CHUYỂN GEN CẢI BIẾN gdhA CÓ NGUỒN GỐC Escherichia coli VÀO CÂY THUỐC LÁ Nicotiana tabacum

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 69–82 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10588 TRANSFORMATION OF Escherichia coli MODIFIED gdhA GENE INTO Nicotiana tabacum Pham Thi Hang1, Nguyen Thuy Linh1, Le Bac Viet1, Nguyen Thi Kim Lien1, Le Thi Thu Hien1,2, Huynh Thi Thu Hue1,2,* Institute of Genome Research, VAST, Vietnam Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam Received August 2017, accepted March 2019 ABSTRACT The gdhA gene from Escherichia coli encoding a NADPH-GDH was expressed in tobacco plants exhibited high growth performance and enhanced herbicide resistance as well as drought tolerance In addition, the gdhA gene when expressed in maize plants could increase productivity because of improving stress tolerance In this study, we isolated and analyzed a gdhA gene from the E coli strain JM109 Then, the E coli derived-gdhA sequence was modified by using OptimumGene™ software for plant compatibility The optimized gdhA gene was inserted into an expression cassette containing the CaMV 35S promoter and the 35S terminator of the pRTRA7/3 vector The 35S::gdhA::35S construct was ligated into the plant expression plasmid pCAMBIA1300 which then introduced into the A tumefaciens strain EHA105 In order to examine the expression of the gdhA gene, we created gdhA-transgenic plants via Agrobacterium-mediated transformation into N tabacum K326 The PCR analysis showed that two out of 20 plants were positive to the presence of the gdhA gene The RT-PCR experiment also revealed that gdhA was expressed at transcriptional level These results suggested that the gdhA expression construction can be transformed into other crops such as maize Keywords: E coli, genetic modification, genetic transformation, gdhA gene, tobacco Citation: Pham Thi Hang, Nguyen Thuy Linh, Le Bac Viet, Nguyen Thi Kim Lien, Le Thi Thu Hien, Huynh Thi Thu Hue, 2019 Transformation of Escherichia coli modified gdhA gene into Nicotiana tabacum, 41(1): 69–82 https://doi.org/10.15625/0866-7160/v41n1.10588 * Corresponding author email: hthue@igr.ac.vn ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 69 TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 69–82 DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10588 CHUYỂN GEN CẢI BIẾN gdhA CÓ NGUỒN GỐC Escherichia coli VÀO CÂY THUỐC LÁ Nicotiana tabacum Phạm Thị Hằng1, Nguyễn Thùy Linh1, Lê Bắc Việt1, Nguyễn Thị Kim Liên1, Lê Thị Thu Hiền1,2, Huỳnh Thị Thu Huệ1,2,* Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Việt Nam Ngày nhận 3-8-2017, ngày chấp nhận 3-3-2019 TÓM TẮT Gen gdhA mã hoá cho NAPH-GDH từ vi khuẩn E coli biểu thuốc làm tăng cường khả chống chịu thuốc bảo vệ thực vật, tăng sinh khối thực vật tăng khả chịu hạn Khi biểu gen gdhA ngô giúp tăng suất… nhờ cải thiện khả chịu đựng hạn Với mục đích có nguồn gen giá trị này, tiến hành phân lập gen gdhA từ chủng vi khuẩn E coli JM109, tạo dòng xác định trình tự gen gdhA để tìm khác biệt gen chủng có Đồng thời, chúng tơi thực cải biến trình tự gen gdhA phần mềm OptimumGeneTM cho phù hợp với thực vật Gen gdhA sau cải biến ghép nối với promoter CaMV 35S 35S terminator vector trung gian pRTRA 7/3 để tạo cấu trúc biểu 35S::gdhA::35S Cấu trúc chuyển vào vector pCAMBIA1300 tạo nên vector biểu thực vật mang gen gdhA biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 Để kiểm tra biểu gen gdhA tiến hành chuyển cấu trúc biểu gen gdhA vào mơ hình thuốc N tabacum K326 thơng qua A tumefaciens Phân tích có mặt gen 20 dòng thuốc chuyển gen PCR RT-PCR cho thấy số 20 dòng thuốc chuyển gen có mang gen gdhA hoạt động mức độ phiên mã tạo mRNA Sự biểu cấu trúc thuốc cho thấy sử dụng cấu trúc mang gen để chuyển gen gdhA vào trồng đích ngơ Từ khố: E coli, cải biến gen, thuốc lá, chuyển gen, gen gdhA *Địa liên hệ email: hthue@igr.ac.vn MỞ ĐẦU Khô hạn nguyên nhân quan trọng làm giảm suất chất lượng sản phẩm trồng Khi môi trường khô hạn, bị stress nước dẫn đến nhiều hậu nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013) Vì vậy, để sống sót điều kiện hạn hán, thực vật hình thành nên nhiều chế chống chịu Trong phản ứng với thiếu nước, thực vật tích luỹ số chất chuyển hố đường (trehalose, sorbitol mannitol), amino axit (proline asparagine) amin (glycine betain polyamines) 70 Trong số này, việc tích lũy amino acid tự dường có vai trị quan trọng việc bảo vệ thực vật (Good & Zaplachinski, 1994; Rhodeset et al., 1999), tích lũy amino acid điều chỉnh thâm hụt nước chưa nghiên cứu làm rõ Glutamate đóng vai trị