Trong quá trình tiến hành PCR, sai sót có thể xảy ra trong sản phẩm PCR, đặc biệt là sự biến đổi nucleotide trong thành phần gen seb. Mặc dù những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gen. Sự thay thế nucleotide không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotide dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, để kiểm tra gen seb đã được tách dòng chính xác là gen mong muốn, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen seb trong vector pJET1.2. Đoạn gen seb của chủng S. aureus nghiên cứu đã được xác định trình tự nucletide trên máy đọc tự động ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi có trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với những kết quả đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc và so sánh trình tự được trình bày ở hình 3.5 và bảng 3.1.
1 ccagatgagt tgcacaaagc gagtaaattc actggtttga tggaaaatat gaaagttttg 61 tatgatgata atcatgtatc agcaataaac gttaaatcta tagatcaatt tctatacttt 121 gacttaatat attctattaa ggacactaag ttagggaatt atgataatgt tcgagtcgaa 181 tttaaaaaca aagatttagc tgataaatac aaagataaat acgtagatgt gtttggagct 241 aattattact atcaatgtta tttttctaaa aaaacgaatg atattaattc acatcaaact 301 gacaaacgaa aaacttgtat gtatggtggt gtaactgagc ataatggaaa ccaattagat 361 aaatatagaa gtattactgt tcgggtattt gaagatggta aaaatttatt atcttttgac 421 gtacaaacta ataagaaaaa agtgactgct caagaattag attacctaac tcgtcactat 481 ttggtgaaaa ataaaaaact ctatgaattt aacaactcgc cttatgaaac ggga
Hình 3.5. Trình tự gen seb của chủng S. aureus
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/seb
bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII M: Thang chuẩn DNA 1 kb
1, 2: Sản phẩm cắt pJET1.2/seb bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 45
Bảng 3.1. Độ tương đồng của gen seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)
TT Tên trình tự gen tƣơng đồng với gen seb Mã số trên
NCBI
Tỉ lệ tƣơng đồng (%)
1 Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity
island, strain: IVM10 AB716349.1 100%
2 Staphylococcus aureus strain F136 enterotoxin
B precursor (seb) gene, partial cds DQ997828.1 100%
3 Staphylococcus aureus partial seb gene for
staphylococcal enterotoxin B precursor (SEB) AM158256.1 100%
4 Staphylococcus aureus strain 339E enterotoxin
seb variant gene, partial cds AY196689.1 100%
5
Staphylococcus aureus DNA, pathogenicity island SaPITokyo12413, complete sequence, strain: Tokyo12413
AB860415.1 99%
6 Staphylococcus aureus strain 2395 USA500,
complete genome CP007499.1 99%
Kết quả giải trình tự gen seb trong vector tách dòng pJET1.2 cho thấy, gen seb
chứa khoảng 534 nucleotide và tương đồng 100% với gen seb mã số DQ997830.1, AM158256.1, AB716349.1 trên ngân hàng gen quốc tế; tương đồng 99% với gen seb
mã số AB860416.1, CP003166 và nhiều mã số khác trên ngân hàng gen quốc tế. Như vậy, các dòng tế bào E. coli DH5α đã mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa cho kháng nguyên SEB. Gen seb tự nhiên được sử dụng để tạo đột biến điểm trên gen nhằm tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp không độc.