khảo sát qui trình chiết tách ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

khảo sát qui trình chiết tách ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa nên có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài, bao gồm hơn 300 họ và 1.200 chi Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh Các loại thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ và ít độc hại cho người sử dụng Chúng được dùng như tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chất chuẩn để phát triển các loại thuốc mới Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũng như hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng một cách hợp lý và có hiệu quản nhất nguồn tài nguyên thiên nhiên này.

Chi Croton là một chi lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) và được quan tâm nghiên cứu trên thế giới Chính vì hoạt tính lý thú của các ent-kauran diterpenoid từ cây khổ sâm Bắc Bộ Croton tonkinensis (Euphorbiaceae) mà luận văn này có các nhiệm vụ

3. Tiến hành thử hoạt tính sinh học với các sản phẩm chuyển hóa nhận được.

Chương 1TỔNG QUAN

1.1 Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.)

1.1.1 Thực vật học [1, 2]

Cây khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep thuộc họ

Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Hình 1: Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

Khổ sâm Bắc Bộ là cây nhỏ, cao độ 0,7-1 m Lá mọc cách hay gần như mọc đối, có khi mọc thành vòng giả gồm 3-6 lá Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm, rộng 1-3 cm Cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót) nhưng mặt dưới nhiều hơn ở mặt trên Khi phơi khô mặt lá ở dưới có màu trắng bạc, mặt trên

có màu nâu đen Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành, lưỡng tính hay đơn tính Hoa đực có 5 lá đài,12 nhị Hoa cái có 5 lá đài, 3 vòi nhị Quả gồm 3 mảnh vỏ màu hung đỏ.

1.1.2 Nơi sống và thu hái [1]

Cây khổ sâm Bắc Bộ mọc hoang và được trồng ở khắp nơi, trong các vườn gia đình hoặc vườn thuốc, chủ yếu ở các tỉnh phía bắc Việt Nam Thường trồng bằng gieo hạt hay trồng bằng cành vào mùa xuân Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng.

1.1.3 Hoạt tính và công dụng của cây khổ sâm Bắc bộ [1, 2]

Cây khổ sâm Bắc Bộ được dùng trong dân gian làm thuốc chữa mụn nhọt, lở ngứa, viêm mũi, lỵ, đau bụng, viêm loét dạ dày, tá tràng, tiêu hoá kém Ngày dùng 15-20 lá sao vàng, dạng thuốc sắc, dụng ngoài lấy nước sắc đặc để rửa Gần đây, cây khổ sâm Bắc Bộ được chú ý nhiều do lá cây dùng trong đơn thuốc chữa bệnh đau dạ dày

kết hợp với các vị thuốc khác (lá bồ công anh Lactuca indica và lá khôi Ardisia sylvestris) hoặc dùng riêng dưới dạng nước sắc

Nước sắc khổ sâm Bắc Bộ trong thực nghiệm có tác dụng kháng một số nấm ngoài da Khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng kháng sinh đối với trực khuẩn lỵ đồng thời có tác dụng kháng lỵ amip, làm cho đơn bào co thành kén Tác dụng đối với ký sinh trùng sốt rét: nước sắc của bài thuốc gồm Khổ sâm và vỏ Bưởi có tác dụng ức chế ký sinh trùng sốt rét mạnh trên động vật thí nghiệm được gây nhiễm sốt rét, nhưng tái phát trong thời

gian 10 ngày theo dõi trên mô hình thực nghiệm chuột nhắt nhiễm Plasmodium berghei và gà nhiễm Plasmodium gallinaceum.

1.1.4 Các ent-kauran diterpenoid của cây khổ sâm Bắc bộ

Năm 2000, Phan Tống Sơn và cộng sự đã công bố quốc tế một diterpen mới từ lá cây khổ sâm Bằng các phương pháp phổ đã xác định cấu trúc của diterpen này là

ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl axetat (1) [5, 33] Chất này có hoạt tính kháng

kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro Nhóm tác giả trên tiếp tục đánh giá hoạt tính của diterpen với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (với cả chủng

nhạy và chủng kháng cloroquin) tác dụng gây độc đối với một số tế bào ung thư G2, RD, FI, VR), tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định [7].