quan trọng việc điều chỉnh hoạt động nhiều đường, đặc biệt trình trao đổi amino acid (Forde & Lea, 2007), trao đổi chất cacbon (Lam et al., 1998), chuyển hóa amino acid (Noctor et al., 2002) đồng hoá nitrate (Stitt et al., 2002) Glutamate dehydrogenase từ vi khuẩn (GDH, E.C 1.4.1.1) thực vật Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli (E.C 1.4.1.2) xúc tác cho phản ứng thuận nghịch Với trình đồng hố, GDH số enzyme có khả amin hóa khử axit hữu để tạo amino acid; α-ketoglutarate sử dụng để sản xuất glutamate với diện NAD(P)H (Wooton, 1983) Đối với q trình dị hóa, GDH enzyme có khả giải phóng amino nitơ từ amino acid để tạo axit keto NH3 tái chế riêng để sử dụng q trình chuyển hóa cacbon hình thành amide, đặc biệt q trình già hố (Aubert et al., 2001; Loulakakis et al., 2002) GDH tham gia tổng hợp glutamate để cung cấp khung carbon cho chu trình TCA sản xuất lượng thiếu hụt carbon (Dubois et al., 2005; Kichey et al., 2005; Tercé‐Laforgue et al., 2004) Ở vi khuẩn, ammoni đồng hóa thành amino acid dựa glutamate aminotransferases Ở thực vật, nghiên cứu cho thấy GDH cảm ứng tăng cường biểu lượng gốc tự tăng lên stress vô sinh (Skopelitis et al., 2006) Như vậy, thực vật vi khuẩn có điểm tương đồng đáng ý hệ gen Nhiều gen vi khuẩn liên quan đến khả chống chịu điều kiện môi trường stress khác xác định Sự biểu protein vi khuẩn liên quan biểu thực vật trực tiếp gián tiếp bảo vệ chống lại stress môi trường khô hạn, mặn, nhiệt độ thấp Thực vật chuyển gen GDHs vi khuẩn cải thiện đáng kể tính chống chịu với chất bảo vệ thực vật, điều kiện thiếu nước Tên mồi gdhAF gdhAR gdhABamHIF gdhANotIR HptF HptR CaMV35SF cmycR Các nghiên cứu trước cho thấy, gen gdhA mã hoá cho NAPH-GDH từ vi khuẩn E coli biểu thuốc (Nicotiana tabacum cv.„SR1‟) làm tăng cường khả chống chịu thuốc bảo vệ thực vật phosphinithricin (PPT), làm tăng sinh khối thực vật, hàm lượng axit amin tự carbohydrate (Ameziane et al., 2000), tăng khả chịu hạn (Mungur et al., 2006) Các enzyme GDH phụ thuộc NADPH mã hoá gen gdhA E coli biểu ngô cải thiện sức sống điều kiện thiếu nước (Lightfoot et al., 2007) Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân lập gen gdhA mã hoá cho GDH từ chủng vi khuẩn E coli JM109, cải biến gen tái tổ hợp vào vector biểu thực vật để phục vụ cơng tác chuyển gen vào đích ngô Trước tiên, tiến hành chuyển gen gdhA cải biến vào mơ hình thuốc để kiểm tra biểu gen cải biến cấu trúc thiết kế VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ba chủng vi khuẩn E coli JM109, chủng E coli DH10β chủng A tumefaciens EHA105 lưu giữ Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các vector sử dụng gồm: vector tách dòng pJET 1.2, vector tách dòng trung gian pRTRA7/3 mang promoter CaMV35S, vector biểu thực vật pCAMIA1300 Bảng Các cặp primer thiết kế để nhân gen Trình tự mồi 5‟ GAAGGATCCAGGATGGATCAGACATATTCTCT 3‟ 5‟ATTATGCGGCCGCTTATTAAATCACACCCTGCGC 3‟ 5‟ ACAGATGGATCCGATCAGACATACTCTCTGGAGTC 3‟ 5‟ AGTGATGCGGCCGCGATCACACCCTG 3‟ 5‟ AAAGCCTGAACTCACCGC 3‟ 5‟ GCTTTCCACTATCGGCGA 3‟ 5‟ CACTGACGTAAGGGATGACGC 3‟ 5‟ TATCGACGGGATCGGGCTAGAGTTCG 3‟ 71 Pham Thi Hang et al Phân lập gen gdhA từ chủng vi khuẩn Gen gdhA nhân từ DNA tổng số chủng vi khuẩn E coli kỹ thuật PCR với cặp mồi gdhAF/R Sản phẩm PCR tinh theo quy trình kit GeneJET Gel Extraction Kit hãng Thermo Scientific tạo dịng vector pJET1.2 theo quy trình kit Clone JET Kit hãng Thermo Scientific Xác định phân tích trình tự gen gdhA Trình tự nucleotide xác định dựa nguyên tắc phương pháp Sanger hệ thống máy giải trình tự ABI 3500 Kết giải trình tự xử lý phần mềm BioEdit Trình tự gen sau xử lý so sánh với sở liệu ngân hàng gen đăng ký lên ngân hàng gen với mã số KT124225 Cải biến gen gdhA Trình tự gen gdhA từ vi khuẩn chưa qua cải biến đưa lên phân tích cơng cụ phân tích codon để đánh giá số CAI gen gdhA đưa vào biểu ngô Sau cải biến, số CAI tăng lên 0,8–1,0 coi cải biến thành cơng Kiểm tra trình tự amino axit gen cải biến phần mềm Expasy để đánh giá mức độ xác thay đổi Trình tự cải biến giữ nguyên đặc điểm gen nucleotide đầu mã ba, cải biến vị trí thứ mã ba Sau đó, gen tổng hợp hoàn chỉnh với mã ba cải biến Thiết kế vector mang cấu trúc biểu CaMV35S::gdhA::35S Vector tách dòng pJET1.2 mang gen gdhA cải biến dùng làm khuôn phản ứng PCR với primer gdhABamHIF/NotIR nhân đoạn gen gdhA treo điểm nhận biết BamHI NotI nhằm gắn với vector trung gian pRTRA7/3 xử lý BamHI NotI Vector pRTRA7/3 có chứa cấu trúc CaMV35S::35S gồm promoter CaMV35S terminator 35S, gen gdhA chèn vào promoter terminator để tạo cấu trúc biểu CaMV35S::gdhA::35S Sau tồn cấu trúc đọc trình tự để kiểm tra lại