Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan dendrobium và cymbidium

Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan dendrobium và cymbidium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG

ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA HAI GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ CYMBIDIUM

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Thành Phố Hồ Chí Minh - 09 / 2005 -

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè Nay tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 Cha và Mẹ đã suốt đời tận tụy vì con để có được ngày hôm nay

 Các Thầy – Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 TS TRẦN THỊ DUNG, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 KS NGUYỄN THỊ THU HẰNG, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Xin gởi lời cảm ơn đến toàn thể tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Đề tài được tiến hành từ ngày 15/03/2005 đến ngày 15/06/2005, tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

Đối tượng nghiên cứu:

- Là 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium Đây là những giống lan được trồng

nhiều ở Việt Nam và đem lại lợi nhuận kinh tế cao

Mục đích nghiên cứu:

- Sử dụng các chất kích thích sinh trưởng BA, TDZ, NAA ở các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm xác định tỉ lệ thích hợp nhất để đạt được

kết quả nhân giống in vitro cao trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium

Phương pháp nghiên cứu:

- Trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm được bố trí theo kiểu

hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan 3

2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam 3

2.1.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới 3

2.1.1.2 Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam 3

2.1.2 Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium 5

2.1.2.1 Phân loại 5

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.2.3 Điều kiện sinh thái 6

2.1.3 Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 7

2.1.3.1 Phân loại 7

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái 7

2.1.3.3 Điều kiện sinh thái 8

2.2 Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 11

2.2.1 Giao phấn 11

2.2.2 Phương pháp chiết tách 11

2.2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro .11

2.2.3.1 Lịch sử 11

2.2.3.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 12

2.2.3.3 Tiến trình nhân giống in vitro 14

2.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 14

2.2.3.5 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô 15

2.3 Vai trò các chất điều hòa sinh trưởng 16

2.3.1 Auxin 16

2.3.1.1 Lịch sử phát hiện ra auxin 16

2.3.1.2 Giới thiệu về NAA 17

2.3.1.3 Vai trò của auxins 17

2.3.2 Cytokinin 18

2.3.2.1 Lịch sử phát hiện ra cytokinin 18

2.3.2.2 Giới thiệu về BA 18

2.3.2.3 Giới thiệu về TDZ 19

2.3.2.4 Vai trò của cytokinin 19

2.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium 19

2.4.1 Giống lan Cymbidium 19

2.4.2 Giống lan Dendrobium 20

2.5 Giới thiệu về phôi soma và protocorm 21

2.5.1 Giới thiệu về phôi soma 21

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.2 Phương pháp 25

3.2.1 Bố trí thí nghiệm 25

3.2.1.1 Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium 25

3.2.1.2 Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium 27

3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi 28

3.3.2.1 Sau 60 ngày nuôi cấy 28

3.3.2.2 Sau 90 ngày nuôi cấy 29

3.2.4 Phân tích thống kê 29

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Giống lan Cymbidium 30

4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium 30

4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của TDZ và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của lan Cymbidium 35

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,

tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Cymbidium

sau 60 ngày nuôi cấy in vitro 30

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển

của chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 33

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,

tạo protocorm và hình thành chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi

cấy in vitro 35

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển

chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 38

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,

tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Dendrobium

sau 60 ngày nuôi cấy in vitro 40

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển

chồi lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 43

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,

tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Dendrobium

sau 60 ngày nuôi cấy in vitro 46

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến sự sinh trưởng và phát triển

chồi lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 49

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang

Biểu đồ 4.1: So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi

giữa các môi trường nuôi cấy trên giống lan Cymbidium 51

Biểu đồ 4.2: So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi

giữa các môi trường nuôi cấy trên giống lan Dendrobium 51

Biểu đồ 4.3: So sánh khả năng hình thành phôi soma giữa 2 giống lan

Dendrobium và Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro 52

Biểu đồ 4.4: So sánh khả năng hình thành protocorm giữa 2 giống lan

Dendrobium và Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro 53 Biểu đồ 4.5: So sánh khả năng hình thành chồi giữa 2 giống lan Dendrobium và

Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 53 Biểu đồ 4.6: So sánh sự phát triển chiều cao giữa 2 giống lan Dendrobium và

Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro 54

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang

Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidium và Dendrobium thực hiện trong đề tài 8

Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium 9

Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium 10

Hình 2.4: Các loại phôi soma 21

Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium 22

Hình 2.6: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium 23

Hình 4.1: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA 32

Hình 4.2: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA và NAA 32

Hình 4.3: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA 34

Hình 4.4: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA và NAA 34

Hình 4.5: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung TDZ 37

Hình 4.6: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung TDZ và NAA 37

Hình 4.7: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung TDZ 39

Hình 4.8: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung TDZ và NAA 39

Hình 4.9: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA 42

Hình 4.10: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung BA và NAA 43

Hình 4.11: Cây lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung BA 44

Hình 4.12: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung BA và NAA 45

Hình 4.13: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung TDZ 48

Hình 4.14: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung TDZ và NAA 48

Hình 4.15: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung TDZ 50

Hình 4.16: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro

trên môi trường có bổ sung TDZ và NAA 50

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA 6-benzylaminopurine NAA - naphthaleneacetic acid MS Murashige và Skoog (1962)

TDZ 1 - phenyl 1 - 3 - (1,2,3 - thiadiazol - 5 - yl) - urea ABA Acid Abscisic

DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid GA3 Gibberellin

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay hoa kiểng không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu xa đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường, do đó quan tâm phát triển hoa kiểng là vấn đề cần thiết Bên cạnh đó lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng nên chúng được sản xuất khá phổ biến

Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng Các nước có truyền thống sản xuất hoa lan như Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan , hàng năm thu được hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan Ở Việt Nam hoa lan là một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao

Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có đủ điều kiện thuận lợi cho cây lan phát triển như: ẩm độ, nhiệt độ, cường độ ánh sáng…., đặc

biệt là thích hợp đối với các nhóm lan: Dendrobium, Cymbidium, Oncidium,… .Nên

vừa qua sở Nông nghiệp-Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức hội thảo về hiện trạng và hướng phát triển hoa lan trên địa bàn, nhằm đưa cây hoa lan thành cây chủ lực trong cơ cấu nông nghiệp của thành phố (ĐCSVN, 27/6/2005)

Việc sản xuất hoa lan ở nước ta hiện nay chỉ mới đáp ứng được nhu cầu thấp chủ yếu phải nhập từ các nước khác như: Thái Lan, Đài Loan….Trước tình hình trên và cũng nhằm đưa tiến bộ của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào vào công tác giống, góp

phần phát triển nghề trồng lan trên qui mô rộng, việc ứng dụng nhân giống in vitro

trên cây lan là điều cần thiết hiện nay ở nước ta Do đó chúng tôi thực hiện đề tài:

"Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai

giống lan Dendrobium và Cymbidium"

1.2 Mục đích nghiên cứu

Mục đích của đề tài là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để đạt được kết

quả nhân giống in vitro cao nhất trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan

2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam 2.1.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới

Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao:

Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis,…

- Thái Lan là nước xuất khẩu lan đứng đầu thế giới, chủ yếu là lan

Dendrobium, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá 1 - 3 USD / cành, có khi

8 - 10 USD / cành, những giống quý có thể lên đến hàng trăm USD

Ngày nay, bằng nhiều kỹ thuật khác nhau người ta đã tạo ra được nhiều giống

lan mới như: Dendrobium ayaka, Dendrobium edians beauty, Dendrobium sungould

(Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004)

2.1.1.2 Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam

- Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng loại Tham gia sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh hoặc100% vốn đầu tư nước ngoài) Tuy nhiên sản xuất còn chưa được áp dụng khoa học kỹ thuật

nên mặc dù đa dạng nhưng không đạt về tiêu chuẩn, số lượng và chất lượng do đó tính cạnh tranh còn thấp

