Qui trình chiết tách và chuyển hóa ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ
MỤC LỤC
Các nghiên cứu chuyển hóa các ent-kauran diterpenoid
Năm 2007, Ronan Batista cùng các đồng sự đã tổng hợp thành công một ent- kauran glycosid mới bằng phản ứng Koeings-Knorr từ axit kaurenoic và 2,3,4,6-tetra-O- acetyl-glucopyranosyl bromid, theo sự thủy phân nhóm axetat [13]. Năm 2008, Silvia Marquina cùng với các cộng sự đã tiến hành hydroxyl hóa các diterpen axit ent-kaur-16-en-19-oic và axit ent-beyer-15-en-19-oic bằng phương pháp vi sinh sử dụng vi nấm Aspergillus niger [29]. Hợp chất Eriocalyxin B (39) được phân lập từ loài Isodon (Rabdosia), sau đó được các nhà hóa học Trung Quốc tiến hành chuyển hóa tạo thành 19 dẫn xuất mới của Eriocalyxin B có tác dụng gây độc trên tế bào ung thư [42].
Năm 2005, Liang Xu đã tiến hành bán tổng hợp ent-karan (55) theo hướng epoxi hóa nối đôi của ent-kauran diterpenoid, thông qua 7 bước bao gồm các phản ứng: aldol hóa, epoxi hóa, oxi hóa và quá trình Baeyer–Villiger thu được sản phẩm dioxan đạt hiệu suất 19% [39]. Từ phần chiết etyl axetat của Isodon sculponeata đã tách được 4 ent-kauran diterpenoid mới, các sculponeatin F-1 (91-94) và 6 hợp chất ent-kauran diterpenoid đã biết (95-100). Các nhà khoa học Trung Quốc đã tách một ent-kauran diterpen, pseudoirroratin A và một diterpen đã biết, pseurata A.
Từ phần chiết etanol của lá Isodon xerophilus đã tách được 3 ent-kauran diterpenoid (các xerophilusin L-N, 123-125) và ponicidin (128). Hai diterpen axit spasmolytic, ent-kaur-16-en-19-oic acid (129) và ent-beyer-15- en-19-oic acid (130) đã được tách ra từ thân của Viguiera hypargyrea có hoạt tính chống lại Staphylccoccus aureus, Enterococcus feacalis và Candida albicans. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của lá và thân cùng các hoạt tính sinh học đối với các loài Rabdosia khác nhau, đặc biệt là Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara.
Năm 2006, lần đầu tiên trên thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococus aureus kháng methicillin đã được Phan Minh Giang và cộng sự thực hiện trên các ent- kauran diterpenoid được phân lập từ Croton tonkinensis [22].
PHẦN THỰC NGHIỆM
Đối tượng và kỹ thuật thực nghiệm .1 Nguyên liệu thực vật
Trộn lẫn hai dung dịch A và B với nhau thu được dung dịch gốc có màu da cam. Dung dịch gốc này cần được bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng và để lạnh. Cách đưa chất lên lớp mỏng: lấy một lượng nhỏ cặn chiết hoà tan bằng 2 – 3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng capilla chấm chất lên lớp mỏng.
Các dung môi (n-hexan, axeton, clorofoc, benzen, và metanol) đều được làm khan và chưng cất lại. Lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình triển khai đáy bằng có nắp nhám kín. Để yên dung môi đến khi bão hoà mới sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng.
Cột tách sắc ký là một ống thuỷ tinh hình trụ, phía dưới có khoá. Dung môi sử dụng trong sắc ký cột là n-hexan, etyl axetat (EtOAc), toluen, axeton, clorofoc, metanol. Các dung môi đều được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong chai kín.
Chất cần phân tách bằng sắc ký cột được hoà tan trong dung môi, thêm một lượng nhỏ chất hấp phụ. Trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi, thu được một hỗn hợp ở dạng bột tơi. Khi đưa chất lên cột chất hấp phụ phải dàn đều và dùng bông thuỷ tinh hoặc cát phủ lên bề mặt chất.
Trong quá trình nhồi cột phải loại bỏ triệt để cỏc bọt khớ bằng cỏch cho dung mụi chảy qua cột nhiều lần và gừ nhẹ vào thân cột để cột được nén đều sau đó để yên qua đêm cho cột ổn định. TMS (tetrametyl silan) (1H NMR) hoặc tín hiệu của dung môi (13C NMR) là chất chuẩn nội.
Phân tách ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ
Phát hiện vệt chất trên lớp mỏng bằng ánh sáng tử ngoại, phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và thuốc thử Dragendorff-Munier. Phân tách hỗn hợp này bằng sắc ký cột (CC) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton thu được 8 phân đoạn từ D1 đến D8. Từ nhóm phân đoạn D2.3 thu được một hỗn hợp hai tinh thể đồng kết tinh không phân tách được bằng phương pháp sắc ký cột là 7 và 8.
Các phản ứng chuyển hóa các ent-kauran
Cho hỗn hợp sau phản ứng lên phễu chiết, lắc hỗn hợp với dung dịch NaHCO3. Làm khan dung dịch nhận được bằng Na2SO4, lọc và cất loại diclometan, thu được cặn thô. Sau khi phản ứng, thêm 30 ml nước cất vào hỗn hợp trên và cất loại metanol.
Rửa bằng nước đến pH = 7, gộp các dịch chiết diclometan lại, làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Thêm 0,2 ml anhidrit axetic, sau đó cho 0,5 ml pyridin (làm khan kỹ bằng KOH rắn và chưng cất trước khi dùng) vào bình phản ứng. Rửa bằng nước cất đến pH = 7, gộp các dịch chiết clorofoc lại, làm khan và cất loại clorofoc,.
Sau phản ứng đổ hỗn hợp phản ứng vào nước, chiết dung dịch thu được khoảng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH = 7. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các dẫn xuất
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm. Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU< 5. Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.