tính xác gen điểm nối Đoạn cấu trúc biểu gen cắt với HindIII ghép nối với vector biểu thực vật pCAMBIA 1300 mở vịng với HindIII (hình 1) Vector tái tổ hợp pCAMBIA1300 biến nạp vào A tumefaciens theo phương pháp xung điện Hình Sơ đồ thiết kế vector biểu thực vật mang gen gdhA 72 Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli Chuyển gen gdhA vào thuốc mơ hình N tabacum K326 theo phương pháp mảnh (Topping, 1998) Chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp chứa gen gdhA ni cấy mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin rifamycin 48 giờ, sau ni phục hồi đạt OD600nm = 0,7 Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, hồ tan mơi trường ½ MS (Murashige and Skoog medium) để chuẩn bị biến nạp Các mảnh thuốc N tabacum có kích thước 1×1 cm ngâm dịch huyền phù tế bào vi khuẩn 15 phút Các mảnh sau tái sinh mơi trường chồi MS có bổ sung BAP (6-benzylaminopurine) Những chồi phát triển tốt cắt chuyển sang môi trường rễ Khi phát triển hồn thiện hình thái chuyển giá thể Đánh giá thuốc chuyển gen gdhA hệ T0 Khi thuốc chuyển gen phát triển bình thường, tiến hành thu mẫu non để tách chiết DNA RNA tổng số Các mẫu DNA tổng số sau sử dụng làm khn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi: HptF/R gdhABamHIF/NotIR kiểm tra có mặt cấu trúc biểu gen gdhA thuốc chuyển gen hệ T0 Đồng thời, kiểm tra hoạt động phiên mã gen gdhA thông qua phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gdhABamHIF/NotIR KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập gen gdhA từ chủng vi khuẩn E coli JM109 Dựa thông tin trình tự gen gdhA cơng bố GenBank, thiết kế cặp mồi đặc hiệu gdhA F/R cho phản ứng PCR nhân đoạn gen gdhA Trong nghiên cứu này, DNA tổng số tách chiết từ ba chủng vi khuẩn E coli (JM109, Top10, DH5α) theo phương pháp tách DNA tổng số Sambrook et al (1989) Phản ứng PCR thực với khuôn mẫu DNA, sử dụng enzyme DreamTaq polymerase với cặp mồi gdhA F/R nhiệt độ gắn mồi 63oC Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% (hình 2) cho thấy, chủng vi khuẩn E coli: JM109, Top10, DH5α cho sản phẩm PCR với băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1,4 kb Các băng sáng, rõ nét, kích thước phù hợp theo tính tốn chúng tơi thiết kế cặp mồi nhân gen gdhA Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen gdhA: Đường chạy 1: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số tách từ chủng JM109, đường chạy 2: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số tách từ chủng Top10, đường chạy 3: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số tách từ chủng DH5α Tuy nhiên, để khẳng định xác sản phẩm thu gen gdhA, chúng tơi tiến hành tách dịng, xác định trình tự nucleotide so sánh với trình tự gen gdhA Ecogene Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen ngoại lai xác định trình tự máy giải trình tự ABI 3500, sử dụng cặp mồi pJET1.2F/R Kết hợp kết giải trình tự mồi pJET1.2F pJET1.2R, chúng tơi thu trình tự đầy đủ gen gdhA có kích thước 1344bp Kết xác định trình tự xử lý bằn phần mềm BioEdit so sánh trình tự với trình tự tham chiếu Ecogene (mã số: EG10372), cho thấy gen gdhA phân lập có độ tương đồng 100% Trình tự gen gdhA phân lập được đăng ký ngân hàng gen với mã số KT124225 (hình 3) Như đề cập, gdhA gen từ vi khuẩn, chuyển vào thực vật mà không cải biến khó có biểu protein tế bào thực vật chuyển gen Sở dĩ có tượng khác biệt tỉ lệ nucleotide AT GC gen vi khuẩn thực vật Từ đó, số (CAI-codon adoption index) đưa để đánh giá phân tích độ tương thích mã hóa codon biểu gen vật chủ khác loài Để đánh giá 73 Pham Thi Hang et al số này, phần mềm tin sinh OptimumGeneTM sử dụng Bằng thuật toán sử dụng phần mềm, gen phân lập từ nguồn khác biểu vật chủ phải có số CAI đạt từ 0,8–1,0; coi số tối ưu cho biểu gen lên tế bào vật chủ khác lồi Một protein có khả biểu cao số CAI chủng chủ từ 0,8 trở lên Giá trị tuyệt đối tần suất sử dụng cao codon định chủng chủ 100, codon có tần xuất sử dụng 30 có khả làm cản trở biểu protein 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 ATGGATCAGACATATTCTCTGGAGTCATTCCTCAACCATGTCCAAAAGCGCGACCCGAATCAAACCGAGTTCGCGCAAGCCGTTCGTGAAGTAATGACCA 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 CACTCTGGCCTTTTCTTGAACAAAATCCAAAATATCGCCAGATGTCATTACTGGAGCGTCTGGTTGAACCGGAGCGCGTGATCCAGTTTCGCGTGGTATG 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 GGTTGATGATCGCAACCAGATACAGGTCAACCGTGCATGGCGTGTGCAGTTCAGCTCTGCCATCGGCCCGTACAAAGGCGGTATGCGCTTCCATCCGTCA 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 GTTAACCTTTCCATTCTCAAATTCCTCGGCTTTGAACAAACCTTCAAAAATGCCCTGACTACTCTGCCGATGGGCGGTGGTAAAGGCGGCAGCGATTTCG 