Trong nghiên cứu tiếp theo của Phan Minh Giang và cộng sự [19] bốn

ent-kaurane diterpen gồm hai chất đã biết, ent-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (2) và ent-18-acetoxy-7α-hydroxykaur-16-en-5-one (3) và hai chất mới, ent-1β-acetoxy-7α, 14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (4) và ent-18-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (5) đã được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ Các ent-kauranoid này ức chế

nhân tố phiên mã NF-ĸB và sự sản xuất NO được hoạt hoá bằng LPS trong đại thực bào RAW264.7 của chuột ở IC50 = 0,07 - 0,42 µg/ml

OHOR3

Tiếp đó, Phan Minh Giang và cộng sự đã công bố cấu trúc của 4 ent-kauran

diterpen mới, ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (7), diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (8), ent-18-acetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (9) và ent-(16S)-18-acetoxy-7β-hydroxy kauran-16-en-15-one (10) [20].

10

Năm 2005, có 6 ent-kauran diterpenoid mới được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc

Bộ đó là các chất ent-7β -acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (11), acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (12), ent-11α-acetoxykaur-16-en-18-oic acid (13), ent-15α,18-dihydroxykaur-16-ene (14), ent-11α,18-diacetoxy-7β -hydroxykaur-16-

ent-18-R1 R2 R3 R4

en-15-one (15), and ent-(16S)-1α,14a-diacetoxy-7β -hydroxy-17-methoxykauran-15-one

(16) [21].

Ba diterpenoid với cấu trúc ent-kaur-16-ene, en-11α-acetoxy-7β, 14α

dihydroxykaur-16-en-15-one (17), ent-18–hydroxykaur-16-ene (18) và ent-kaur-16-

en-15-oxo-18-oic acid (19) đã được phân lập từ phần chiết metanol lá khô cây khổ sâm

Bắc Bộ bằng phương pháp tách sắc ký cột lần lượt trên silica gel, ODS gel, và HPLC pha đảo [18].

AcO

17 18 191.2 Vài nét về terpen và diterpen [3, 25]

Khái niệm “terpen” được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên có cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành người ta phân biệt các monoterpen C10, sesquiterpen C15, diterpen C20, sesterterpen C25, triterpen C30, tetraterpen C40 và polyterpen.

Bên cạnh thuật ngữ “terpen” người ta còn dùng khái niệm “terpenoit” để bao hàm rộng rãi các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon và các dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ các terpen - ancol, -andehit, -xeton, - axit, - este, - epoxit, v.v… Tuy nhiên trong khi sử dụng thường không có sự phân chia ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và “terpenoid” như vừa nêu Thuật ngữ terpen nhiều khi được dùng để bao hàm các terpen – hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng

Các diterpenoid hợp thành một nhóm lớn các hợp chất C-20 được dẫn ra từ geranyl geraniol pyrophotphat Chúng chủ yếu xuất hiện trong các loài nấm hoặc trong thực vật và bao gồm các axít nhựa và các hocmon sinh trưởng thực vật nhóm gibberellin.

Các diterpenoid có một số nét riêng đặc trưng Sự oxi hoá thường hay xảy ra hơn ở các nhóm trong phân tử và ta thấy xuất hiện nhiều phản ứng tạo ete hoặc lacton Các tương tác giữa các nhóm không liên kết trực tiếp với nhau thường làm cho khung cacbon bị biến dạng và dẫn tới nhiều chuyển vị lý thú.

Đa số các diterpen là hợp chất vòng Đối với các diterpen chủ yếu kiểu đóng vòng để hình thành các dẫn xuất của perhidronaphtalen và perhidrophenantren Có hai kiểu đóng vòng :

Kiểu 1: Đóng vòng do sự proton hoá nối đôi của đơn vị isopropyliden xuất phát

Kiểu thứ nhất thuộc về cùng dãy lập thể với steroid.

Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho một cacbacation và khai mào cho

phản ứng đóng vòng.

Từ các tiền thân không vòng, thông qua các kiểu đóng vòng khác nhau mà dẫn đến các hệ thống khung vô cùng phong phú của các terpen cũng như diterpen Chẳng hạn ngày nay ta đã biết đến trên 170 khung cacbon của các diterpen, trong số đó có 7 khung (hình 1) chiếm khoảng 50% các diterpen được biết, khung labdan chiếm số lượng lớn nhất.

pimaran abietan gibberellan

Hình 2: Một số khung của các diterpen Các diterpen có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú:

Điển hình là các hocmon sinh trưởng thực vật dãy gibberellin Người ta đã phân

lập và tinh chế được axít gibberellic từ nấm Gibberella fujikuroi tác dụng đặc trưng cho

sự phát triển bình thường của cây.

