Năm 1913, Haberlandt trích từ tế bào nhu mô cây cà, tế bào nhu mô khoai tây một chất có thể làm tăng sự phân chia tế bào nhu mô lõi.
Năm 1938, Bonner trích từ trái đậu một chất làm tăng trƣởng tế bào của trái này và đƣợc gọi là cytokinin.
Năm 1941, Van Overbeek cấy phôi cà rốt Ratura trong một môi trƣờng nuôi phôi nhƣ nƣớc dừa và có ảnh hƣởng quan trọng để nuôi mô và tạo bƣớu.
Năm 1954, Steward và Shantz phân tích đƣợc trong nƣớc dừa một chất quan trọng là diphenylurea.
Năm 1955, Skoog ghi nhận khi nuôi cấy mô thuốc lá và đã chứng tỏ rằng nƣớc dừa có sự phân bào.
Tiếp đó Miller (1959) đã chiết tách chất này. Đây cũng là chất kích thích chủ yếu trong môi trƣờng nuôi cấy mô ở lan.
Ngày nay bằng con đƣờng hoá học ngƣời ta đã tổng hợp nhiều loại cytokinin, cytokinin thƣờng gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurine). Tuy nhiên hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ, chất điều hoà tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin, có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
2.3.2.2. Giới thiệu BA
Tên khoa học: N-benzyl-Adenine, N6-Benzyladenine, benzylaminopurine, N- (phenylmethyl)-1H-purin-6-amine, Benzyladenine, Cytokinin B, Purin-6-amine, N- (phenylmethyl), Verdan senescence inhibitor, 6BA.
Trọng lƣợng phân tử: 225.25. Công thức cấu tạo: C12H11N5.
2.3.2.3. Giới thiệu về TDZ
Tên khoa học:5-Phenylcarbamoylamino-1,2,3-thiadiazole, Phenyl-3-(1,2,3- thiadiazol-5-yl)urea, N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, Dropp
Trọng lƣợng phân tử: 220.25. Công thức cấu tạo: C9H8N4OS.
2.3.2.4. Vai trò của cytokinin
- Kích thích sự phân chia tế bào. - Kích thích sự hình thành hoa.
- Phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và một số cơ quan khác. - Kích thích sự tăng cƣờng tổng hợp ADN và ARN trong tế bào. - Điều tiết quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào.
2.4.Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và
Cymbidium
2.4.1. Giống lan Cymbidium
Cymbidium ở Việt Nam đƣợc trồng và nghiên cứu chủ yếu trên Đà Lạt, ngƣời ta đã tạo ra hàng loạt loại Cymbidium lai khác nhau nhƣ: Cymbidium aloifolium
Swartz (lan lô hội), Cymbidium cyperifolium (thanh lan), Cymbidium dayanum
Reichb. f (xích ngọc), …… và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao.
Việc lai tạo giống không ngừng ở việc thụ phấn, gieo hạt đơn giản mà còn dùng những kỹ thuật sinh học hiện đại để tạo ngiều giống đa bội. Cymbidium cũng là chi
đầu tiên của hoa đƣợc áp dụng thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhân giống vô tính bằng giả hành, …..
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro của lan
Cymbidium nhờ vào nuôi cấy các bộ phận nhƣ sau: - Thân lan (Vij, S.P., K. Kondo và ctv 1994). - Hạt lan (Nayak, N.R., Chand, P.K. và ctv 1998). - Callus (Chang C và Chang WC 1998).
Theo Chang C và Chang WC (1998) đã nhân giống in vitro từ callus trên môi trƣờng có bổ sung 2,4-D, TDZ, BA kết quả cho thấy ngoài sự hình thành callus, chồi trên môi trƣờng có bổ sung (2,4-D = 0; 3.3mg/l; 10mg/l) và (TDZ = 0; 0.1mg/l; 0.33mg/l) còn có sự phát sinh phôi soma trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 5.0mg/l hoặc TDZ = 1mg/l).
Tiếp theo đó, Huan, L.V.T và Tanaka, M (2004) đã nhân giống in vitro từ protocorm trên môi trƣờng có bổ sung NAA và TDZ.
Những hƣớng nghiên cứu trên đã từng bƣớc khẳng định vai trò quan trọng của
Cymbidium và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này.