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 ATCCGAAAGGAAAAAGCGAAGGTGAAGTGATGCGTTTTTGCCAGGCGCTGATGACTGAACTGTATCGCCACCTGGGCGCGGATACCGACGTTCCGGCAGG 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 TGATATCGGGGTTGGTGGTCGTGAAGTCGGCTTTATGGCGGGGATGATGAAAAAGCTCTCCAACAATACCGCCTGCGTCTTCACCGGTAAGGGCCTTTCA 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 TTTGGCGGCAGTCTTATTCGCCCGGAAGCTACCGGCTACGGTCTGGTTTATTTCACAGAAGCAATGCTAAAACGCCACGGTATGGGTTTTGAAGGGATGC 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 GCGTTTCCGTTTCTGGCTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCTATCGAAAAAGCGATGGAATTTGGTGCTCGTGTGATCACTGCGTCAGACTCCAGCGGCAC 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 TGTAGTTGATGAAAGCGGATTCACGAAAGAGAAACTGGCACGTCTTATCGAAATCAAAGCCAGCCGCGATGGTCGAGTGGCAGATTACGCCAAAGAATTT 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 GGTCTGGTCTATCTCGAAGGCCAACAGCCGTGGTCTCTACCGGTTGATATCGCCCTGCCTTGCGCCACCCAGAATGAACTGGATGTTGACGCCGCGCATC 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 AGCTTATCGCTAATGGCGTTAAAGCCGTCGCCGAAGGGGCAAATATGCCGACCACCATCGAAGCGACTGAACTGTTCCAGCAGGCAGGCGTACTATTTGC 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 ACCGGGTAAAGCGGCTAATGCTGGTGGCGTCGCTACATCGGGCCTGGAAATGGCACAAAACGCTGCGCGCCTGGGCTGGAAAGCCGAGAAAGTTGACGCA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 CGTTTGCATCACATCATGCTGGATATCCACCATGCCTGTGTTGAGCATGGTGGTGAAGGTGAGCAAACCAACTACGTGCAGGGCGCGAACATTGCCGGTT 1310 1320 1330 1340 | | | | | | | | gdhA EG10372 gdhA KT124225 TTGTGAAGGTTGCCGATGCGATGCTGGCGCAGGGTGTGATTTAA Hình So sánh trình tự đoạn gen gdhA phân lập từ vi khuẩn E coli JM109 Thông thường, gen biểu tế bào vật chủ khác lồi, số CAI có xu hướng thấp 0,8 Vì vậy, để gen gdhA biểu protein có hoạt tính tốt thực vật yêu cầu cần phải cải biến nucleotide gen gdhA cho phù hợp với thực vật cách làm tăng số 74 CAI đạt 0,8–1,0 Trên thực tế, nguyên lí cải biến gen từ vi sinh vật để thích hợp cho chuyển gen làm tăng tỷ lệ % GC gen cách thay đổi nucleotide thứ mã hóa có nhiều AT vi khuẩn chuyển thành nucleotide G C với điều kiện không làm thay đổi amino axit mã hóa Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli codon Tuy nhiên, thực tế, thay đổi mã sâu sắc để đưa số CAI đến 1,0, lúc đầu protein biểu tốt sau dễ bị đào thải khơng rõ ngun nhân Vì vậy, thơng thường cải biến định hướng tối ưu phần mã ba để nâng số CAI gen lên khoảng 0,8 thích hợp Kết thúc trình cải biến, gen tổng hợp theo đường hóa học để làm nguyên liệu cho bước nghiên cứu Trình tự gen gdhA phân lập từ vi khuẩn E coli JM109 đưa lên phân tích cơng cụ OptimumGeneTM–Codon Optimization cho kết số CAI đạt 0,69 Do đó, cần có cải biến gen codon chứa nhiều nucleotide A T thành codon chứa nhiều G C thích hợp cho biểu thực vật mà khơng làm ảnh hưởng đến trình tự amino axit gen gdhA ban đầu STT 10 11 Tổng Trình tự amino axit gen gdhA phân lập từ vi khuẩn E coli JM109 xác định phần mềm Expasy Gen gdhA phân lập từ vi khuẩn E coli JM109 mã hóa cho protein gồm 447 amino axit Trên trình tự gen gdhA có 202 ba codon giàu AT thay vị trí nucleotide thứ thành ba giàu GC thích hợp thực vật Tỷ lệ ba giàu AT gen gdhA vi khuẩn chiếm 45,19% toàn gen Sau xác định ba giàu AT gen gdhA phân lập từ vi khuẩn, dựa vào bảng mã hóa amino axit để tiến hành thay nucleotide thứ ba mã hóa mà khơng làm thay đổi amino axit trình tự protein gen mã hóa Trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn ba mã hóa nhằm nâng cao số CAI gen, ba phải phân bố gen đồng thời phải có số amino axit gây ảnh hưởng khơng tốt lên biểu gen (negative CIS elements) thấp (< negative) Kết lựa chọn ba để thay thể bảng Bảng Trình tự ba mã hóa amino axit thay Bộ ba mã hóa gốc Bộ ba mã hóa sau cải biến Số lượng gen gdhA TAT TAC AAT AAC ATT ATC TTA TTG ATA ATC TTT TTC 11 CTA CTG GTA GTG AAA AAG 18 CGT CGC GTT GTG 16 72 Trên trình tự gen gdhA cải biến, ba TAT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 5, 45, 56, 213 300 thay ba TAC Bộ ba AAT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 20, 42, 118, 190, 322, 325, 345 370 thay ba AAC Bộ ba ATT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 106, 207, 428 444 thay ba ATC Bộ ba TTA vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 50 thay ba TTG Bộ ba ATA vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 74 thay ba ATC Bộ ba TTT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 38, 63, 112, 147, 179, 202, 231, 255, 301 368, 436 thay ba TTC Bộ ba 75 Pham Thi Hang et al CTA vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 314, 367 thay ba CTG Bộ ba GTA vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 31, 366 