Các axít nhựa thuộc vào số các sản phẩm thiên nhiên xuất hiện với lượng lớn Chúng có tác dụng cố kết các sợi gỗ, đặc biệt là các axít nhựa có nhóm phenolic có hoạt tính kháng sinh nhẹ và bảo vệ cho gỗ khỏi bị vi sinh vật làm mục nát (axít podocarpic và axít ferruginol) Nhựa copan hình thành khi một số cây nhiệt đới mục nát có tác dụng bảo vệ cây.

Diterpen pleu-romutilin phân lập từ cây Pleurotus mutilus có hoạt tính kháng

khuẩn.

Ngoài ra nhiều hợp chất diterpenoid còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u (ví dụ quinon-methin), hoặc là những hợp chất có độc tính nguy hiểm (ví dụ taxin 1 ở cây thuỷ tùng).

Từ nhựa của Fabiana densa Remy var ramulosa Wedd đã tách được hai diterpen

mới: ent-beyer-15-en-18-O-succinat (20) và ent-beyer-15-en-18-O-oxalat (21) Hai hợp

chất này có hoạt tính kháng vi trùng đối với Escherichia coli (ATCC 8739), Klebsiella pneumoniae, Salmonella aviatum (ATCC 2228), Pseudomonas aerug-inosa (ATCC 14207), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Micrococeus flavus (ATCC 10290), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Saccharomyces cerevisiae [16].

R O H2C

Phần chiết CH2Cl2 của lá Croton zambesicus (Euphorbiaceae) gây độc tế bào đối

với dòng tế bào ung thư biểu mô tử cung Từ phần chiết này đã tách được một

trachyloban diterpen, ent-trachyloban-3β-ol (22) với hoạt tính độc tế bào dòng tế bào

Hela, IC50=7,3 µg/ml [14].

22

1.3 Khái quát về kauran và ent-kauran

Các kauran tồn tại ở hai dạng: dạng ent và phyllocladane Phần lớn kauran ở dạng ent, ít phổ biến hơn là phyllocladan có cầu metylen ở vị trí đối diện so với nhóm metyl ở

C-10

4 5 6 78910

11 121316

4 5 6 7910

11 121316

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

GGPP (-)-copalyldiphosphat

2 Enzym ent-kaurene synthase (B) xúc tác để (-)-copalyl PP (ent-copalyl

diphosphat) tiếp tục đóng vòng và phân bố lại.

GGPP i

GGPP i

( ) copalyl diphosphat( )

1.3.2 Các nghiên cứu chuyển hóa các ent-kauran diterpenoid

Năm 2007, Ronan Batista cùng các đồng sự đã tổng hợp thành công một

ent-kauran glycosid mới bằng phản ứng Koeings-Knorr từ axit kaurenoic và acetyl-glucopyranosyl bromid, theo sự thủy phân nhóm axetat [13].

2,3,4,6-tetra-O-Hình 3: Sơ đồ tổng hợp alcol kauran 25 và 26

Hình 4: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 32a/b từ alcol kauran 25

Hình 5: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 33-38 từ alcol kauran 26

Năm 2008, Silvia Marquina cùng với các cộng sự đã tiến hành hydroxyl hóa các

diterpen axit ent-kaur-16-en-19-oic và axit ent-beyer-15-en-19-oic bằng phương pháp vi sinh sử dụng vi nấm Aspergillus niger [29].

Aspergillus niger

Hợp chất Eriocalyxin B (39) được phân lập từ loài Isodon (Rabdosia), sau đó

được các nhà hóa học Trung Quốc tiến hành chuyển hóa tạo thành 19 dẫn xuất mới của Eriocalyxin B có tác dụng gây độc trên tế bào ung thư [42].

39

Hình 6: Sơ đồ chuyển hóa Eriocalyxin B

(a): NaBH4, MeOH, 1:1; (b) NaBH4, MeOH, 1:3; (c) H2, Pd/C

46: R=CH2Br

47: R=CH2=CH2

Hình 7: Sơ đồ chuyển hóa Eriocalyxin B

(a): PCC, CH2Cl2; (b): tác nhân Jones, axeton; (c): Ac2O, BF3.Et2O, THF; (d): axyl clorid, NaH, pyridin, THF; (e): Ac2O, DMAP, pyridin

Năm 2005, Liang Xu đã tiến hành bán tổng hợp ent-karan (55) theo hướng epoxi

hóa nối đôi của ent-kauran diterpenoid, thông qua 7 bước bao gồm các phản ứng: aldol

hóa, epoxi hóa, oxi hóa và quá trình Baeyer–Villiger thu được sản phẩm dioxan đạt hiệu suất 19% [39].

