Quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa

Quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa

************************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY

HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY

XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY

HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY

XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum)

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

1 LỜI CẢM TẠ

Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những người thân đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người

Tôi xin gửi lòng biết ơn đến:

- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành biết ơn: - TS Phan Phước Hiền - Kỹ sư Trịnh Phi Ly

Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

- ThS Huỳnh Kim Diệu đã tận tình giúp đỡ trong việc lấy mẫu lá Xuân Hoa và đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn

- TS Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm

- Cô và Chú Đinh Công Bảy, chủ cơ sở trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã tận tình giúp đỡ và cung cấp số lượng lớn lá Xuân Hoa

Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

iv

TÓM TẮT

Đỗ Thị Tuý Phượng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 3/2007

“ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)

Giáo viên hướng dẫn: TS Phan Phước Hiền Đề tài được tiến hành tại:

- Phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

- Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007 Nội dung tiến hành:

- Tiến hành chiết tách các phân đoạn từ cao kháng khuẩn nhất bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn

này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa

- Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất

- Gửi mẫu chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất được tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội

- Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH Kết quả đạt được:

- Xác định được cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ ức chế tối thiểu là :

MICE coli = 500 µg/ml

- Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã địnhdanh đƣợc XH-K11 là

apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5

- Khảo sát tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng các phân tử ức chế DPPH là khá cao (85,7%), thông qua so sánh chỉ số IC50 của mẫu Xuân Hoa với Vitamin C:

IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml) IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml)

vi

SUMMARY

Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi MinhCity

“Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves”

Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City

Content:

- Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that

researching antibacterial property of these fractions for E coli, Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa

- Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions

- Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process Result:

- Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE coli = 500 µg/ml

MICsalmonella= 500 µg/ml

- Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin

7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside

- Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C):

IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml) IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml)

vii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm Tắt iv

Mục lục vii

Danh sách các chữ viết tắt xi

Danh sách các hình và biểu đồ xii

Danh sách các bảng và sơ đồ xiii

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Xuân Hoa 3

2.1.1 Đặc điêm thực vật học 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Phân bố 4

2.1.4 Nhân giống 4

2.2 Công dụng của cây Xuân Hoa 4

2.2.1 Theo kinh nghiệm dân gian 4

2.2.2 Tác dụng sinh học 5

2.3.1.1 Bảo vệ tế bào gan 5

2.3.1.2 Ảnh hưởng lên bệnh tiêu chảy ở heo 10

2.3 Thành phần hóa học 13

2.4 Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên 15

2.6 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 21

2.6.1 Staphyl ococcus aureus 21

2.6.2 Pseudomonas aeruginosa 21

2.6.3 Escherichia coli 21

2.6.4 Salmonella 22

2.7 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH 23

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 24

ix

3.4 Phương pháp tiến hành 28

3.4.1 Xử lý nguyên liệu 28

3.4.2 Điều chế các loại cao 28

3.4.2.1 Điều chế cao ete dầu hỏa 28

3.4.2.2 Điều chế cao chloroform 29

3.4.2.3 Điều chế cao n-butanol 29

3.4.2.4 Điều chế cao nước 29

3.4.3 Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao 31

3.4.4 Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform 32

3.4.4.1 Sắc ký cột 32

3.4.4.2 Sắc ký lớp mỏng 35

3.4.4.3 Sắc ký điều chế 37

3.4.4.4 Kỹ thuật kết tinh phân đoạn 38

3.4.5 Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn được tách chiết từ cao chloroform 38

3.4.6 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40

3.4.6.1 Các tính chất của gốc tự do DPPH 40

3.4.6.2 Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 44

4.2 Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng 45

4.2.1 Kết quả tách chiết của cao chloroform 45

4.2.2 Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13 47

4.5 Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa 55

4.5.1 Kết quả đo OD đối với vitamin C 55

4.5.2 Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa 56

xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa 3

Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê 29

Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký 33

Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E Coli 52

Hình4.5 : Các nồng độ kháng E coli của phân đoạn XH9 53

Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 54

Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 54

Đồ thị 4.1: Vitamin C 55

Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa 56

xiii

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột 7

Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lượng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng 9