thay ba GTG Bộ ba AAA vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 44, 92, 108, 112, 124, 132, 134, 180, 225, 251, 277, 279, 287, 299, 343, 372, 396 399 thay ba AAG Bộ ba CGT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 78, 81, 146, 258 287 thay ba GCG Bộ ba GTT vị trí codon mã hóa cho acid amin thứ 28, 55, 68, 102, 165, 172, 217, 236, 238, 270, 316, 331, 342, 416 439 thay ba GTG Gen gdhA cải biến 72 codon chứa nhiều AT nucleotide thứ chuyển đổi thành G C khơng làm thay đổi trình tự amino axit Sau cải biến, thành phần GC gen tăng từ 53,57% lên 59,05% số CAI gen gdhA tương thích biểu ngơ tăng lên 0,81, số phù hợp cho việc chuyển gen sau cải biến vào biểu ngơ Trình tự gen gdhA sau cải biến kiểm tra trình tự amino axit phần mềm BioEdit để xác định mức độ xác thay đổi (hình 4) Kết phân tích cho thấy, việc thay đổi nucleotide đoạn gen gdhA suy biến khơng làm thay đổi trình tự amino axit gen gdhA ban đầu Đoạn gen gdhA thu đáp ứng yêu cầu cho việc biểu thực vật hồn tồn sử dụng việc chuyển gen vào thực vật 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA KT124225 MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWPFLEQNPKYRQMSLLERLVEPERVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPS gdhA 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA KT124225 VNLSILKFLGFEQTFKNALTTLPMGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREVGFMAGMMKKLSNNTACVFTGKGLS gdhA 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA KT124225 FGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGMGFEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKAMEFGARVITASDSSGTVVDESGFTKEKLARLIEIKASRDGRVADYAKEF gdhA 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | gdhA KT124225 GLVYLEGQQPWSLPVDIALPCATQNELDVDAAHQLIANGVKAVAEGANMPTTIEATELFQQAGVLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQNAARLGWKAEKVDA gdhA 410 420 430 440 | | | | | | | | | gdhA KT124225 RLHHIMLDIHHACVEHGGEGEQTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI* gdhA .* Hình Trình tự amino axit gen gdhA qua cải biến Thiết kế gen gdhA vector trung gian pRTRA 7/3 Để biểu gen tế bào thực vật, gen gdhA cần đặt điều khiển promoter terminator thích hợp Chúng tơi lựa chọn promoter CaMV35S 35S terminator để điều khiển hoạt động gen gdhA thực vật Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV 35S promoter 76 promoter định sử dụng rộng rãi CaMV 35S promoter sử dụng rộng rãi nhờ khả điều khiển biển gen ngoại lại nhiều loại mô (Odell et al., 1985; Jefferson et al., 1987) nhiều loại khác như: lúa (Terada & Shimamoto, 1990; Battraw & Hall, 1990), khoai tây (Visser et al., 1991), củ cải đường (Lindsey & Gallois, 1990), đậu tương (Yang Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli & Christou, 1990), ngô (Rhodes et al., 1988), cải dầu (Fry et al., 1987), dưa (Dong et al., 1991) Đoạn gen gdhA cải biến tạo dòng vector pJET1.2, plasmid tái tổ hợp mang gen gdhA cải biến sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi gdhABamHIF gdhANotIR, đoạn gen nhân lên với cặp mồi có kích thước 1.344 bp bao gồm tồn vùng CDS gen sau ghép nối với vector tách dịng trung gian pRTRA có kích thước 4.247 bp chứa đoạn trình tự cần thiết cho biểu gen gồm promoter CaMV35S 35S terminator, gen đích chèn vào điểm nhận biết BamHI NotI Đồng thời, sản phẩm PCR nhân gen gdhA sử dụng cặp mồi gdhABamHI F - gdhANotI R xử lý BamHI NotI để thu đoạn gen gdhA dạng đoạn BamHI - NotI Sản phẩm gen gdhA vector pRTRA sau xử lý enzyme lai với biến nạp vào tế bào E coli chủng DH10b tiến hành chọn lọc enzyme BamHI NotI Kết điện di sản phẩm xử lý enzyme cho thấy đoạn DNA 1.344 bp (hình 5) xuất hiện, chứng tỏ đoạn gen gdhA ghép nối vào vector pRTRA tạo cấu trúc CaMV35S::gdhA::35S Hình Kết cắt enzyme giới hạn BamHI NotI plasmid pRTRA7/3: Đường chạy 1: Vector pRTRA + gdhA cắt với BamHI NotI; đường chạy 2: Vector pRTRA7/3 mở vòng với BamHI NotI Vùng gen gdhA vector pRTRA+gdhA sau xác định trình tự cặp mồi CaMV35SF cmycR để đảm bảo thay đổi trình tự nucleotide gen vị trí ghép nối vào vector Kết xác định so sánh trình tự gen gdhA gắn điểm BamHI-NotI với gen gdhA xác định trình tự trước cho thấy hồn tồn khơng có sai khác nucleotide Đồng thời vị trí gắn gen với vùng CaMV35S 35Ster khơng có sai khác Plasmid pRTRA+gdhA tiếp tục sử dụng cho thí nghiệm Thiết kế vector biểu thực vật mang gen gdhA Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử dụng xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) dùng súng bắn gen Mỗi phương pháp chuyển gen có ưu, nhược điểm riêng tùy vào loài khác Trong phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đem