Ent-kauran (55) được phân tách từ phần chiết etanol của lá cây Isodon eriocalyx.

55

Hình 9: Sơ đồ chuyển hóa ent-kauran 55

Năm 2002, Bruno cùng với các cộng sự đã tiến hành các chuyển hóa bán tổng

hợp từ linearol (68) thu được các dẫn xuất ent-kauran [15].

H2/Pd, C

Hình 10: Sơ đồ chuyển hóa bán tổng hợp linearol tạo thành các ent-kauran

1.3.2 Hoạt tính sinh học của các ent-kauran diterpenoid tự nhiên và bán tổng hợp

Các ent-kauran tự nhiên có hoạt tính sinh học rất rõ rệt Một số ent-kauran

diterpenoid thể hiện tính kháng khuẩn như axit kaurenic, có khả năng ức chế vi khuẩn Gram (+) Ví dụ như diterpen kauran axit (ent-16-kauren-19-oic axit) dùng để khử trùng, chữa cảm lạnh và cúm [36]

Một số ent-kauran diterpenoid thể hiện hoạt tính gây độc tế bào như ent-kauran diterpenoid từ cây I eriocalyx var laxiflora Mười hợp chất này được thử độc tính trên

tế bào u ở người K562, T24 là laxiflorin E, laxiflorin C, eriocalyxin B thử trên dòng K562 (IC50 = 0,077; 0,569 và 0,373 µg/ml), còn hợp chất laxiflorin E và eriocalyxin thử

trên dòng T24 (IC50 = 0,709 và 0,087 µg/ml) còn laxiflorin D và maocrystal đều có hoạt tính chống lại cả hai dòng tế bào ung thư trên với giá trị IC50 nhỏ hơn 6,5 µg/ml [31].

Hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane-19-oic acid (75) được tách từ quả

Annona squamosa có hoạt tính chống sự sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với giá

trị ED50 = 0,8 µg/ml [35].

Hình 11: Các ent-kauran từ quả Annona squamosa

Năm 1999, các nhà khoa học Đức nghiên cứu loài Địa tiền Lepidolaena taylorii

đã phân lập được bốn hợp chất secokauran mới gây độc tế bào, 11 hợp chất

8,9-seco-kauran (88) và 6 hợp chất có cấu trúc của kauren-15-on Hợp chất 8,9-secokauran (88) là hợp chất gây độc tế bào chính cùng với dẫn xuất dihydro và epoxy (89 và 90) ít

độc hơn ở nồng độ thấp hơn [32].

4 510 9

88 89 90

Từ phần chiết etyl axetat của Isodon sculponeata đã tách được 4 ent-kauran

diterpenoid mới, các sculponeatin F-1 (91-94) và 6 hợp chất ent-kauran diterpenoid đã

biết (95-100) Hợp chất 93, 94, 96, 97, 100 có ảnh hưởng ức chế trực tiếp lên dòng tế

bào ung thư K562, IC50=3,2 µg/ml ÷ 8,2 µg/ml Hợp chất 91, 96 ức chế dòng tế bào ung

thư T24 với giá trị IC50 = 18,3 µg/ml và 15 µg/ml Không có hợp chất nào trong số các hợp chất trên gây độc đối với dòng tế bào A549 [26].

4 567

8910 11

12131415 16

18 1920

91 R1= H, R2= OH, R3= α-OH 9293 R1= H, R2= α-OH, R3= =O

95 R1= OH, R2= H, R3= α-Oac 94 R1= OH, R2= H, R3= =O

96 R1= H, R2= OH, R3= =O 99 R1= H, R2= H, R3= =O

97 R1= H, R2= OH, R3= α-OH 100 R1= H, R2= H, R3= α-OH

98 R1= OH, R2= H, R3= =O 101 R1= H, R2= β-OH, R3= =O

Hình 12: Các ent-kauran từ Isodon sculponeata

Các nhà khoa học Trung Quốc đã tách một ent-kauran diterpen, pseudoirroratin A

và một diterpen đã biết, pseurata A Hợp chất pseudoirroratin A gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư Lu1, SW626, LNCaP, KB, và HOS với giá trị IC50 = 0,26 (0,75),

pseudoirroratin A

Từ ngọn của cây Isodon adenantha ở Trung Quốc đã tách được 11 diterpenoid

mới, các adenanthin B-L (102-112), cùng 5 hợp chất khác, calcicolin B (113), adenanthin (114), weisiensin A (115), nervosanin (116) và forrestin C (117) Hợp chất 103, 104, 115 có hoạt tính ức chế lên dòng tế bào K562 với IC50 là 3,3; 3,6 và 3,3 µg/ml [27].