*Tại TP.HCM:

- Trong các chủng loại sản phẩm hoa kiểng, hoa lan xem là nhóm hoa có giá

trị kinh tế cao, trong đó lan cắt cành đem lại lợi nhuận khá cao (có thể đạt 500 triệu – 1 tỉ đồng / ha / năm) nhưng vốn đầu tư ban đầu vẫn còn cao

(600 – 800 triệu đồng / ha), chủ yếu là phần vốn đầu tư cho cây giống Trong đó nhóm

Mokara và Dendrobium được trồng nhiều nhất

- Theo Trung tâm Nghiên cứu khoa học kỹ thuật và khuyến nông TP.HCM, trong thời gian qua diện tích trồng hoa lan trong thành phố tăng nhanh, từ 20 ha năm 2003 lên 50 ha năm 2004 và khoảng 80 ha năm 2005

- Để đưa hoa lan trở thành một trong những cây chủ lực trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp trong những năm tới, TP.HCM đề ra mục tiêu phát triển diện tích trồng hoa lan lên 200 ha vào năm 2010 và một số giải pháp chính về giống, khoa học kỹ

thuật, thị trường tiêu thụ, đào tạo nguồn nhân lực, chính sách hỗ trợ (ĐCSVN, 27/6/2005)

*Tại Đà Lạt:

- Cây lan Cymbidium đã được nuôi trồng tại Đà Lạt từ rất lâu, chủ yếu để tiêu

khiển Tại đây, ngoài những loài tự nhiên, các biến chủng, còn có nhiều giống nhập nội nuôi trồng

- Từ năm 1977, sau khi thành lập tổ Hoa Lan Xuất Khẩu, phong trào trồng lan đã được phát triển mạnh

- Đến năm 1985, đã xuất khẩu được trên 15.000 cành hoa Cymbidium

- Hiện nay nhu cầu hoa lan đang tăng nhanh, trong khi đó mức độ phát triển còn hạn chế Đó là do chưa có những đầu tư nghiên cứu về đối tượng này như: vấn đề khoa học, chọn tạo giống và kỹ thuật nuôi trồng…do đó không thể hiểu rõ và đánh giá đúng đắn tiềm năng và triển vọng nguồn lợi này

- Xu hướng hiện nay đang tập trung vào các giống nhập nội, còn lại các loại lan nội địa ít được chú ý Mặc dù các loài biến chủng nội địa có giá trị rất cao, có thể đáp ứng được nhu cầu xuất khẩu Như vậy cơ sở để phát triển nghề trồng lan xuất khẩu vẫn phải chú trọng vào cây lan nội địa, nhất là chọn tạo giống mới từ cây lan nội (Trích Dương Ngọc Bích Quyên, 2002)

2.1.2 Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium

2.1.2.1 Phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, người ta đã xếp riêng

Cymbidium vào một chi (Otto Swartz, 1799) Trong khóa phân loại của

Lindley - Bentham - Brieger năm 1983, chi Cymbidium thuộc tông phụ Cymbidinae, tông Dendreae, phân họ Orchidoideae

Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dương, từ năm 1932, Henri Lecompte cho rằng chi này có 120 loài Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp lại và xác định có khoảng 60 loài

Theo những nhà phân loại học Việt Nam như Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi đã giới thiệu ở nước ta có khoảng 12 loài:

- Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội) - Cymbidium cyperifolium (thanh lan) - Cymbidium dayanum Reichb f (xích ngọc) - Cymbidium devonianum Paxt (gấm ngũ hồ) - Cymbidium eburneum Reichb (bạch lan) - Cymbidium ensifolium Swartz (mặc lan) - Cymbidium erythrostylum Lindl (bạch hồng) - Cymbidium giganteum Wall (hoàng lan) - Cymbidium insigne Rolfe (hồng lan) - Cymbidium lancifolium Hook f.

