31 đầu tiên của hoa đƣợc áp dụng thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhân giống vô tính bằng giả hành, … Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro của lan Cymbidium nhờ vào nuôi cấy các bộ phận nhƣ sau: - Thân lan (Vij, S.P., K. Kondo và ctv 1994). - Hạt lan (Nayak, N.R., Chand, P.K. và ctv 1998). - Callus (Chang C và Chang WC 1998). Theo Chang C và Chang WC (1998) đã nhân giống in vitro từ callus trên môi trƣờng có bổ sung 2,4-D, TDZ, BA kết quả cho thấy ngoài sự hình thành callus, chồi trên môi trƣờng có bổ sung (2,4-D = 0; 3.3mg/l; 10mg/l) và (TDZ = 0; 0.1mg/l; 0.33mg/l) còn có sự phát sinh phôi soma trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 5.0mg/l hoặc TDZ = 1mg/l). Tiếp theo đó, Huan, L.V.T và Tanaka, M (2004) đã nhân giống in vitro từ protocorm trên môi trƣờng có bổ sung NAA và TDZ. Những hƣớng nghiên cứu trên đã từng bƣớc khẳng định vai trò quan trọng của Cymbidium và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này. 2.4.2. Giống lan Dendrobium Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,… vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao. Theo Nayak et al. (1998), Vij et al. (1994), Sheelavantmath et al. (2000), Lee et al. (1999) đã tìm thấy ảnh hƣởng lớn trong quá trình nhân giống in vitro khi bổ sung kết hợp vào môi trƣờng nuôi cấy BA và NAA. Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy thân giả hành của giống lan Dendrobium moschatum trên môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0, 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) và kết quả thu đƣợc cao nhất tại môi trƣờng có bổ sung BA = 3.0mg/l và NAA = 2.0mg/l là 8.4 protocorm. Năm 2003, Nasiruddin và ctv đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan Dendrobium formosum trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1.25mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l) kết quả thu đƣợc sau 60 ngày nuôi cấy tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l có số chồi cao nhất 2.68. Cũng vào 32 năm 2003 Talukder, Nasiruddin và ctv đã nuôi cấy từ chồi trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.1mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l) sau 40 ngày nuôi cấy đã thu đƣợc số chồi cao nhất 1.9 tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 0.5mg/l. Đây chỉ là vài bƣớc khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này trên giống lan Dendrobium. 2.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm 2.5.1. Giới thiệu về phôi soma 2.5.1.1. Khái niệm Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dƣỡng (thƣờng là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào), bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ. 2.5.1.2. Đặc điểm Phôi soma thƣờng là một tế bào đơn và dễ dàng đƣợc tách ra khỏi mẫu cấy để tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh. 2.5.1.3. Phân loại Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp. - Phôi soma trực tiếp: Đƣợc hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mà không qua sự hình thành callus. - Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus. 2.5.1.4. Các loại phôi - Phôi hình cầu. - Phôi hình tim. - Phôi thủy lôi. - Phôi lá mầm. Hình 2.4: Các loại phôi soma. Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Hình lá mầm 33 2.5.1.5. Vai trò - Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor. - Tạo hạt nhân tạo. - Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật. - Công nghệ nuôi cấy tế bào trần. Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. 2.5.2. Giới thiệu về protocorm 2.5.2.1. Khái niệm Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và đƣợc phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần. 2.5.2.2. Đặc điểm Protocorm thƣờng ở dạng hình cầu đƣờng kính 1-2 mm, có màu xanh và dễ dàng đƣợc tách ra để nhân giống in vitro. PHÔI CYMBIDIUM PHÔI DENDROBIUM 34 2.5.2.3. Vai trò Protocorm chủ yếu đƣợc dùng để nhân giống in vitro để hình thành phôi soma, protocorm và có thể còn đƣợc nhân giống để tạo thành cây con. Hình 2.6: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. 35 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu cấy: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium - Môi trƣờng ½ MS: Tất cả các thí nghiệm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS là môi trƣờng MS nhƣng nồng độ của các chất khoáng đa lƣợng giảm đi một nửa (½) và có bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng: NAA; BA; TDZ. Thành phần của môi trƣờng MS (Murashige & Skoog , 1962). Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ 1. Khoáng đa lƣợng NH 4 NO 3 1650 mg/l KNO 3 1900 mg/l KH 2 PO 4 170 mg/l MgSO 4 . 7H 2 O 370 mg/l CaCl 2 . 2H 2 O 440 mg/l 2. Khoáng vi lƣợng H 3 BO 3 6.20 mg/l MnSO 4 . 4H 2 O 22.3 mg/l CoCl 2 . 6H 2 O 0.025 mg/l CuSO 4 . 5H 2 O 0.025 mg/l ZnSO 4 . 4H 2 O 8.60 mg/l Na 2 MoO 4 . 2H 2 O 0.25 mg/l KI 0.83 mg/l 3. Sắt – EDTA FeSO 4 . 7H 2 O 27.8 mg/l Na 2 EDTA. 2H 2 O 37.8 mg/l 4. Vitamin Myo-Inositol 100 mg/l Thiamin. HCl 0.10 mg/l Pyridoxin. HCl 0.50 mg/l Nicotinic acid 0.50 mg/l Glycin 2.00 mg/l 36 5. Các chất khác Đƣờng 30.0 mg/l Agar 7.00 mg/l 6. pH môi trƣờng 5.6 – 5.8 * Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ 15/3/2005 – 15/6/2005. - Địa điểm: tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm.TPHCM. 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1. Bố trí thí nghiệm - Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy. 3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. - Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297. 37 b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243. 38 3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium. - Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297. 39 b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Dendrobium. - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243. 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy. Quan sát số lƣợng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium: a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy. b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy. c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy . d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi. 40 3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy. Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các mẫu cấy. a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy. b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi. c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi. d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi. 3.2.4. Phân tích thống kê. Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Microsoft Excel và chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA) để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để đánh giá kết quả thí nghiệm. . cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy. 3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. - Thí nghiệm. bình: 81. - Số mẫu cấy: 243 . 38 3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của. quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,… vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao.