Giới thiệu về phôi soma và protocorm

2.5.1. Giới thiệu về phôi soma

2.5.1.1. Khái niệm

Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dƣỡng (thƣờng là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào), bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ.

2.5.1.2. Đặc điểm

Phôi soma thƣờng là một tế bào đơn và dễ dàng đƣợc tách ra khỏi mẫu cấy để tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh.

2.5.1.3. Phân loại

Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp.

- Phôi soma trực tiếp: Đƣợc hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mà không qua sự hình thành callus.

- Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus.

2.5.1.4. Các loại phôi

- Phôi hình cầu. - Phôi hình tim. - Phôi thủy lôi. - Phôi lá mầm.

Hình 2.4: Các loại phôi soma.

2.5.1.5. Vai trò

- Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor.

- Tạo hạt nhân tạo.

- Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật. - Công nghệ nuôi cấy tế bào trần.

Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium.

2.5.2. Giới thiệu về protocorm 2.5.2.1. Khái niệm 2.5.2.1. Khái niệm

Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và đƣợc phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần.

2.5.2.2. Đặc điểm

Protocorm thƣờng ở dạng hình cầu đƣờng kính 1-2 mm, có màu xanh và dễ dàng đƣợc tách ra để nhân giống in vitro.

2.5.2.3. Vai trò

Protocorm chủ yếu đƣợc dùng để nhân giống in vitro để hình thành phôi soma, protocorm và có thể còn đƣợc nhân giống để tạo thành cây con.

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu cấy: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium

- Môi trƣờng ½ MS: Tất cả các thí nghiệm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS là môi trƣờng MS nhƣng nồng độ của các chất khoáng đa lƣợng giảm đi một nửa (½) và có bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng: NAA; BA; TDZ.

Thành phần của môi trƣờng MS (Murashige & Skoog , 1962).

Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ 1. Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l KH2PO4 170 mg/l MgSO4. 7H2O 370 mg/l CaCl2. 2H2O 440 mg/l 2. Khoáng vi lƣợng H3BO3 6.20 mg/l MnSO4. 4H2O 22.3 mg/l CoCl2. 6H2O 0.025 mg/l CuSO4. 5H2O 0.025 mg/l ZnSO4. 4H2O 8.60 mg/l Na2MoO4. 2H2O 0.25 mg/l KI 0.83 mg/l 3. Sắt – EDTA FeSO4. 7H2O 27.8 mg/l Na2EDTA. 2H2O 37.8 mg/l 4. Vitamin Myo-Inositol 100 mg/l Thiamin. HCl 0.10 mg/l Pyridoxin. HCl 0.50 mg/l Nicotinic acid 0.50 mg/l Glycin 2.00 mg/l

5. Các chất khác Đƣờng 30.0 mg/l

Agar 7.00 mg/l

6. pH môi trƣờng 5.6 – 5.8

* Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ 15/3/2005 – 15/6/2005.

- Địa điểm: tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm.TPHCM.

3.2. Phƣơng pháp3.2.1. Bố trí thí nghiệm 3.2.1. Bố trí thí nghiệm

- Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy.

3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium.

a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium.

- Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297.

b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium.

- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243.

3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium.

a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium.

b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Dendrobium.

3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy.

Quan sát số lƣợng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium:

a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy. b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy. c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy .

3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy.

Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các mẫu cấy.

a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy. b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi. c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi.

d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi.

3.2.4. Phân tích thống kê.

Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Microsoft Excel và chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA) để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để đánh giá kết quả thí nghiệm.

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Giống lan Cymbidium

4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. vitro của giống lan Cymbidium.

Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng sử dụng BA, hoặc kết hợp giữa nồng độ BA cao và nồng độ thấp NAA để tăng hiệu quả nhân giống in vitro (khả năng phát sinh phôi soma, protocorm và chồi).