105 R1 = OH R2 = = O

Hình 13: Các ent-kauran từ Isodon adenantha

Các nhà khoa học bang Carolina đã tiến hành chuyển hóa bán tổng hợp từ linearol

thu được 26 dẫn xuất ent-kauran Các dẫn xuất này đã được nghiên cứu cho hoạt tính

chống HIV Kết quả là 5 hợp chất 118, 119, 120, 121 và 122 có hoạt tính chống lại sự

sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với giá trị EC50 = 0,1 - 3,11 µg/ml và TI là 163

và 184 Hợp chất 118, 121 trong tương lai có thể phát triển như là tác nhân chống ung

Hình 14: Các ent-kauran bán tổng hợp từ linearol

Từ phần chiết etanol của lá Isodon xerophilus đã tách được 3 ent-kauran

diterpenoid (các xerophilusin L-N, 123-125) và ponicidin (128) Hợp chất 128 có khả

năng gây độc tế bào mạnh nhất lên hai dòng tế bào ung thư K562 và T24 với giá trị IC50

lần lượt là 0,09 và 0,32 µg/ml Hợp chất 125 gây ảnh hưởng ức chế yếu IC50 > 15,6 µg/ml [28].

125 128

Hai diterpen axit spasmolytic, ent-kaur-16-en-19-oic acid (129) và en-19-oic acid (130) đã được tách ra từ thân của Viguiera hypargyrea có hoạt tính chống lại Staphylccoccus aureus, Enterococcus feacalis và Candida albicans Hợp chất 130 ức

ent-beyer-15-chế ở nồng độ 63,54% và không phụ thuộc vào nồng độ, giá trị ED50 = 4,9 µg/ml Hợp

chất 129 thể hiện ức chế ở 8,04%, liều dùng là 10 µg/ml [40].

Nghiên cứu hóa thực vật thân của Bruguiera gymnorrhiza tách được 3 ent-kauran

diterpenoid mới, 13, 16α, trihydroxy-ent-9(11)-kauren-19-oic acid (131), 16 α, dihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-al (132), 17-chloro-13, 16α -dihydroxy-ent-kauran-19-al (133) cùng 9 hợp chất ent-kaurane diterpen đã biết Hầu hết các hợp chất được thử

17-độc tế bào với dòng tế bào L-929, K562 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Các

hợp chất 16αH-17,19-ent-kauranediol (134), 13-hydroxy-ent-kauren-19-al (135), ent-kauren-19-ol (136) chống lại hai dòng tế bào ung thư K562 và L-929 Hợp chất 16-ent-kauren-19-ol (136) chọn lọc nhất cho hoạt tính này IC50 = 6,8 µg/ml [23].

16-Các loài Rabdosia ở Trung Quốc được sử dụng trong y học cổ truyền như tác

nhân chống ung thư và chống viêm nhiễm Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu

thành phần hóa học của lá và thân cùng các hoạt tính sinh học đối với các loài Rabdosia khác nhau, đặc biệt là Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara Các kauran diterpen như

oridonin (137) và ponicidin (138) là những chất độc tế bào chính trong các loài

137 138

Các hợp chất 139, 140, 144, 145 và 146 tách ra từ ngọn của Isodon enanderianus

gây độc tế bào mạnh lên dòng tế bào K562 với IC50 lần lượt là 0,67; 0,16; 0,59; 0,13;

0,87 µg/ml Các hợp chất 141 và 142 không gây độc tế bào đối với dòng tế bào K562

6 78910

11 12 13

Hình 15: Các ent-kauran từ Isodon enanderianus

Năm ent-kauran diterpenoid mới, các ludongnin F-J (147-151) cùng với 10 hợp

chất đã biết, các guidongnin A-C (152-154), angustifolin (155), 6-epiangustifolin (156),

sculponeatin J (157) và gardenin D đã được tách ra từ lá của Isodon rubescens var lushiensis Tất cả các hợp chất 147-159 đã được đánh giá ảnh hưởng ức chế lên tế bào

lần lượt là 0,18; 0,30; 0,23; 0,87; 0,83; 0,25 µg/ml Trong khi các hợp chất còn lại