lại hiệu cao tốn Một yếu tố quan định thành cơng thí nghiệm chuyển gen vào thực vật lựa chọn hệ vector biểu phù hợp Trong nghiên cứu này, hệ vector pCAMBIA lựa chọn để biểu gen gdhA thực vật Hệ thống pCAMBIA có ưu điểm như: (1) Có số lượng lớn E coli nên lượng DNA thu lớn; (2) Vùng replicon pVS1 cho mức độ ổn định cao Agrobacterium; (3) Kích thước nhỏ, 712 kb tùy thuộc vào plasmid; (4) Các điểm cắt enzyme giới hạn cho phép dễ dàng lắp ráp/ chèn gen quan tâm; (5) Chọn lọc vi khuẩn chloramphenicol kanamycin; (6) Chọn lọc thực vật hygromycin B kanamycin; (7) dễ dàng thiết kế cấu trúc dung hợp biểu với gen thị gusA (https://www.cambia.org) Đoạn cấu trúc biểu CaMV35S::gdhA::35S gắn có kích thước khoảng 2,2 kb chuyển vào vector biểu pCAMBIA1300 để tạo vector chuyển gen Kết kiểm tra vector pCAMBIA 1300 tái tổ hợp với cấu trúc CaMV35S::gdhA::35S thể hình 6A, plasmid pCAMBIA 1300 tái tổ hợp cắt với HindIII cho kết đoạn DNA kb với kích thước vector pCAMBIA 1300 đối chứng cắt mở vịng HindIII Trong đó, băng DNA phía có kích thước khoảng 2,2 kb đoạn 77 Pham Thi Hang et al cấu trúc biểu gồm kích thước đoạn gen gdhA 1,4 kb, promoter 35S khoảng 0,5 kb terminator khoảng 0,3 kb Kết chứng minh rằng, thiết kế vector biểu pCAMBIA1300 mang gen gdhA (pCAM/35S-gdhA) Sơ đồ cấu trúc biểu mang gen đích gdhA cấu trúc mang gen Hyg thị chọn lọc thực vật thể hình 6B (B) (A) Hình (A): Kiểm tra vector biểu thực vật mang gen gdhA: Đường chạy 1: Vector pCAMBIA1300 mở vòng với HindIII; Đường chạy 2: Vector pCAMBIA1300 - gdhA cắt với HindIII; (B): Sơ đồ vector pCAM/35S-gdhA Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCAMBIA1300-gdhA Hình Kiểm tra có mặt gen gdhA vi khuẩn A tumefaciens: (+): PCR từ plamid đối chứng dương; 1–8: PCR từ dịng khuẩn lạc A tumefaciens Với mục đích chuyển gen vào thực vật, chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 tái tổ hợp mang cấu trúc biểu gen (Ti-plasmid) tạo phương pháp xung điện Các thể biến nạp sau sàng lọc mơi trường ni cấy có bổ sung chất kháng sinh kanamycin (100 µg/ml) tiếp tục kiểm tra có mặt vector biểu 78 gen phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết PCR thể hình cho thấy số dịng lựa chọn cho kết dương tính với gen gdhA Kết chứng tỏ dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu có chứa gen gdhA Đây nguồn nguyên liệu sử dụng cho thí nghiệm nhằm chuyển gen gdhA vào thực vật Chuyển gen vào thuốc mơ hình N tabacum K326 Để kiểm tra hiệu việc thiết kế vector biểu thực vật mang gen gdhA, thí nghiệm chuyển gen gdhA vào thuốc mơ hình N tabacum K326 thực Kết chuyển gen gdhA vào thuốc thể bảng Sau ba lần lây nhiễm, thu 20 thuốc chuyển gen T0 Tất đánh số kiểm tra có mặt gen gdhA kỹ thuật PCR Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli Bảng Kết chuyển gen vào thuốc mơ hình N tabacum K326 Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi tái sinh Số thu 100 74 37 20 Khi phát triển bình thường, mẫu non tất thuốc chuyển gen thu ngẫu nhiên để tách chiết DNA tổng số PCR kiểm tra Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR thực sử dụng hai cặp mồi: Cặp mồi Hpt F/R nhân đoạn gen mã hoá cho gen thị kháng Hygromycin cặp mồi nhân gen đích gdhABamHIF/NotIR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình Kết điện di cho thấy, PCR với cặp mồi HptF/R có mẫu: 10, 13, 15 18 (tương ứng với đường chạy: 4, 5, gel agarose) xuất băng DNA có kích thước (A) tương đương với đối chứng dương, khi PCR cặp mồi nhân gen đích có mẫu xuất đoạn DNA có kích thước tương đương với kích thước sản phẩm PCR mẫu đối chứng dương (mẫu số 15 18 tương ứng với đường chạy số gel agarose) Như vậy, khẳng định rằng, 20 mẫu non thu mẫu mang cấu trúc biểu gen gdhA: Số 15 số 18 Các dương tính với phản ứng PCR giữ lại, tiếp tục quan sát phục vụ phân tích, đánh giá khả hoạt động biểu gen (B) Hình Kết kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc chuyển gen T0 PCR, (A): PCR kiểm tra cặp mồi nhân gen Hygromycin (HptF/R): (-): PCR từ nước, (+): PCR từ plasmid pCAM1300_gdhA; WT: PCR từ DNA tổng số thuốc không chuyển gen; 1–8: PCR từ DNA tổng số số thuốc chuyển gen gdhA (tương ứng với cây: 1, 4, 7, 10, 13, 15, 18); (B): PCR kiểm tra cặp mồi nhân gen gdhA: (-): PCR từ nước, (+): PCR từ plasmid pCAM1300_gdhA; WT: PCR từ DNA tổng số thuốc không chuyển gen; 1–8: PCR từ DNA tổng số số thuốc chuyển gen gdhA (tương ứng với cây: 1, 4, 7, 10, 13, 15 18) Hình Kết kiểm tra gen gdhA thuốc T0 RT-PCR: (+): PCR từ plasmid pCAM1300_gdhA; (-): PCR từ nước; 1–2: RT-PCR từ cDNA thuốc chuyển gen gdhA 15 18 Tuy nhiên, PCR dương tính khơng đồng nghĩa với chuyển gen thành cơng có