2.4.2. Giống lan Dendrobium
Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,…..vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao. Theo Nayak et al. (1998), Vij et al. (1994), Sheelavantmath et al. (2000), Lee et al. (1999) đã tìm thấy ảnh hƣởng lớn trong quá trình nhân giống in vitro khi bổ sung kết hợp vào môi trƣờng nuôi cấy BA và NAA. Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy thân giả hành của giống lan Dendrobium moschatum trên môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0, 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) và kết quả thu đƣợc cao nhất tại môi trƣờng có bổ sung BA = 3.0mg/l và NAA = 2.0mg/l là 8.4 protocorm.
Năm 2003, Nasiruddin và ctv đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan
Dendrobium formosum trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1.25mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l) kết quả thu đƣợc sau 60 ngày nuôi cấy tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l có số chồi cao nhất 2.68. Cũng vào
năm 2003 Talukder, Nasiruddin và ctv đã nuôi cấy từ chồi trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.1mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l) sau 40 ngày nuôi cấy đã thu đƣợc số chồi cao nhất 1.9 tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 0.5mg/l. Đây chỉ là vài bƣớc khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này trên giống lan Dendrobium.
2.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm 2.5.1. Giới thiệu về phôi soma 2.5.1. Giới thiệu về phôi soma
2.5.1.1. Khái niệm
Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dƣỡng (thƣờng là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào), bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ.
2.5.1.2. Đặc điểm
Phôi soma thƣờng là một tế bào đơn và dễ dàng đƣợc tách ra khỏi mẫu cấy để tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh.
2.5.1.3. Phân loại
Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp.
- Phôi soma trực tiếp: Đƣợc hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mà không qua sự hình thành callus.
- Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus.
2.5.1.4. Các loại phôi
- Phôi hình cầu. - Phôi hình tim. - Phôi thủy lôi. - Phôi lá mầm.
Hình 2.4: Các loại phôi soma.
2.5.1.5. Vai trò
- Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor.
- Tạo hạt nhân tạo.
- Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật. - Công nghệ nuôi cấy tế bào trần.
Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium.
2.5.2. Giới thiệu về protocorm 2.5.2.1. Khái niệm 2.5.2.1. Khái niệm
Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và đƣợc phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần.
2.5.2.2. Đặc điểm
Protocorm thƣờng ở dạng hình cầu đƣờng kính 1-2 mm, có màu xanh và dễ dàng đƣợc tách ra để nhân giống in vitro.
2.5.2.3. Vai trò
Protocorm chủ yếu đƣợc dùng để nhân giống in vitro để hình thành phôi soma, protocorm và có thể còn đƣợc nhân giống để tạo thành cây con.
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu cấy: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium
- Môi trƣờng ½ MS: Tất cả các thí nghiệm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS là môi trƣờng MS nhƣng nồng độ của các chất khoáng đa lƣợng giảm đi một nửa (½) và có bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng: NAA; BA; TDZ.
Thành phần của môi trƣờng MS (Murashige & Skoog , 1962).
Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ 1. Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l KH2PO4 170 mg/l MgSO4. 7H2O 370 mg/l CaCl2. 2H2O 440 mg/l 2. Khoáng vi lƣợng H3BO3 6.20 mg/l MnSO4. 4H2O 22.3 mg/l CoCl2. 6H2O 0.025 mg/l CuSO4. 5H2O 0.025 mg/l ZnSO4. 4H2O 8.60 mg/l Na2MoO4. 2H2O 0.25 mg/l KI 0.83 mg/l 3. Sắt – EDTA FeSO4. 7H2O 27.8 mg/l Na2EDTA. 2H2O 37.8 mg/l 4. Vitamin Myo-Inositol 100 mg/l Thiamin. HCl 0.10 mg/l Pyridoxin. HCl 0.50 mg/l Nicotinic acid 0.50 mg/l Glycin 2.00 mg/l
5. Các chất khác Đƣờng 30.0 mg/l
Agar 7.00 mg/l
6. pH môi trƣờng 5.6 – 5.8
* Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ 15/3/2005 – 15/6/2005.
- Địa điểm: tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm.TPHCM.
3.2. Phƣơng pháp3.2.1. Bố trí thí nghiệm 3.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy.
3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium.
a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium.
- Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297.
b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium.
- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243.
3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium.
a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium.
- Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297.
b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Dendrobium.
- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243.
3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy.
Quan sát số lƣợng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium:
a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy. b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy. c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy .
3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy.
Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các mẫu cấy.
a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy. b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi. c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi.
d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi.
3.2.4. Phân tích thống kê.
Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Microsoft Excel và chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA) để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để đánh giá kết quả thí nghiệm.
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Giống lan Cymbidium
4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. vitro của giống lan Cymbidium.
Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng sử dụng BA, hoặc kết hợp giữa nồng độ BA cao và nồng độ thấp NAA để tăng hiệu quả nhân giống in vitro (khả năng phát sinh phôi soma, protocorm và chồi).
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây Cymbidium in vitro sau 60 ngày nuôi cấy
Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm)
½ MS 0 A 2.22 A 1.56 A 2.17 D ½ MS+1mg/l BA 0 A 3.00 AB 1.78 ABC 1.90 CD ½ MS+3mg/l BA 0 A 3.67 BC 2.33 C 1.85 CD ½ MS+5mg/l BA 3.44 C 4.33 CD 2.22 BC 1.50 BC ½ MS+7mg/l BA 3.89 C 5.11 D 1.44 A 0.97 A ½ MS+10mg/l BA 4.89 D 6.22 E 1.33 A 0.83 A ½ MS+1mg/l BA+0.5mg/l NAA 1.67 B 3.56 BC 1.56 A 1.06 AB ½ MS+3mg/l BA+0.5mg/l NAA 3.56 C 4.44 CD 1.78 ABC 0.99 A ½ MS+5mg/l BA+0.5 mg/l NAA 3.78 C 4.67 D 1.67 AB 0.83 A ½ MS+7mg/l BA+0.5mg/l NAA 4.22 CD 6.11 E 1.78 ABC 0.78 A ½ MS+10mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.11 D 6.78 E 1.89 ABC 0.77 A
CV% 1.81% 1.1% 1.92% 1.97%
*Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét:
Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau:
*Số lƣợng phôi soma:
Dựa vào bảng 4.1 cho thấy có sự ảnh hƣởng giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên quá trình phát sinh phôi soma. Những môi trƣờng ½ MS; ½ MS + 1mg/l BA; ½ MS + 3mg/l BA không thấy sự phát sinh phôi soma, do ở những môi trƣờng nuôi cấy này nồng độ BA thấp chƣa kích thích sự phân chia tế bào mạnh để phát sinh phôi. Còn ở những môi trƣờng nuôi cấy có nồng độ BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) có sự phát sinh phôi soma.
Ngoài ra, khi kết hợp giữa BA và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy thì khả năng phát sinh phôi soma cao hơn khi sử dụng BA. Môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA số phôi phát sinh là 3.89, còn ở môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA thì khả năng phát sinh phôi là 4.22, môi trƣờng có BA = 10mg/l là 4.89 còn ở môi trƣờng kết hợp giữa BA= 10mg/l + NAA= 0.5mg/l là 5.11. Qua đó chứng tỏ NAA có vai trò trong quá trình phát sinh phôi soma.
Nhƣ vậy BA và NAA có ảnh hƣởng lớn đến quá trình phát sinh phôi soma trong nhân giống in vitro.
*Số lƣợng protocorm:
Trong nhân giống in vitro ngoài việc phát sinh phôi soma còn có sự tạo protocorm. Quan sát số lƣợng protocorm ở bảng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy có sự khác biệt nhau.
Sau 60 ngày nuôi cấy, số protocorm hình thành phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy, ở môi trƣờng ½ MS số protocorm (2.22) và số protocorm tăng lên ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ BA cao (BA = 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l). Ngoài ra khi kết hợp giữa BA và NAA thì số protocorm tăng cao hơn khi sử dụng BA.
Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy ở những môi trƣờng ½ MS + 10mg/l BA; ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA và ½ MS + 10mg/l BA +
0.5mg/l có số protocorm hình thành cao nhất và khác biệt so với các môi trƣờng khác.
*Số lƣợng chồi:
Sau 60 ngày nuôi cấy, bên cạnh sự phát sinh phôi soma và tạo protocorm còn có sự hình thành chồi. Tuy nhiên khả năng hình thành chồi không cao và không thấy
có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức lên sự hình thành chồi khi bổ sung nồng độ BA và NAA càng tăng.
Nhƣ vậy ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy in vitro thì BA và NAA không ảnh hƣởng lớn đến quá trình hình thành chồi.
*Chiều cao chồi:
Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy không có ảnh hƣởng đến sự phát triển chiều cao chồi.
Ở môi trƣờng đối chứng (½ MS) và môi trƣờng có bổ sung BA thấp (BA = 1mg/l, BA = 3mg/l) có chiều cao chồi cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao chồi thấp ở những nồng độ có bổ sung BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) là do ở các môi trƣờng này chủ yếu là tạo protocorm và phát sinh phôi soma