Bảng 2.3: Hàm lượng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột 9

Bảng 2.4: Kết quả hàm lượng men gan 10

Bảng 2.5: Ảnh hưởng của lá tươi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trưởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo 11

Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy 12

Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm 39

Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa 42

Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C 43

Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao 44

Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform 45

Bảng 4.3: Nồng độức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn 53

Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C 55

Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa 56

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH 57

Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu 28

Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao 30

Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH 41

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) là một loại cây được dân gian

biết đến như là một dược liệu có thể chữa được rất nhiều căn bệnh: bệnh tiêu hóa, tiểu đường, trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh…Tuy nhiên, trên thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vẫn đề trên

Hiện nay trên thế giới chưa có một nghiên cứu nào sâu xa về cây này Các nhà khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bước đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó Trần Công Khánh và cộng sự (1999) đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính và có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hướng bảo vệ tế bào gan Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chưa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa được bệnh dịch tả Và gần đây, trong Hội Nghị Khoa Học và Công Nghệ Hóa Hữu Cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà Nội 11 – 2005, Phan Phước Hiền và cộng sự đã công bố công trình

phân lập Triterpenoid và Steroid từ lá cây Xuân Hoa Psenderanthemum palatiferum họ

Acanthaceae bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

Hiện nay, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trở nên rất phổ biến Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh nhiễm khuẩn

Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn như

các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…Vì thế trong công trình này chúng tôi cũng khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá Xuân Hoa

Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)”

1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Xác định được cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ cao chloroform

Xác định phân đoạn kháng vi khuẩn: E.coli, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa

Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn kháng khuẩn

Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá cây Xuân Hoa

1.2.2 Yêu cầu

Cô lập 4 loại cao: Ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol, nước Dùng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch để xác định cao có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất

Tiến hành sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để tách các phân đoạn và một số hợp chất từ lá Xuân Hoa

Sử dụng phương pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn được ly trích từ cao chloroform

Tiến hành ly trích lá cây Xuân Hoa và đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 517 nm [3] để xác định khả năng chống oxy hóa

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Xuân Hoa 2.1.1 Đặc điểm thực vật học [2]

Tên khoa học: Pseudranthemum palatiferum Họ: Ô rô (Acanthaceae)

Tên thông thường: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Tú Linh, Nhật Nguyệt, Thần Tượng Linh, Lan Điền,…

2.1.2 Đặc điểm hình thái [2, 6]

Cây có thể cao 1-2 m (nếu trồng trên đất vườn nhà), sống lâu năm Thân cây xanh hoặc tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều mảnh Lá mọc đối hình mũi mác, dài 12-17 cm, rộng 3,5-5 cm, gốc lá hơi men xuống

Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành Cụm hoa dài 10-16 cm Hoa lưỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa

5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nửa chiều dài của thùy, môi dưới gồm 3 thùy to, thuỳ giữa của môi dưới có các chấm màu tím Quả nang 2 ổ, mỗi ổ chứa 2 hạt Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm

2.1.3 Phân bố [6, 14]

Hiện nay cây Xuân Hoa được trồng ở nhiều nơi như một loại cây thuốc gia đình Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm Gần đây được phát hiện mọc hoang ở vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Lộ, 1999)

Ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa một số bệnh về tiêu hóa Ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số nhà trồng cây Xuân Hoa để chữa táo bón Đặc biệt gần đây nhất chúng tôi được biết có một số doanh nghiệp ở Tây Ninh đã dùng lá và rễ cây Xuân Hoa này làm trà và được bán rộng rãi ra thị trường với tên gọi trà Hoàn Ngọc