nhiều cách để giải thích có mặt DNA mẫu phân tích: (1): Trong nghiên cứu chuyển gen nhờ A tumefaciens, loài vi khuẩn thường tồn lâu dài mô tế bào thực vật trả qua trình loại bỏ vi khuẩn chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen (2): Gen chuyển tồn tự tế bào chất, biến qua sinh sản hữu tính, (3): Gen chuyển khơng biểu thành protein có chức sinh học Do đó, kỹ thuật RT-PCR sử dụng để xác định khả hoạt động gen gdhA thuốc chuyển gen dương tính với phản ứng PCR Đây kỹ thuật cho phép phát biểu gen chuyển thông qua hoạt động phiên mã gen ngoại lai thuốc chuyển gen Các tổng thuốc tách chiết RNA số, thực tổng hợp cDNA sợi 79 Pham Thi Hang et al thứ theo kit hãng Affymetrix sau tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gdhABamHIF/gdhANotIR Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 0,8% (hình 9) Kết điện di cho thấy, đường chạy xuất đoạn DNA với kích thước tương đương với kích thước mẫu đối chứng Như vậy, hai thuốc chuyển gen T0 chuyển gen dương tính với PCR mang gen hoạt động phiên mã tạo sản phẩm mRNA Hai thuốc chuyển gen gdhA hệ T0 dương tính với phản ứng RT-PCR tiếp tục theo dõi phục phân tích tiếp Các nghiên cứu giới cho thấy suất trồng bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khách quan bên ngồi Một số hạn hán ức chế phát triển làm giảm trình quang hợp Lightfoot et al (2007) nghiên cứu biểu gen gdhA E coli mã hoá cho enzyme GDH phụ thuộc NADPH ngô gen gdhA giúp ngô tăng suất vài năm, đặc biệt môi trường stress hạn, tăng suất cải thiện khả chịu đựng stress hạn ngô chuyển gen gdhA Các tác giả ngô chuyển gen gdhA có khả chịu nước ngày, đồng thời khả quang hợp chuyển gen gdhA điều kiện hạn không giảm nhiều khơng chuyển gen q trình quang hợp bị giảm đáng kể Hơn nữa, nghiên cứu trước Mungur cộng (2006) thuốc chuyển gen gdhA có khả chịu đựng nước tốt không chuyển gen Cơ chế để gen gdhA giúp tăng cường khả chịu đựng thiếu nước thực vật liên quan đến thay đổi lượng glutamate trình trao đổi chất Trong nghiên cứu Ameziane et al (2000) Mungur et al (2005) cho thấy rễ thuốc chuyển gen gdhA nồng độ hầu hết amino acid tự nhiều gấp dơi so với bình thường Các acid amin tăng lên chuyển gen gdhA liên quan đến tăng glutamate, proline arginine chất có hiệu ảnh hưởng đến chất thẩm thấu, điều giải thích 80 phần việc trì nước chuyển gen gdhA điều kiện stress nước Tuy nhiên, ảnh hưởng gián tiếp sinh trưởng trao đổi chất ảnh hưởng đến khả chịu đựng thiếu nước trình phức tạp GDH-NADPH biểu tế bào chất chuyển gen, gen nội sinh tổng hợp enzyme tế bào chất sau chuyển đến ty thể lục lạp Các nghiên cứu tương lai với chuyển gen gdhA tập trung xác định xem chất chuyển hoá bị thay đổi chất liên quan đến khả chống chịu nước Như vậy, gen gdhA E coli cải biến để phù hợp với hệ gen thực vật, chuyển gen gdhA cải biến vào mơ hình thuốc lá, kiểm tra hoạt động gen gdhA mức độ phiên mã KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, gen gdhA mã hoá cho NADPH-GDH từ chủng E coli JM109 phân lập tạo dịng thành cơng Đồng thời, gen gdhA cải biến cho phù hợp thực vật tái tổ hợp thành công vector biểu pCAMBIA1300 điều khiển promoter CaMV35S, tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen thực vật Kết chuyển gen gdhA vào thuốc mơ hình N tabacum K326 thu 20 tái sinh tiến hành chọn lọc thu (cây số 15 số 18) có kết dương tính với PCR cặp mồi nhân gen đích gdhABamHIF/gdhANotIR Sự hoạt động gen gdhA mức độ phiên mã kiểm chứng với RT-PCR Kết bước đầu cho thấy cấu trúc biểu gen gdhA vector pCAM/35S-gdhA mà chúng tơi thiết kế hoạt động đích Các thí nghiệm chuyển gen vào đích để kiểm tra hoạt động gen gdhA đích kiểm tra mức độ phiên mã, dịch mã đánh giá tính chịu hạn nhân tạo đích Lời cảm ơn: Cơng trình thực Viện nghiên cứu hệ gen với kinh phí từ đề tài cấp nhà nước “Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E coli gen”do Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn quản lý phần từ nguồn kinh phí cấp sở TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdullah A Y., Obeidat B S., Muwalla M M., Matarneh S K., Ishmais M A A., 2011 Growth performance, carcass and meat characteristics of black goat kids fed sesame hulls and Prosopis juliflora pods Asian-Aust J Anim Sci., 24(9): 1217– 1226 Allen G Good, Steven T Zaplachinski, 1994 The effects of drought stress on free amino acid accumulation and protein synthesis in Brassica napus Physiologia Plantarum, 90: –14 Ameziane R., Bernhardt K., Lightfoot D A., 2000 Expression of the bacterial gdhA gene encoding a glutamate dehydrogenase in tobacco and corn increased tolerance to the phosphinothricin herbicide MartinsLoucao