc và cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng hai enzym hạn chế.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp pET22b+/mtSEB. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1: Đối chứng âm; 2-4: Sản phẩm PCR trực tiếp của các dòng khuẩn lạc khác nhau mang gen seb đột biến
M 1 2 3 4 534 500 250 1000 bp
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 49
Kết quả PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR) với cặp mồi đặc hiệu của gen mtSEB (SEB Exp-F và SEB Exp-R) cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước khoảng 534 bp (Hình 3.9), kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết.
Tiếp tục kiểm tra các dòng có colony-PCR dương tính bằng phương pháp cắt plasmid bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII. Kết quả thu được trên hình 3.10 cho thấy ở các giếng 1, 2, 3 sản phẩm cắt phân thành 2 băng tương ứng với kích thước của vector pET22b(+) khoảng 5500 bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 534 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET22b(+)/mtSEB. Gen seb đột biến trong vector biểu hiện sẽ được giải trình tự để khẳng định lại gen đích.
3.3.2. Giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện
Để chắc chắn vector biểu hiện chúng tôi thiết kế mang đoạn gen seb đột biến, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen dòng khuẩn lạc số 1. Kết quả xác định trình tự gen seb đột biến từ khuẩn lạc dòng số 1 và sau khi được xử lý bằng phần mềm Bioedit được trình bày trong hình 3.11.
Hình 3.10. Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, HindIII. M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-3: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp của các dòng mang gen seb đột biến M 1 2 3 534 250 500 1000 ~5500 bp
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 50
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của wtSEB và mtSEB
Theo hình 3.11 chúng tôi đã tạo được các đột biến thay thế nucleotide C bằng T ở các bộ ba mã hóa cho histidine và tyrosine như theo lý thuyết. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa vào các thiết bị tự động cho kết quả rõ ràng. Như vậy, chúng tôi kết luận đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET22b(+) mang gen đột biến theo đúng mục đích. Plasmid thu từ khuẩn lạc dòng số 1 sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21 và tinh sạch protein mtSEB tinh sạch protein mtSEB
3.4.1. Biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E. coli BL21
Để biểu hiện gen trong E. coli, plasmid tái tổ hợp pET22b(+)/mtSEB được biến nạp vào E. coli BL21 và biểu hiện. Quy trình biểu hiện gen seb đột biến được tiến hành theo mô tả ở phần phương pháp. Protein tổng số thu được sau biểu hiện được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE. Theo tính toán lý thuyết, mtSEB được biểu hiện dưới dạng protein tái tổ hợp sẽ có khối lượng phân tử khoảng 22 kDa. Kết quả trên đường chạy có IPTG, hình 3.12 cho thấy, dòng tế bào tái tổ hợp mang gen seb tổng hợp một protein ngoại lai có khối lượng phân tử đúng theo tính toán lý thuyết. Đối với dòng đối chứng âm không được cảm ứng IPTG không biểu hiện được băng có kích thước như vậy. Để kiểm tra protein đang nghiên cứu ở dạng tan hay không tan, chúng
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 51
tôi tiến hành siêu âm trong đệm PBS, ly tâm thu pha dịch, pha cặn, sau đó tiến hành xử lý mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide. Kết quả là protein mtSEB được biểu hiện chủ yếu nằm ở pha không tan. Do vậy, chúng tôi tiến hành biểu hiện mtSEB ở các điều kiện khác nhau về nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu để cải thiện được tính tan của mtSEB và thu được lượng protein mtSEB tốt nhất.
Hình 3.12. Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 (DE3) sau 5 giờ cảm ứng Mr: Thang protein chuẩn của GE Healthcare
3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến
Sự tổng hợp protein trong tế bào chủ phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng, các chất dinh dưỡng… cho nên việc khảo sát các điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein đích là điều quan trọng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian nuôi cảm ứng để thu được lượng mtSEB tốt nhất để có thể tinh chế làm kháng nguyên tạo kháng thể đơn dòng, đa dòng.
Nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp bởi nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến tính ổn định của plasmid trong tế bào. Nhiệt độ càng cao thì khả năng đào thải plasmid của chủng càng lớn, đồng thời nhiệt độ còn làm cho mRNA dễ bị phá hủy (Shin et al., 1997). Để thu protein SEB với lượng lớn có hoạt tính mà không lẫn quá nhiều protein của bản thân E. coli, tăng hiệu
Ko có
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 52
quả quá trình tinh sạch protein sau này, chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 20o
C, 28oC và 37oC. Bởi lẽ, chúng tôi tiến hành tối ưu ở dải nhiệt độ thấp hơn 37oC vì 37oC là nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn E. coli nhưng protein mtSEB thu được ở dạng không tan; vì vậy, chúng tôi đã tiến hành tối ưu nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ thấp hơn (20o
C, 28oC) với mong muốn thu được các protein tái tổ hợp ở dạng tan tạo thuận lợi cho việc tinh sạch protein và để xem liệu ở nhiệt độ thấp hơn hiệu suất tổng hợp mtSEB có cao hơn không. Sau khi nuôi cảm ứng, tế bào được thu lại để kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp (Hình 3.13). Tại nhiệt độ 20o
C lượng protein mtSEB biểu hiện được ít hơn nhiều so với biểu hiện ở 28oC và 37oC thể hiện với băng protein mtSEB nhỏ và mảnh hơn. Cảm ứng ở 28oC sau 5 giờ, tế bào sinh trưởng khá ổn định thể hiện protein tổng số và mtSEB tăng dần. Khi cảm ứng ở 37oC, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của E. coli thì tế bào sinh trưởng mạnh và ổn định với giá trị OD600 = 0,67 lúc 0 giờ tăng lên 1,29 sau 5 giờ.
Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho sự biểu hiện protein ngoại lai của E. coli là 37oC. Tại nhiệt độ này tế bào giảm tổng hợp protein nội bào và ưu tiên tổng hợp lượng lớn mtSEB. Tuy nhiên, hầu hết mtSEB534 không được tìm thấy trong pha protein tan của tế bào. Thể vùi mtSEB được tổng hợp ở cả ba nhiệt độ chỉ tan tốt nhất trong đệm có chứa urea 5 M. Như vậy, nhiệt độ cảm ứng thấp đã không cải thiện được tính tan của protein mtSEB trong chủng biểu hiện E. coli BL21.
Hình 3.13.Protein tổng số từ chủng E. coli BL21 mang gen mã hóa mtSEB được nuôi cấy cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau. Mr: thang protein chuẩn của GE Healthcare
Ko có IPTG IPIG 20oC 28 oC 37 oC Mr kDa 76 52 31 38 24 22 17
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 53
Nồng độ chất cảm ứng IPTG
Protein ngoại lai được điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector pET22b(+). Promoter này được cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong môi trường nuôi cấy. Khi có mặt của chất cảm ứng IPTG, lac promoter hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 polymerase và chính T7 polymerase bám vào vị trí T7 promoter để khởi đầu quá trình sinh tổng hợp protein ngoại lai. Vì vậy, lượng chất cảm ứng được bổ sung vào môi trường không cần quá nhiều mà chỉ cần đủ để trung hòa chất ức chế (Shin et al., 1997). Nồng độ chất này ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein ngoại lai tế bào. Ngoài ra, ở nồng độ quá cao nó gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ quá thấp protein ngoại lai thường được tổng hợp kém. Theo khuyến cáo của hãng Novagen đối với hệ vector pET chứa T7 promoter thì nồng độ IPTG cuối cùng là 0,4 mM và hơn nữa IPTG là một hóa chất đắt tiền nên việc xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG cần bổ sung ở những nồng độ thấp mà hiệu quả biểu hiện của protein mtSEB cao sẽ tiết kiệm kinh phí. Do vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát IPTG ở những nồng độ sau: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,3 mM; 0,4 mM và 0,5 mM ở 37oC và thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. mtSEB biểu hiện ngay ở nồng độ IPTG 0,1 mM và hàm lượng mtSEB biểu hiện tăng dần theo nồng độ IPTG. Kết quả chạy điện di protein tổng số kiểm tra trên gel polyacrylamide 12% cho thấy, lượng protein mtSEB tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM (Hình 3.14). Do đó, chúng tôi chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM cho nghiên cứu tiếp theo.
kDa 76 52 38 31 24 17
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 54
Hình 3.14. Khả năng sinh tổng hợp mtSEB của chủng E. coli tái tổ hợp với nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau sau 5 giờ cảm ứng
Thời gian nuôi cấy cảm ứng
Thời gian cảm ứng cũng có liên quan chặt chẽ đến số lượng và chất lượng của protein tái tổ hợp được biểu hiện. Ngay sau khi bổ sung IPTG vào môi trường, protein tái tổ hợp bắt đầu được tổng hợp. Vì tế bào chỉ sinh trưởng đến một sinh khối nhất định và dừng lại nên lượng protein tái tổ hợp cũng chỉ đạt tối đa ở một thời điểm nhất định. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu từ 0 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM và nuôi cấy ở 37oC. Trong hình 3.15, băng protein của mtSEB biểu hiện rõ và đậm ngay sau 1 giờ cảm ứng và đậm dần sau 5 giờ cảm ứng với hàm lượng protein mtSEB thu được là 0,4 mg/10 ml lúc 1 giờ; 1 mg/10 ml lúc 2 giờ; 1,4 mg/10 ml lúc 3 giờ, 1,6 mg/10 ml lúc 4 giờ và 1,7 mg/ 10 ml sau 5 giờ cảm ứng. Trong khi lượng mtSEB tăng dần thì hàm lượng protein tổng