2.1.4 Nhân giống [6 ]

Cây Xuân Hoa có thể nhân giống dễ dàng bằng cách giâm cành Lấy đoạn cành bẻ, cách ngọn khoảng 20 cm, bỏ bớt vài lá phía dưới, cắm vào đất ẩm, để chỗ mát, hàng ngày tưới đều (khoảng 2-3 lần/ngày) Cây chịu đất xốp và độ ẩm trung bình Chỉ sau 1 tuần cành giâm đã ra rễ Cây phát triển nhanh Trồng khoảng trên 2 tháng là có thể dùng làm thuốc chữa bệnh

2.2 Công dụng của cây Xuân Hoa 2.2.1 Theo kinh nghiệm dân gian

Cây Xuân Hoa được dùng trong dân gian để chữa nhiều bệnh như:

- Nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đau dạ dày, đau bụng không rõ nguyên nhân - Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột

- Khôi phục phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh - Chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não

- Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt

- Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trướng, làm giảm đau khi bị ung thư gan giai đoạn phát bệnh

- Điều chỉnh huyết áp

- Ở Trung Quốc, người ta dùng rễ cây Xuân Hoa để chữa đòn ngã tổn thương Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc đường tiêu hóa Thời gian gần đây, một số Việt kiều ở Mỹ cũng đã dùng cây Xuân Hoa để chữa bệnh đái tháo đường Bệnh nhân dùng liên tục cây Xuân Hoa giữ được ổn định tỷ lệ đường trong máu

Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt Người ta thường dùng lá tươi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nước, giã nát lấy nước uống hoặc nấu ăn Liều lượng phu thuộc vào người bệnh, từng bệnh, thông thường ăn 2-8 lá/ngày, chia làm 2 lần trước bữa ăn

2.3.1 Tác dụng sinh học 2.3.1.1 Bảo vệ tế bào gan [9]

Để góp phần xác minh tác dụng được lưu truyền trong dân gian và chứng minh tác dụng của cây thuốc Xuân Hoa, Trần Công Khánh và cộng sự của ông đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá cây Xuân Hoa trên

in vivo

 Thử độc tính cấp

- Chuột nhắt trắng, chia làm 6 lô, mỗi lô 7 con

- Thuốc thử: Cao đặc toàn phần được cân và hòa tan bằng nước cất, thu được các dung dịch có hàm lượng khác nhau: 33,2 mg/ml; 66,8 mg/ml; 125,2 mg/ml; 222,4 mg/ml; 367,6 mg/ml; 460 mg/ml

- Tiến hành: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa ở các lô khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg; 11,5g/kg thể trọng chuột Quan sát diễn biến hành vi, sau đó giết ngẫu nhiên 3 chuột ở 3 lô khác

nhau: quan sát đại thể phủ tạng và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc như tim - gan - thận - dạ dày - ruột

- Kết quả:

o Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc và trong suốt quá trình thử nghiệm thuốc không gây thay đổi trạng thái hoạt động của chuột: Chuột vẫn bò lui tới, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi… o Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kh; 11,5 g/kg thể trọng chuột, sau khi

uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhưng sau 1giờ thì trở lại bình thường, chuột rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng

o Tất cả các chuột thí nghiệm (ở liều trên) đều không chết Chuột sống khỏe mạnh sau 48 giờ

o Quan sát đại thể: Các phủ tạng đều bình thường

o Làm vi thể các cơ quan: Cắt thành miếng mỏng và nhuộm tế bào, quan sát dưới kính hiển vi (Bảng 2.1)

Cơquan

Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột

Kết luận: Cao toàn phần Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều Như vậy, trên độc tính cấp cao Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50

 Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan

- Chuột nhắt trắng, chi làm 6 lô, mỗi lô từ 8 – 12 con

- Cao toàn phần lá Xuân Hoa đã loại bỏ chlorophyl, hòa tan với nước cất 0,83g/kg Cơ tim

bình thường

Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm

trên thuỳ xung huyết

Quản cầu và các ống thận bình thường

Niêm mạc dạ

dày và tuyến

bình thường

Niêm mạc ruột

và các tuyến

bình thường

Không có tổn thương thực thể

ở các tạng 9,19g/kg Cơ tim

bình thường

Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái

hoá nhẹ

Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thường

Niêm mạc dạ

dày và tuyến

bình thường

Niêm mạc ruột

và các tuyến

bình thường

Có thoái hoá nhẹ ở gan

11,5g/kg Cơ tim bình thường

Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ

xung huyết

Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ

Niêm mạc dạ

dày và tuyến

bình thường

Niêm mạc ruột và các tuyến

bình thường

Có tổn thương nhẹ ở gan và

thận

- Mô hình gây ngộ độc gan: Gây tổn thương gan chuột nhắt bằng carbon tetrachloride (CCl4) theo phương pháp được dung thông thường (Shibayama, 1989; Yoshitake và cộng sự, 1991) với liều 1ml CCl4/kg thể trọng (liều cao) hoặc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng (liều thấp)

- Chia chuột thành 6 lô, mỗi lô 2 nhóm:

o Lô 1 (đối chứng sinh học): Chuột bình thường, không gây mô hình viêm gan, không dung thuốc Xuân Hoa

o Lô 2: Gây mô hình viêm gan đối chứng, không sử dụng thuốc Xuân Hoa o Lô 3: Gây thí nghiệm viêm gan, cho uống thuốc Xuân Hoa trước, sau 1 giờ

thì tiêm CCl4 vào

- Nguyên tắc của phương pháp là xác định hàm lượng malonic dialdehyde (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hoá lipide màng tế bào Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm [9] Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA tính theo công thức:

X = E x 30,8

Trong đó: X: Hàm lượng MDA (mM) E: Độ hấp thụ ở 532 nm

30,8: Hệ số tắt phân tử

Bảng 2.2: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng

- Hàm lƣợng men gan (AST, ALT) quá cao, không đo đƣợc trên máy

- Xét nghiệm vi thể : Chƣa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do thuốc điều trị

Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột

- Xác định hàm lƣợng men gan trên máy Cobas Mira Plus, hãng Roche (Thụy Sĩ)

Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan

Nhận xét:

- Hàm lượng men gan giảm nhưng chưa đáng kể

- Xét nghiệm vi thể: ở lô chuột có sử dụng cao Xuân Hoa và lô gây mô hình nhận thấy rằng các tế bào ở vùng thoái hoá đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hướng hồi phục

Kết luận:

Cao đặc toàn phần Xuân Hoa có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hướng tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm

2.3.1.2 Ảnh hưởng lên bệnh tiêu chảy ở heo [14]

Bệnh tiêu chảy chủ yếu xảy ra ở heo chưa cai sữa Nhiều kháng sinh như avinamycine, colistin, oxytetracyclin, spectinomycin và trimethoprim là những phương pháp phổ biến được áp dụng để điều trị bênh Tuy nhiên, lượng tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm động vật được xem như là một nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khoẻ con người bởi vì tính độc và tính dị ứng của nó Thêm vào đó, sự phát triển của các vi khuẩn kháng thuốc dẫn đến sử dụng liều lượng quá cao đã trở thành một vài vấn đề trên thế giới Vì vậy, cần phải giảm việc sử dụng và thay thế vai trò của kháng sinh trong thức ăn gia súc bằng cách gia tăng việc sử dụng probiotics và những sản phẩm tự nhiên khác, đặc biệt ở đây ta sử dụng lá cây Xuân Hoa để điều trị bệnh tiêu chảy ở heo

Bảng 2.5: Ảnh hưởng của lá tươi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trưởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo

tượng

Xuân Hoa

Liều lượng (g/kg thể trọng/ngày)