MA, Lips SH (eds) Nitrogen in a sustainable ecosystem, from the cell to the plant 339–343 Ameziane R., Bernhard K., and Lightfoot D., 2000 Expression of the bacterial gdhA gene encoding a NADPH glutamate dehydrogenase in tobacco affects plant growth and development Plant and Soil, 221(1): 47–57 Aubert D., Chen L., Moon Y H., Martin D., Castle L A., Yang C H., and Sung Z R., 2001 EMF1, a novel protein involved in the control of shoot architecture and flowering in Arabidopsis The Plant Cell, 13(8): 1865–1875 Battraw M J., Hall T C., 1990 Histochemical analysis of CaMV 35S promoter-β-glucuronidase gene expression in transgenic rice plants Plant Molecular Biology, 15: 527–538 Belkheiri O., Mulas M., 2013 The effects of salt stress on growth, water relations and ion accumulation in two halophyte Atriplex species Environmental and Experimental Botany, 86: 17–28 Dong J Z., Yang M Z., Jia S R., Chua N H., 1991 Transformation of melon (Cucumis melo L.) and expression from the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter in transgenic melon plants BioTechnology, 9: 858–863 Forde B G., and Lea P J., 2007 Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling J Exp Bot., 58(9): 2339–2358 Fry J., Barnason A., Horsch R.B., 1987 Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens-based vectors Plant Cell Reports, 6: 321–325 Jefferson R A., Klass M., Wolf N., Hirsh D., 1987 Expression of chimeric genes in Caenorhabditis elegans J Mol Biol., 193(1): 41–46 Lam H M., Hsieh M H., Coruzzi G., 1998 Reciprocal regulation of distinct asparagine synthetase genes by light and metabolites in Arabidopsis thaliana Plant J., 16: 345–353 Lightfoot D A., Bernhardt K., Mungur R.; Nolte S., Ameziane R., Colter A., Jones K., Iqbal M J., Varsa E C., Young B G., 2007 Improved drought tolerance of transgenic Zea mays plants that express the glutamate dehydrogenase gene (gdhA) of E coli Euphytica, 156: 106–115 Lindsey K., Gallois P., 1990 Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) by Agrobacterium tumefaciens J Exp Bot., 41: 529–536 Loulakakis K A., Primikirios N I Nikolantonakis M A., Roubelakis Angelakis K A., 2002 Immunocharacterization of Vitis vinifera L ferredoxin-dependent glutamate synthase, and its spatial and temporal changes during leaf development Planta, 215: 630–638 Mungur R., Glass A D., Goodenow D.; Lightfoot D A., 2005 Metabolite fingerprint changes in transgenic Nicotiana tabacum altered by the Escherichia coli glutamate dehydrogenase gene J Biomed Biotech., 198–214 81 Pham Thi Hang et al Mungur R., Wood A J., Lightfoot D A., 2006 Water potential is maintained during water deficit in Nicotiana tabacum expressing the Escherichia coli glutamate dehydrogenase gene Plant Growth Regulation, 50: 231–238 Noctor G., Veljovic-Jovanovic S D., Driscoll S., Novitskaya L., Foyer C H., 2002 Drought and oxidative load in the leaves of C3 plants: a predominant role for photorespiration Ann Bot Lond., 89: 841–850 Odell J T., Nagy F., Chua N H., 1985 Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter Nature, 313: 810–812 Rhodes C A., Pierce D A., Mettler I J., Mascarenhas D., Detmer J J., 1988 Genetically transformed maize plants from protoplasts Science, 240: 204–207 Rhodes D., Verslues P E., Sharp R E., 1999 Role of amino acids in abiotic stress resistance Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology, 319–356 Skopelitis D S., Paranychianakis N V., Paschalidis K A., Pliakonis E D., Yakoumakis D., Delis I D., Kouvarakis A., Papadakis A K., Stephanou E., Roubelakis-Angelakis K A., 2006 Abiotic stress generated ROS signal expression of anionic glutamate dehydrogenases to form 82 glutamate for proline synthesis Plant Cell., 18: 2767–2781 Stitt M., Muller C., Matt P., Gibon Y., Carillo P ,Morcuende R., Scheible W R., Krapp A., 2002 Steps towards an integrated view of nitrogen metabolism J Exp Bot., 53: 959–970 Terada R., Shimamoto K., 1990 Expression of CaMV 35S-GUS gene in transgenic rice plants Molecular and General Genetics, 220: 389–92 Topping J.F 1998 Tobacco transformation Methods Mol Biol., 81: 365–372 Visser R.G., Stolte A., Jacobsen E., 1991 Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants Plant Mol Biol., 17(4): 691–699 Wooton J C., 1983 Reassessment of ammonium ion affinities of NADPspecific glutamate dehydrogenases: activation of the Neurospora crassa enzyme by ammonium and rubidium ions Biochem J., 209: 527–531 Yang N S., Christou P., 1990 Cell type specific expression of a CaMV 35S-gus gene in transgenic soybean plants Developmental Genetics, 11: 289–293