147-150, 153-154 không có hoạt tính (IC50 > 50 µg/ml) Điều này xác nhận rằng cấu hình cyclopentanon với một nhóm exomethylen là trung tâm hoạt động gây hoạt tính

Hợp chất 151 gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư gan CA và dòng tế bào ung thư

cổ tử cung Hela với giá trị IC50 lần lượt là 0,09 và 0,70 µg/ml [24].

152

Hình 16: Các ent-kauran tách ra từ lá Isodon rubescens var lushiensis

Năm 2006, lần đầu tiên trên thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococus aureus kháng methicillin đã được Phan Minh Giang và cộng sự thực hiện trên các ent-kauran diterpenoid được phân lập từ Croton tonkinensis [22] Các diterpenoid hoạt động nhất là ent-18-acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (MIC 32 µg/ml), ent-18-acetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one 32 (500 µg/ml) và ent-18-acetoxy-7β, 14α-

dihydroxykaur-16-en-15-one 32 (125 µg/ml).

metanol, rồi phân bố chọn lọc trong các dung môi thích hợp (n-hexan, diclometan) để

thu được các phần chiết.

2.1.2 Các phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây khổ sâm Bắc Bộ cũng như phân lập các chất đã sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và các phương pháp kết tinh phân đoạn.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, dày 0,2 mm (Merck) Hiện màu các vệt bằng thuốc thử dung dịch vanilin/H2SO4

1%, Dragendoff-Munier và soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Sắc ký cột (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi dưới áp suất khí quyển Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel Merck các cỡ hạt, được nhồi theo phương pháp nhồi ướt.

2.1.3 Các phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của hợp chất phân lập được đã được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ khối lượng (EI-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) là 1H NMR, 13C NMR, DEPT.

2.1.4 Điều chế các phần chiết từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Bột khô lá cây khổ sâm Bắc Bộ được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở nhiệt độ phòng Dịch chiết metanol được cất loại dung môi xuống còn 1/10 thể tích rồi pha loãng bằng nước cất theo một tỷ lệ thích hợp Dịch metanol-nước được chiết lần lượt với

dung môi không hoặc ít phân cực như n-hexan, diclometan Sau khi được làm khô, cất

loại dung môi các dịch chiết cho các phần chiết tương ứng n-hexan, diclometan (D).

Sơ đồ 1: Qui trình chiết lá cây khổ sâm Bắc BộBột lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Phần bã

Dịch nước

Phần chiết n-hexan (H)

Phần chiết MeOH

1 Chiết với metanol2.Gộp cô dung môi

1.Chiết với n-hexan

2 Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4

3 Cất loại dung môi

1.Chiết với diclometan

2 Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4

3 Cất loại dung môi

2.2 Qui trình phân lập các ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

Để phân lập các ent-kauran diterpenoid, ta đi từ phần chiết D (xem 3.3.2).

15 gam phần chiết D được tẩm với 10 gam silica gel (Merck, 0,063-0,100mm)

thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu sẫm Phân tách hỗn hợp này bằng sắc ký cột (CC) với

hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton thu được 8 phân đoạn từ D1 đến D8 Nhóm phân

đoạn D2 sau đó được phân tách lại bằng sắc ký cột thường (CC) trên chất hấp phụ silica

gel (Merck, 0,063–0,200mm) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton, ta thu được 3

nhóm phân đoạn D2.1, D2.2, D2.3 Nhóm phân đoạn D2.2 thấy có tinh thể hình kim màu trắng kết tinh, lấy ra kết tinh lại trong axeton thu được một chất tinh khiết CH1 (1) Nhóm phân đoạn D2.3 thu được một hỗn hợp hai tinh thể đồng kết tinh rất khó tách ký hiệu là hỗn hợp 2 chất CH2 (7) và CH3 (8).

4 5 6 78910

1 7 8

Sơ đồ 2: Qui trình phân tách phần chiết diclometan (D)

CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm), 80 pđ (150 ml/ pđ)

Rửa, n-hexan - axeton

Kết tinh lại, axeton

D (

15 g)

1 – 25

CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm),35 pđ (15 ml/ pđ)

7 + 8