11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzylaminopurine NAA - naphthaleneacetic acid MS Murashige và Skoog (1962) TDZ 1 - phenyl 1 - 3 - (1,2,3 - thiadiazol - 5 - yl) - urea ABA Acid Abscisic DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid GA 3 Gibberellin 12 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay hoa kiểng không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hƣởng sâu xa đến tâm hồn con ngƣời và làm đẹp cho cảnh quan môi trƣờng, do đó quan tâm phát triển hoa kiểng là vấn đề cần thiết. Bên cạnh đó lan là một trong những loại hoa đƣợc ƣa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thƣớc phong phú và đa dạng nên chúng đƣợc sản xuất khá phổ biến. Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng. Các nƣớc có truyền thống sản xuất hoa lan nhƣ Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan , hàng năm thu đƣợc hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan. Ở Việt Nam hoa lan là một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có đủ điều kiện thuận lợi cho cây lan phát triển nhƣ: ẩm độ, nhiệt độ, cƣờng độ ánh sáng…., đặc biệt là thích hợp đối với các nhóm lan: Dendrobium, Cymbidium, Oncidium,…. .Nên vừa qua sở Nông nghiệp-Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức hội thảo về hiện trạng và hƣớng phát triển hoa lan trên địa bàn, nhằm đƣa cây hoa lan thành cây chủ lực trong cơ cấu nông nghiệp của thành phố (ĐCSVN, 27/6/2005). Việc sản xuất hoa lan ở nƣớc ta hiện nay chỉ mới đáp ứng đƣợc nhu cầu thấp chủ yếu phải nhập từ các nƣớc khác nhƣ: Thái Lan, Đài Loan….Trƣớc tình hình trên và cũng nhằm đƣa tiến bộ của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào vào công tác giống, góp phần phát triển nghề trồng lan trên qui mô rộng, việc ứng dụng nhân giống in vitro trên cây lan là điều cần thiết hiện nay ở nƣớc ta. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: "Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium" 13 1.2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao nhất trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium. 1.3. Yêu cầu Quan sát sự phát sinh phôi soma, protocorm và chồi của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan in vitro. 14 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan 2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam 2.1.1.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao: *Ở Châu Âu: - Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành lan Dendrobium. - Holland là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Holland có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium. - Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, nhập 75,3 triệu cành, chủ yếu từ các nƣớc: Thái Lan, Holland , Singapore …. - Đức và Pháp là hai quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và thứ 3 Châu Âu. *Ở Châu Á: - Nhật là quốc gia nhập khẩu đứng đầu thế giới. Theo thống kê, tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành 600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis,… - Thái Lan là nƣớc xuất khẩu lan đứng đầu thế giới, chủ yếu là lan Dendrobium, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá 1 - 3 USD / cành, có khi 8 - 10 USD / cành, những giống quý có thể lên đến hàng trăm USD. Ngày nay, bằng nhiều kỹ thuật khác nhau ngƣời ta đã tạo ra đƣợc nhiều giống lan mới nhƣ: Dendrobium ayaka, Dendrobium edians beauty, Dendrobium sungould (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). 2.1.1.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam - Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng loại. Tham gia sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nƣớc, liên doanh hoặc100% vốn đầu tƣ nƣớc ngoài). Tuy nhiên sản xuất còn chƣa đƣợc áp dụng khoa học kỹ thuật 15 nên mặc dù đa dạng nhƣng không đạt về tiêu chuẩn, số lƣợng và chất lƣợng do đó tính cạnh tranh còn thấp. *Tại TP.HCM: - Trong các chủng loại sản phẩm hoa kiểng, hoa lan xem là nhóm hoa có giá trị kinh tế cao, trong đó lan cắt cành đem lại lợi nhuận khá cao (có thể đạt 500 triệu – 1 tỉ đồng / ha / năm) nhƣng vốn đầu tƣ ban đầu vẫn còn cao (600 – 800 triệu đồng / ha), chủ yếu là phần vốn đầu tƣ cho cây giống. Trong đó nhóm Mokara và Dendrobium đƣợc trồng nhiều nhất. - Theo Trung tâm Nghiên cứu khoa học kỹ thuật và khuyến nông TP.HCM, trong thời gian qua diện tích trồng hoa lan trong thành phố tăng nhanh, từ 20 ha năm 2003 lên 50 ha năm 2004 và khoảng 80 ha năm 2005. - Để đƣa hoa lan trở thành một trong những cây chủ lực trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp trong những năm tới, TP.HCM đề ra mục tiêu phát triển diện tích trồng hoa lan lên 200 ha vào năm 2010 và một số giải pháp chính về giống, khoa học kỹ thuật, thị trƣờng tiêu thụ, đào tạo nguồn nhân lực, chính sách hỗ trợ (ĐCSVN, 27/6/2005). *Tại Đà Lạt: - Cây lan Cymbidium đã đƣợc nuôi trồng tại Đà Lạt từ rất lâu, chủ yếu để tiêu khiển. Tại đây, ngoài những loài tự nhiên, các biến chủng, còn có nhiều giống nhập nội nuôi trồng. - Từ năm 1977, sau khi thành lập tổ Hoa Lan Xuất Khẩu, phong trào trồng lan đã đƣợc phát triển mạnh. - Đến năm 1985, đã xuất khẩu đƣợc trên 15.000 cành hoa Cymbidium. - Hiện nay nhu cầu hoa lan đang tăng nhanh, trong khi đó mức độ phát triển còn hạn chế. Đó là do chƣa có những đầu tƣ nghiên cứu về đối tƣợng này nhƣ: vấn đề khoa học, chọn tạo giống và kỹ thuật nuôi trồng…do đó không thể hiểu rõ và đánh giá đúng đắn tiềm năng và triển vọng nguồn lợi này. - Xu hƣớng hiện nay đang tập trung vào các giống nhập nội, còn lại các loại lan nội địa ít đƣợc chú ý. Mặc dù các loài biến chủng nội địa có giá trị rất cao, có thể đáp ứng đƣợc nhu cầu xuất khẩu. Nhƣ vậy cơ sở để phát triển nghề trồng lan xuất khẩu vẫn phải chú trọng vào cây lan nội địa, nhất là chọn tạo giống mới từ cây lan nội (Trích Dƣơng Ngọc Bích Quyên, 2002). 16 2.1.2. Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium 2.1.2.1. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, ngƣời ta đã xếp riêng Cymbidium vào một chi (Otto Swartz, 1799). Trong khóa phân loại của Lindley - Bentham - Brieger năm 1983, chi Cymbidium thuộc tông phụ Cymbidinae, tông Dendreae, phân họ Orchidoideae. Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dƣơng, từ năm 1932, Henri Lecompte cho rằng chi này có 120 loài. Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp lại và xác định có khoảng 60 loài. Theo những nhà phân loại học Việt Nam nhƣ Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi đã giới thiệu ở nƣớc ta có khoảng 12 loài: - Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội). - Cymbidium cyperifolium (thanh lan). - Cymbidium dayanum Reichb. f (xích ngọc). - Cymbidium devonianum Paxt. (gấm ngũ hồ). - Cymbidium eburneum Reichb (bạch lan). - Cymbidium ensifolium Swartz (mặc lan). - Cymbidium erythrostylum Lindl. (bạch hồng). - Cymbidium giganteum Wall. (hoàng lan). - Cymbidium insigne Rolfe (hồng lan). - Cymbidium lancifolium Hook. f. - Cymbidium polanei Gagn (tử cán). - Cymbidium munronianum King. et plant. 2.1.2.2. Đặc điểm hình thái - Lan Cymbidium là loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. - Rễ: mọc bám trên vỏ cây, mặt đất hoặc ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn. Rễ mới thƣờng chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ củ rễ. - Thân (căn hành): thƣờng ngắn, nối những củ lan với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể 17 mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con. Do đó ngƣời ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial). - Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 cm đến 15 cm, củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá. - Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. - Chồi hoa: thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài. Thông thƣờng, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. - Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luôn phiên theo đƣờng xoắn ốc. - Hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ gọi là trục hợp nhụy, hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Nhị ở trên cùng, mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính nhƣ keo. Khối phấn đƣợc đậy bởi một nắp màu trắng ngà dễ mở rời, cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên do hoa Cymbidium chỉ thụ phấn đƣợc nhờ côn trùng. - Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả. Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín, quả mở theo 3 đƣờng góc và gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới. 2.1.2.3. Điều kiện sinh thái Cymbidium có những tính chất rất đặc biệt: thời gian ra hoa dài (trung bình 12 tháng), khả năng phát triển rất mạnh, có hình dáng, màu sắc, kích thƣớc phong phú và đa dạng. Các loài Cymbidium sống trong môi trƣờng mát cây cần nhiều ánh sáng trong suốt thời gian trong năm, nhƣng cây không chịu đƣợc ánh sáng trực xạ nên phải che bóng để giữ độ chiếu sáng thích hợp. Cymbidium cần nhiều nƣớc trong mùa sinh trƣởng, cần tƣới nƣớc nhẹ nhàng và thƣờng xuyên bón phân đầy đủ, từ lúc cây phát triển cũng nhƣ lúc ra hoa và phân chia các khóm giả hành. 18 Về nhiệt độ: loài lan này sống trong môi trƣờng lạnh nên có chế độ nhiệt rất đặc biệt: 15 0 C vào mùa đông và 20 0 C vào mùa hè, biên độ ngày và đêm từ 6 - 7 0 C cần cho ra hoa. Khi các giả hành phát triển, nhiệt độ về đêm phải từ 6 - 12 0 C liên tục từ 3 - 4 tuần. Về ẩm độ: bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký sinh (epiphyte). Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm nên phải tƣới trong mọi thời gian trong năm, chỉ cho giá thể vừa kịp khô giữa hai lần tƣới. Ẩm độ thích hợp từ 60-70% (Trích Phan Thị Tuyết Hằng, 2005). 2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 2.1.3.1. Phân loại Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đƣờng xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết. Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Việc phân loại phong lan khá phức tạp. Theo truyền thống cổ điển các nhà khoa học trƣớc đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium nhƣ sau: - Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi). - Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng). - Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên). - Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế). - Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng). - Dendrobium (Hoàng thảo dẹt). - Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xƣơng cá). - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng). - Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ). - Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu). - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung). 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái - Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật đƣợc bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời 19 gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. - Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống. - Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang và các gân lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng. - Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa đƣợc tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ hoa). Cột nhị nhụy ngắn. 2.1.3.3. Điều kiện sinh thái Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, ngƣời ta chia làm 2 hai nhóm chính: - Nhóm ƣa lạnh: nhiệt độ lý tƣởng là 15 0 C sống chủ yếu ở vùng cao nguyên trên 1000m. Những loài lan này có thể ra hoa ở nhiệt độ cao. - Nhóm lan ƣa nóng: nhiệt độ thích hợp nhất là 25 0 C. Ngoài ra còn có giống lan thích hợp ở nhiệt độ 20 0 C có thể ra hoa ở vùng nóng và vùng lạnh. - Ẩm độ: thích hợp ở ẩm độ 50 - 70% - Ánh sáng: có thể nói Dendrobium là loài ƣa sáng (60 - 70%), có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%. Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidium và Dendrobium thực hiện trong đề tài. 20 Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium. . tài: " ;Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium& quot; 13 1 .2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của. trƣờng nuôi cấy thích hợp để đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao nhất trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium. 1.3. Yêu cầu Quan sát sự phát sinh phôi soma, protocorm và chồi của 2 giống lan. giống lan Dendrobium và Cymbidium. Quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan in vitro. 14 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. 1 Giới thiệu