- Cymbidium polanei Gagn (tử cán) - Cymbidium munronianum King et plant

- Thân (căn hành): thường ngắn, nối những củ lan với nhau Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể

mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con Do đó người ta xếp

Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial)

- Củ lan (giả hành): thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1 cm đến 15 cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá

- Lá: thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành

- Chồi hoa: thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần

- Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luôn phiên theo đường xoắn ốc

- Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ

gọi là trục hợp nhụy, hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trên cùng, mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắp màu

trắng ngà dễ mở rời, cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên do hoa Cymbidium chỉ thụ

phấn được nhờ côn trùng

- Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt Khi chín, quả mở theo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới

2.1.2.3 Điều kiện sinh thái

Cymbidium có những tính chất rất đặc biệt: thời gian ra hoa dài (trung bình 12

tháng), khả năng phát triển rất mạnh, có hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng

Các loài Cymbidium sống trong môi trường mát cây cần nhiều ánh sáng trong

suốt thời gian trong năm, nhưng cây không chịu được ánh sáng trực xạ nên phải che bóng để giữ độ chiếu sáng thích hợp

Cymbidium cần nhiều nước trong mùa sinh trưởng, cần tưới nước nhẹ nhàng và

thường xuyên bón phân đầy đủ, từ lúc cây phát triển cũng như lúc ra hoa và phân chia các khóm giả hành

Về nhiệt độ: loài lan này sống trong môi trường lạnh nên có chế độ nhiệt rất đặc biệt: 150C vào mùa đông và 200C vào mùa hè, biên độ ngày và đêm từ 6 - 70C cần cho ra hoa Khi các giả hành phát triển, nhiệt độ về đêm phải từ 6 - 120C liên tục từ 3 - 4 tuần

Về ẩm độ: bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký sinh

(epiphyte) Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm nên phải tưới trong mọi thời gian trong năm, chỉ cho giá thể vừa kịp khô giữa hai lần tưới Ẩm độ thích hợp từ 60-70% (Trích Phan Thị Tuyết Hằng, 2005)

2.1.3 Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium

2.1.3.1 Phân loại

Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc

cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm

Việc phân loại phong lan khá phức tạp Theo truyền thống cổ điển các nhà

khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004)

Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau:

- Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi)

- Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng) - Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên)

- Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế)

- Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng) - Dendrobium (Hoàng thảo dẹt)

- Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá) - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng) - Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ) - Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu) - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung)

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái

- Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời

gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp

- Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình

múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống

- Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang và các gân lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng

- Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ hoa) Cột nhị nhụy ngắn

2.1.3.3 Điều kiện sinh thái

Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, người ta chia làm 2 hai nhóm

- Ánh sáng: có thể nói Dendrobium là loài ưa sáng (60 - 70%), có những loài

yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%

Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidium và Dendrobium thực hiện trong đề tài

Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium

Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium

2.2 Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 2.2.1 Giao phấn

Như đã nói, giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với hầu hết các loài lan Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lượng chủng loại rất phong phú Đó cũng là phương thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ưu thế hơn cả của họ thực vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng

Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ

- Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn

2.2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro

2.2.3.1 Lịch sử

- Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

- Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm Tuy ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã

phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Ornithogalum,

Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông dùng các

tế bào mất khả năng tái sinh)

- Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ của một cây hoà thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose Tuy nhiên sự sinh truởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả chuyển qua môi trường mới

- Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian

dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối

khoáng và glucose và nước chiết nấm men Sau đó cũng chính White chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Đồng thời trong thời gian này, R.J Gautheret (ở Pháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên không vượt quá 8 tháng

- Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn

Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote )

- Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp đươc công bố

2.2.3.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro

*Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Khi các mẫu cấy là chồi được giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách lá

Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba … Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trường mới

Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho bất kỳ cây cây trồng sản xuất chồi nách bình thường và phản ứng với cytokinin như: BAP, Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee)

*Nhân giống bằng chồi đỉnh

Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm – 0.5 mm) thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việc phát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm – 2 mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983)

Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết hợp với cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền

*Nhân giống bằng chồi bất định

Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường Một số các nguyên liệu nuôi cấy gồm: lá, vẩy, cuống lá ……

Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị

*Nhân giống qua nuôi cấy callus

Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan

hay phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp Nuôi

cấy callus và tế bào đơn cho tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh

*Nhân giống bằng các đoạn giả hành

Chọn những cây lan in vitro từ 5-6 tháng tuổi, sau đó cắt giả hành thành những

đoạn có chiều dài khoảng 5mm và đem nuôi cấy trên những môi trường có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng

*Nuôi cấy hạt lai:

Khi đã dự đoán kết quả của một phép lai, người ta mạnh dạn nhân giống hỗn hợp giữa vô tính và hữu tính để rút ngắn thời gian và tạo một số lượng cây giống lớn

Đơn giản hơn, người ta có thể tạo ra những giống mới nhờ việc nhân cấy đỉnh sinh trưởng và tạo ra những điều kiện để gây ra những thay đổi đặc điểm di truyền của các tế bào cơ thể bình thường (đột biến soma) như: các dạng đột biến sinh lý, đa bội

Trong việc nhân giống vô tính, nhược điểm lớn nhất là cây mẹ có thể bị nhiễm các dạng bệnh virus Nếu không được tuyển chọn và kiểm tra kỹ lưỡng sẽ cho ra đời hàng loạt cây con có chứa mầm bệnh

2.2.3.3 Tiến trình nhân giống in vitro

Gồm các giai đoạn sau:

*Giai đoạn 1: Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng

Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần, mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng 1cm

*Giai đoạn 2: Nhân giống vô tính in vitro

Mẫu cấy được cắt chia ra và cây mầm được cấy chuyền vào môi trường mới Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào việc tiếp tục sản xuất chồi nách hoặc từ những khối giống như callus ở gốc chồi

*Giai đoạn 3: Chuyển cây ra vườn ươm

Cây con được tái sinh hoàn chỉnh chuẩn bị cho việc cấy trồng và môi trường

bên ngoài được thiết lập để thuần hoá cây in vitro

*Giai đoạn 4: trồng cây in vitro ngoài đồng ruộng

Cây con được tiếp tục nhân giống trên luống ươm và được cấy vào bầu đất rồi chuyển ra trồng trên đồng ruộng

2.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

*Sự lựa chọn mẫu cấy

Mẫu cấy phải cạnh tranh sinh lý để sống sót trong môi trường nuôi cấy sơ khởi và tạo phản ứng thích hợp Mẫu cấy còn non sẽ tái sinh tốt hơn mẫu già

Mẫu thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có tỉ lệ mô phân sinh hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng

*Môi trường nuôi cấy

Thông thường là môi trường Murashige & Skoog là thích hợp cho phần lớn các trường hợp Để hình thành chồi nách yêu cầu nồng độ thấp của auxin và cytokinin, để

phát khởi chồi bất định cần nồng độ cao của cytokinin và thêm một lượng auxin cân bằng Để sản xuất callus cần nồng độ cao của auxin kết hợp với nồng độ thấp cytokinin Ngoài ra đối với vài loại cây trồng còn bổ sung GA3 ngoại sinh 0.1mg/l cho

sự phát triển bình thường và nhân giống in vitro

Sự lựa chọn môi trường agar hay môi trường lỏng là cần thiết, agar làm giá đỡ cho cây nhưng cây trồng khó hấp thu tốt các dưỡng chất

*Điều kiện nuôi cấy Ánh sáng

Mẫu cấy được đặt trên môi trường nuôi cấy là đường, đường đi vào quang tổng hợp cho cây trồng Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thu đóng vai trò trong quá trình tạo hình cây nuôi cấy mô

Thường nuôi cấy ở 2000-3000 lux là tốt nhất

Nhiệt độ

Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ Hầu hết nuôi cấy thích hợp ở nhiệt độ 20- 250C

Môi trường in vitro

Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy

có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây Một số vấn đề

thường gặp trong môi trường in vitro như: mức độ quang hợp thấp, không cân bằng

CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng thấp Vì vậy cây con in vitro

chậm phát triển

*Chất kích thích sinh trưởng

- Auxin - Cytokinin - Gibberellins - ABA

- Ethylen

2.2.3.5 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Nhân giống các loại cây cảnh là ứng dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô Hiện nay tất cả lan thương mại đều sản xuất bằng cách này Ngoài ra còn có:

Dương Xỉ, Cẩm Chướng (Sone, 1968), Cúc (Ever&Holt, 1974), Petunia (Stone, 1968) và Hồng (Hasegana, 1979)

Theo Bajai (1968) một số cây trồng sản xuất qua nuôi cấy mô đã được tiêu thụ trên thị trường với giá hành triệu dollas Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật bậc cao để cải thiện cây trồng bao gồm những ứng dụng:

- Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh - Tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến

- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn - Lai xa qua môi trường nuôi cấy phôi và noãn - Tạo dòng lai xa soma và lai tế bào trần (protoplast) - Cố định nitrogen

- Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp

- Bảo quản các nguồn gen (Trần Thị Dung, 2001)

2.3 Vai trò các chất điều hoà sinh trưởng

Những hoá chất có khả năng điều khiển được sinh trưởng và phát dục của cây trồng được gọi là chất kích thích sinh trưởng hay chất điều hòa sinh trưởng

Với một lượng cực kỳ nhỏ nhưng hiệu quả vô cùng to lớn trong các giai đoạn khác nhau như: sự phát sinh cơ thể, sự kích dục….Các chất điều hòa sinh trưởng là một trong những hoá chất không thể thiếu được trong đời sống thực vật mặc dù cho đến nay cơ chế tác dụng của nó vẫn chưa được lý giải rõ ràng

2.3.1 Auxin

2.3.1.1 Lịch sử phát hiện ra auxin

Năm 1880, Darwin phát hiện ra rằng bao lá mầm (coleoptyl) của cây họ lúa rất nhậy cảm với ánh sáng và ông cho rằng đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích của ánh sáng

Paal (1919) đã cắt đỉnh bao lá mầm và đặt trở lại trên chỗ cắt nhưng lệch qua một bên và để trong tối Hiện tượng uốn cong (hướng động) xảy ra như một trường hợp chiếu sáng một chiều Ông kết luận rằng đỉnh ngọn đã hình thành một chất kích

thích sinh trưởng nào đó và ánh sáng xác định sự phân bố của chất đó về hai phía của bao lá mầm

Went (1928) đã đặt đỉnh ngọn tách rời của bao lá mầm đó lên các bản agar để các chất sinh trưởng nào đấy khuyếch đại xuống agar, thì cũng gây ra hiện tượng sinh trưởng uốn cong như thí nghiệm của Paal Rõ ràng một chất sinh trưởng nào đấy được tổng hợp trong bao lá mầm và đã khuyếch tán xuống agar và gây ra sự sinh trưởng hướng động đó Went gọi chất đó là chất điều hòa sinh trưởng hiện nay là auxin

Năm 1934, Kogl và ctv đã tách một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt chất như chất sinh trưởng và Thimann (1935) cũng tách được chất này từ nấm Rhysopus Người ta gọi chất đó là - axit indolaxetic (AIA)

Tiếp đó Wightman (1977) đã phát hiện ra một hợp chất auxin là axit phenyaxetic (APA)

Ngày nay bằng con đường hoá học người ta đã tổng hợp được nhiều hợp chất auxin khác nhau bao gồm: IAA (Indolacetic acid), IBA (Indolbultyric acid), NAA (Napthtalene acetic acid), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000)

2.3.1.2 Giới thiệu về NAA

Tên khoa học: Naphthaleneacetic acid; Alphnaphthaleneacetic acid; naphthaleneacetic acid; Naphthalene acetic acid; NAA; NAA; Naphthalene-1-acetic acid; 1-Naphthalene acetic acid; 1-Naphthylacetic acid

a-Trọng lượng phân tử: 186.21 Công thức cấu tạo: C12H10O2.

2.3.1.3 Vai trò của auxins

- Kích thích sự giãn tế bào

- Kích thích tế bào phân chia (kết hợp với cytokinin) - Kích thích sự phân hoá của libe và mô gỗ

- Kích thích sự phát triển của rễ

- Auxin gây ra tính hướng động của cây - Ức chế sự lớn lên của chồi bên

- Trì hoãn sự hoá già của lá - Làm chậm sự chín của trái

- Kích thích sự lớn lên các phần của hoa

Năm 1941, Van Overbeek cấy phôi cà rốt Ratura trong một môi trường nuôi

phôi như nước dừa và có ảnh hưởng quan trọng để nuôi mô và tạo bướu

Năm 1954, Steward và Shantz phân tích được trong nước dừa một chất quan trọng là diphenylurea

Năm 1955, Skoog ghi nhận khi nuôi cấy mô thuốc lá và đã chứng tỏ rằng nước dừa có sự phân bào

Tiếp đó Miller (1959) đã chiết tách chất này Đây cũng là chất kích thích chủ yếu trong môi trường nuôi cấy mô ở lan

Ngày nay bằng con đường hoá học người ta đã tổng hợp nhiều loại cytokinin, cytokinin thường gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurine) Tuy nhiên hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ, chất điều hoà tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

2.3.2.2 Giới thiệu BA

Tên khoa học: benzyl-Adenine, N6-Benzyladenine, benzylaminopurine,

(phenylmethyl)-1H-purin-6-amine, Benzyladenine, Cytokinin B, Purin-6-amine, (phenylmethyl), Verdan senescence inhibitor, 6BA

N-Trọng lượng phân tử: 225.25 Công thức cấu tạo: C12H11N5

2.3.2.3 Giới thiệu về TDZ

Tên khoa học: 5-Phenylcarbamoylamino-1,2,3-thiadiazole,

Phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea, N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, Dropp Trọng lượng phân tử: 220.25

Công thức cấu tạo: C9H8N4OS

2.3.2.4 Vai trò của cytokinin

- Kích thích sự phân chia tế bào - Kích thích sự hình thành hoa

- Phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và một số cơ quan khác - Kích thích sự tăng cường tổng hợp ADN và ARN trong tế bào - Điều tiết quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào

2.4 Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và

Cymbidium

2.4.1 Giống lan Cymbidium

Cymbidium ở Việt Nam được trồng và nghiên cứu chủ yếu trên Đà Lạt, người

ta đã tạo ra hàng loạt loại Cymbidium lai khác nhau như: Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội), Cymbidium cyperifolium (thanh lan), Cymbidium dayanum

Reichb f (xích ngọc), …… và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao

Việc lai tạo giống không ngừng ở việc thụ phấn, gieo hạt đơn giản mà còn dùng

những kỹ thuật sinh học hiện đại để tạo ngiều giống đa bội Cymbidium cũng là chi

đầu tiên của hoa được áp dụng thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhân giống vô tính bằng giả hành, …

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro của lan

Cymbidium nhờ vào nuôi cấy các bộ phận như sau:

- Thân lan (Vij, S.P., K Kondo và ctv 1994) - Hạt lan (Nayak, N.R., Chand, P.K và ctv 1998) - Callus (Chang C và Chang WC 1998)

Theo Chang C và Chang WC (1998) đã nhân giống in vitro từ callus trên môi

trường có bổ sung 2,4-D, TDZ, BA kết quả cho thấy ngoài sự hình thành callus, chồi trên môi trường có bổ sung (2,4-D = 0; 3.3mg/l; 10mg/l) và (TDZ = 0; 0.1mg/l; 0.33mg/l) còn có sự phát sinh phôi soma trên môi trường có bổ sung (BA = 5.0mg/l hoặc TDZ = 1mg/l)

