SEB là một siêu kháng nguyên tác động kích thích viêm và tăng tiết cytokine ở tất cả các mô, cơ quan. SEB gây độc cho đường tiêu hoá, đường hô hấp, các vết thương thậm chí có thể xâm nhập qua da lành, trong tấn công sinh học nó có thể được phân tán vào thức ăn, nguồn nước hoặc dạng khí phun trong không khí. SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus
(Jones, Khan, 1986). Như vậy, làm thế nào để chúng ta có phát hiện và phòng ngừa các bệnh do độc tố này. Theo các nghiên cứu trên thế giới, có nhiều phương pháp làm giảm hay mất hoàn toàn độc tố của SEB nhằm phục vụ cho nghiên cứu biểu hiện SEB hay xa hơn nữa là nghiên cứu sản xuất vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm do SEB gây nên.
Năm 1997, Woody và cộng sự đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc. Theo đó, khi thử nghiệm 10 µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm. Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB. Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽ thúc đấy phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột. Huyết thanh lấy từ những con
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 22
chuột được tiêm chủng có hiệu quả ngăn chặn độc tố SEB gây ra tế bào T trong ống nghiệm. Chuột thí nghiệm dùng kháng huyết thanh sống sót sau khi tiêm độc tố từ 1, 2, hoặc 4 giờ, trong khi các kháng huyết thanh không còn tác dụng khi dùng 6 hoặc 8 giờ sau khi tiêm độc tố. Những nghiên cứu này cho thấy protein SEB đột biến N23K và F44S làm giảm độc lực, nhưng vẫn giữ lại các vị trí epitope đặc hiệu (Woody et al.,
1997).
Năm 2002, Coffman và cộng sự thử nghiệm thành công trên mô hình chuột với vaccine độc tố tụ cầu SEB tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli, gây ra những đáp ứng miễn dịch ở chuột và bảo vệ chuột ở mức độc tố < 0,6 EU/mg (Coffman et al., 2002).
Swaminathan và cộng sự (1992) đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ khả năng miễn dịch của phân tử (Swaminathan et al., 1992). Năm 1994, Thibodeau đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm 14 amino acid nằm trong vùng từ amino acid 113 – 126 (rãnh α4). 14 amino acid này nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 amino acid có 11 amino acid là giống nhau với mọi SEs. Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine (H32, H121, và H166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào (Thibodeau et al., 1994). Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidine trong cấu trúc protein SEB. Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carbonxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng (Stelma, Bergdoll, 1982). Vì tyrosine có cấu trúc gần giống histidine nên thay thế histidine tích điện dương bằng tyrosine ưa nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm trên. Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev và cộng sự đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các amino acid histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121) (Korolev et al., 2003). Các protein là sản phẩm của gen seb mang bốn đột biến đã được biểu hiện và tinh sạch, sau đó được kiểm tra khả năng gắn kết với HLA-DR4 ở người cũng như khả năng phân bào trong
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 23
nuôi cấy tế bào lách của chuột. Kết quả này đã khẳng định sản phẩm protein của gen
seb đột biến đã được loại bỏ hoàn toàn độc tố của SEB nguyên thủy, và đây cũng là nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa sự nhiễm độc tố ruột nhóm B của tụ cầu vàng (Korolev et al., 2003). Thêm vào đó, năm 2004 tác giả Savransky đã đưa ra kết luận protein SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105 và 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu (Savransky et al., 2004). Dựa trên những cơ sở khoa học đó, chúng tôi đã tiến hành tạo đột biến điểm thay thế Histidine thành Tyrosine tại bốn vị trí 12, 32, 105 và 121 trên đoạn gen seb tự nhiên có chiều dài 534 nucleotide thay vì đoạn gen mã hóa cho protein SEB có chiều dài khoảng 720 nucleotide đã được Korolev, Savransky và nhiều tác giả trên thế giới đã công bố. Các nghiên cứu này được tiến hành trên các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau, trình tự gen seb đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) với các chủng khác nhau như PM36 (accession number: AB479118), ATCC14458 (accession number: AY518386), COL (accession number: CP000046), DQ997830…. Sau khi tiến hành thu thập các trình tự gen seb quan tâm trên ngân hàng gen quốc tế (www.ncbi.nlm.nih.gov) và phân tích trình tự gen bằng phần mềm CLC Sequence Viewer để xác định khung đọc mở (ORF) và các bộ ba mã hóa cho histidine (CAC, CAT) thuộc trung tâm hoạt động của SEB. Từ trình tự protein thuộc khung đọc mở, chúng tôi nhận thấy có 3 đoạn gen seb với các kích thước khác nhau lần lượt là 339 bp, 534 bp và 720 bp đều chứa bốn vị trí Histidine cần thay đổi; chúng tôi đã lựa chọn thiết kế mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen seb có kích thước 534 bp và các mồi tạo đột biến điểm trên đoạn gen này. Bởi lẽ, gen seb (534 bp) thỏa mãn cả hai điều kiện là giữ nguyên vị trí epitop (tức là đảm bảo phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, cấu hình không gian) và cũng chứa đầy đủ bốn vị trí Histidine quan tâm.