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây Cymbidium in vitro sau 60 ngày nuôi cấy

Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm)

½ MS 0 A 2.22 A 1.56 A 2.17 D ½ MS+1mg/l BA 0 A 3.00 AB 1.78 ABC 1.90 CD ½ MS+3mg/l BA 0 A 3.67 BC 2.33 C 1.85 CD ½ MS+5mg/l BA 3.44 C 4.33 CD 2.22 BC 1.50 BC ½ MS+7mg/l BA 3.89 C 5.11 D 1.44 A 0.97 A ½ MS+10mg/l BA 4.89 D 6.22 E 1.33 A 0.83 A ½ MS+1mg/l BA+0.5mg/l NAA 1.67 B 3.56 BC 1.56 A 1.06 AB ½ MS+3mg/l BA+0.5mg/l NAA 3.56 C 4.44 CD 1.78 ABC 0.99 A ½ MS+5mg/l BA+0.5 mg/l NAA 3.78 C 4.67 D 1.67 AB 0.83 A ½ MS+7mg/l BA+0.5mg/l NAA 4.22 CD 6.11 E 1.78 ABC 0.78 A ½ MS+10mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.11 D 6.78 E 1.89 ABC 0.77 A

CV% 1.81% 1.1% 1.92% 1.97%

*Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.

Nhận xét:

Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau:

*Số lƣợng phôi soma:

Dựa vào bảng 4.1 cho thấy có sự ảnh hƣởng giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên quá trình phát sinh phôi soma. Những môi trƣờng ½ MS; ½ MS + 1mg/l BA; ½ MS + 3mg/l BA không thấy sự phát sinh phôi soma, do ở những môi trƣờng nuôi cấy này nồng độ BA thấp chƣa kích thích sự phân chia tế bào mạnh để phát sinh phôi. Còn ở những môi trƣờng nuôi cấy có nồng độ BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) có sự phát sinh phôi soma.

Ngoài ra, khi kết hợp giữa BA và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy thì khả năng phát sinh phôi soma cao hơn khi sử dụng BA. Môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA số phôi phát sinh là 3.89, còn ở môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA thì khả năng phát sinh phôi là 4.22, môi trƣờng có BA = 10mg/l là 4.89 còn ở môi trƣờng kết hợp giữa BA= 10mg/l + NAA= 0.5mg/l là 5.11. Qua đó chứng tỏ NAA có vai trò trong quá trình phát sinh phôi soma.

Nhƣ vậy BA và NAA có ảnh hƣởng lớn đến quá trình phát sinh phôi soma trong nhân giống in vitro.

*Số lƣợng protocorm:

Trong nhân giống in vitro ngoài việc phát sinh phôi soma còn có sự tạo protocorm. Quan sát số lƣợng protocorm ở bảng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy có sự khác biệt nhau.

Sau 60 ngày nuôi cấy, số protocorm hình thành phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy, ở môi trƣờng ½ MS số protocorm (2.22) và số protocorm tăng lên ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ BA cao (BA = 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l). Ngoài ra khi kết hợp giữa BA và NAA thì số protocorm tăng cao hơn khi sử dụng BA.

Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy ở những môi trƣờng ½ MS + 10mg/l BA; ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA và ½ MS + 10mg/l BA +

0.5mg/l có số protocorm hình thành cao nhất và khác biệt so với các môi trƣờng khác.

*Số lƣợng chồi:

Sau 60 ngày nuôi cấy, bên cạnh sự phát sinh phôi soma và tạo protocorm còn có sự hình thành chồi. Tuy nhiên khả năng hình thành chồi không cao và không thấy

có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức lên sự hình thành chồi khi bổ sung nồng độ BA và NAA càng tăng.

Nhƣ vậy ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy in vitro thì BA và NAA không ảnh hƣởng lớn đến quá trình hình thành chồi.

*Chiều cao chồi:

Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy không có ảnh hƣởng đến sự phát triển chiều cao chồi.

Ở môi trƣờng đối chứng (½ MS) và môi trƣờng có bổ sung BA thấp (BA = 1mg/l, BA = 3mg/l) có chiều cao chồi cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao chồi thấp ở những nồng độ có bổ sung BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) là do ở các môi trƣờng này chủ yếu là tạo protocorm và phát sinh phôi soma nên ức chế sự phát triển của chồi.

Hình 4.1: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA.

Hình 4.2: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA.

Trong nhân giống in vitro, sau 60 ngày nuôi cấy khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm đƣợc biểu hiện rõ, nhƣng sau 90 ngày nuôi cấy các phôi soma và protocorm đều phát triển thành chồi, tuy còn một số protocorm và phôi soma chƣa hình thành chồi (ở số lƣợng ít). Đo đó sau 90 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi.

Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro

Nghiệm thức Số chồi Số lá Số rễ Chiều cao / mẫu cấy / chồi / chồi chồi (cm)

½ MS 2.11 A 2.11 AB 1.99 2.97 E ½ MS + 1mg/l BA 3.00 AB 2.50 BC 0 2.33 BCD ½ MS + 3mg/l BA 3.22 AB 2.08 A 0 1.98 ABC ½ MS + 5mg/l BA 4.56 CD 2.14 AB 0 1.82 AB ½ MS + 7mg/l BA 5.33 DEF 2.04 A 0 1.83 ABC ½ MS + 10mg/l BA 6.11 EF 2.11 AB 0 1.83 ABC ½ MS+1mg/l BA+0.5mg/l NAA 2.78 AB 2.62 C 0 2.85 DE ½ MS+3mg/l BA+0.5mg/l NAA 3.83 BC 2.60 C 0 2.36 CD ½ MS+5mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.00 CDE

2.03 A 0 2.17 BC ½ MS+7mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.78 DEF

2.04 A 0 2.03 ABC ½ MS+10mg/l BA+0.5mg/l NAA 6.44 F

2.00 C 0 1.63 A

CV% 1.62% 1% 2.34% 1.32%

*Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.

Nhận xét: *Số lƣợng chồi:

Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.2 cho thấy có sự ảnh hƣởng của các môi trƣờng nuôi cấy lên sự hình thành chồi lan in vitro.

Ở các nghiệm thức 6 (½ MS + 10mg/l BA) và 11 (½ MS +10mg/l +0.5mg/l NAA) cho thấy số chồi hình thành cao nhất và có sự khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Ngoài ra ở những môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA luôn cho thấy số chồi hình thành cao hơn so với môi trƣờng chỉ có BA. Nhƣ vậy BA và NAA có ảnh hƣởng lớn đến sự hình thành chồi trong nhân giống in vitro.

*Số lƣợng lá, rễ và chiều cao chồi:

- Số lá: Số lá hình thành không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức, số lá không tăng khi nồng độ BA và NAA tăng.

- Số rễ: Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thấy chỉ ở môi trƣờng đối chứng (½ MS) là có sự hình thành rễ. Chứng tỏ tại các nồng độ BA và NAA của thí nghiệm không ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ.

- Chiều cao chồi: Bảng 4.2 cho thấy các môi trƣờng ½ MS và ½ MS + 1mg/l BA + 0.5mg/l NAA có chiều cao chồi cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại.

Hình 4.3: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA

Hình 4.4: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA.

4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA lên quá trình nuôi cấy

in vitro của giống lan Cymbidium

TDZ là chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin có khả năng kích thích sự tạo chồi rất mạnh, do đó trong nuôi cấy in vitro ngoài BA ngƣời ta thƣờng sử dụng TDZ hoặc TDZ kết hợp NAA để tăng khả năng nhân giống in vitro (phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi).

Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro.

Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm)

½ MS 0 A 1.67 A 1.67 AB 2.33 D ½ MS+0.05mg/l TDZ 0 A 3.56 BC 2.78 C 2.44 D ½ MS+0.1mg/l TDZ 0 A 4.22 BC 2.56 BC 1.64 C ½ MS+0.5mg/l TDZ 4.22 C 6.11 DE 2.56 BC 1.44 BC ½ MS+1 mg/l TDZ 5.56 D 6.78 E 1.67 AB 0.69 A ½ MS+0.05mg/l TDZ+0.5mg/l NAA 2.22 B 3.44 B 2.89 C 1.39 BC ½ MS+0.1mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 3.78 C 4.89 CD 1.56 AB 1.25 ABC ½ MS+0.5mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 4.22 C 6.22 DE 1.33 A 1.08 ABC ½ MS+1mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 6.00 D 7.11 E 1.22 A 0.79 AB CV% 2% 1.78% 3.45% 2.95%

*Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.

Nhận xét:

Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau:

*Số lƣợng phôi soma:

Dựa vào bảng 4.3 cho thấy có sự khác biệt nhau giữa các yếu tố môi trƣờng đến sự phát sinh phôi soma.

TDZ là chất điều hoà sinh truởng thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính, tuy nhiên ở những môi trƣờng có bổ sung

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Lịch sử phát hiện ra cytokinin