Tiếp theo đó, Huan, L.V.T và Tanaka, M (2004) đã nhân giống in vitro từ

protocorm trên môi trường có bổ sung NAA và TDZ

Những hướng nghiên cứu trên đã từng bước khẳng định vai trò quan trọng của

Cymbidium và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này

2.4.2 Giống lan Dendrobium

Trong quá trình nuôi cấy in vitro người ta thường bổ sung các chất điều hòa

sinh trưởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,… vào môi trường nuôi cấy

nhằm đạt được kết quả nhân giống in vitro cao Theo Nayak et al (1998), Vij et al

(1994), Sheelavantmath et al (2000), Lee et al (1999) đã tìm thấy ảnh hưởng lớn

trong quá trình nhân giống in vitro khi bổ sung kết hợp vào môi trường nuôi cấy BA và NAA Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy thân giả hành của giống lan Dendrobium

moschatum trên môi trường có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0,

0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) và kết quả thu được cao nhất tại môi trường có bổ sung BA = 3.0mg/l và NAA = 2.0mg/l là 8.4 protocorm

Năm 2003, Nasiruddin và ctv đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan

Dendrobium formosum trên môi trường có bổ sung (BA = 0; 1.25mg/l; 2.5mg/l;

5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l) kết quả thu được sau 60 ngày nuôi cấy tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l có số chồi cao nhất 2.68 Cũng vào

năm 2003 Talukder, Nasiruddin và ctv đã nuôi cấy từ chồi trên môi trường có bổ sung (BA = 0; 1mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.1mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l) sau 40 ngày nuôi cấy đã thu được số chồi cao nhất 1.9 tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA =

0.5mg/l Đây chỉ là vài bước khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này trên giống lan Dendrobium

2.5 Giới thiệu về phôi soma và protocorm

2.5.1 Giới thiệu về phôi soma 2.5.1.1 Khái niệm

Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng (thường là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào), bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ

2.5.1.2 Đặc điểm

Phôi soma thường là một tế bào đơn và dễ dàng được tách ra khỏi mẫu cấy để

tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh

2.5.1.3 Phân loại

Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp

- Phôi soma trực tiếp: Được hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mà không qua sự hình thành callus

- Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus

2.5.1.4 Các loại phôi

- Phôi hình cầu - Phôi hình tim - Phôi thủy lôi - Phôi lá mầm

Hình 2.4: Các loại phôi soma

Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Hình lá mầm

2.5.1.5 Vai trò

- Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực vật bằng bioreactor

- Tạo hạt nhân tạo

- Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật - Công nghệ nuôi cấy tế bào trần

Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium

2.5.2 Giới thiệu về protocorm 2.5.2.1 Khái niệm

Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và được phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần

2.5.2.2 Đặc điểm

Protocorm thường ở dạng hình cầu đường kính 1-2 mm, có màu xanh và dễ

dàng được tách ra để nhân giống in vitro

PHÔI CYMBIDIUMPHÔI DENDROBIUM

2.5.2.3 Vai trò

Protocorm chủ yếu đƣợc dùng để nhân giống in vitro để hình thành phôi soma,

protocorm và có thể còn đƣợc nhân giống để tạo thành cây con

Hình 2.6: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu cấy: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium

- Môi trường ½ MS: Tất cả các thí nghiệm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS là môi trường MS nhưng nồng độ của các chất khoáng đa lượng giảm đi một nửa (½) và có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng: NAA; BA; TDZ

Thành phần của môi trường MS (Murashige & Skoog , 1962)

- Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi

giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy

3.2.1.1 Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium

a) Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in

vitro của giống lan Cymbidium

b) Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in

vitro của giống lan Cymbidium

3.2.1.2 Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium

a) Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in

vitro của cây lan Dendrobium

b) Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in

vitro của giống lan Dendrobium

Quan sát số lượng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các

mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium:

a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy

d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi

3.3.2.2 Sau 90 ngày nuôi cấy

Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các mẫu cấy

a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi

d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi

3.2.4 Phân tích thống kê

Số liệu thu thập được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Microsoft Excel và chương trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA) để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để đánh giá kết quả thí nghiệm