Qua đường

Thời gian

chưa

T1-2 52 cai sữa 1 1-30

TN2

Heo chƣa cai sữa

Ngoài ra, Huỳnh Kim Diệu và Trần văn Hòa [14] đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang đƣợc sử dụng trị bệnh tiêu chảy ở heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lƣợt: Bột Xuân Hoa 92,86%; Coli-norgen 90,48%; Cotrimxazol 83,33% Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14%; 9,52%; 14,29% Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy

Loại thuốc

Số heo thử nghiệm

Số lƣợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị

Bột Xuân

Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33

Nhận xét:

Không có tác dụng phụ của lá Xuân Hoa đối với heo trong thí nghiệm này Nồng độ ức chế nhỏ nhất của cây được tính toán là 0,75-1,5 g lá tươi hoặc 0,15-0,3 g bột/kg thể trọng cho phương pháp này Liều lượng được sử dụng cho việc ngăn chặn bệnh, nồng độ được sử dụng trong thí nghiệm nhỏ hơn nồng độ gây ức chế thấp nhất để tránh gây

tác dụng phụ Sử dụng lá hay bột Xuân Hoa có thể cải thiện những thông số đo lường

nói trên và kết quả có thể được giải thích như sau: Trước tiên, lá Xuân Hoa chứa một tỉ lệ cao protein thô (30,8% DM: dry matter), so sánh với cỏ voi (18,6% DM) và cây sắn dây (18,4% DM) Ảnh hưởng của liều sử dụng sẽ rất nhỏ bởi vì tỉ lệ nhỏ của nó trong khẩu phần Thứ hai, lá Xuân Hoa có hàm lượng cao một số loại khoáng như: Ca (6,5% DM), K (4,4% DM), Mg (6,3% DM), Fe (0,3% DM) Hàm lượng Fe, đặc biệt trong các chất khoáng cao gấp 4 lần đậu nành và 3 lần gan heo Fe trong cây sẽ góp phần cải thiện tình trạng sinh lý máu bởi vì Fe cần thiết cho heo để thúc đẩy hồng cầu, đặc biệt hemoglobin có chức năng như một thể mang oxy và cacbonic, vì thế nó được biết như một sắc tố hô hấp và giải thích tình trạng của hồng cầu Thứ ba, trong lá có chứa một protein ổn định nhiệt được gọi là pseuderantin (0,4% trong protein thô) có hoạt tính mạnh trong việc tiêu hoá casein và do đó việc tiêu hóa sữa sẽ được cải thiện nếu bổ sung lá Thứ tư, một số hợp chất hoá học trong lá và một vài tác nhân kháng khuẩn có

thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo

Kết luận:

Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chưa cai sữa và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tương lai

2.3 Thành phần hoá học [4, 5]

Hiện nay trên thế giới chưa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Xuân Hoa, chỉ có một số công trình nghiên cứu bước đầu về cây này ở Việt Nam như Trần Công Khánh (1998), Phan Phước Hiền (2005), Huỳnh Kim Diệu (2003) Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr Đáng chú ý là hàm lượng Vanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi)

Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751-1365 mg%) Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi cơ thể Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh Lá Xuân Hoa còn giàu Valin (29-1001 mg%) Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi Valin còn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hoá quan trọng

Trong các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Xuân Hoa người ta đã tìm thấy -Sitosterol, Phytol, 3-O-( -D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp gồm hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan-1-ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O- -glucoside và apigenin 7-O- -glucoside [4]

Nguyễn Văn Hùng và cộng sự (2004) [4], đã phân lập được tiếp theo là: 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, acid palmitic và acid salicylic

- Triacontanol: Là chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 87-880C, là một Ancol no bậc một, không phân nhánh với công thức là : C30H62O 1-triacontanol là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy 1-triancontanol có hoạt tính kháng viêm, ức chế các quá trình peroxy hóa các chất béo có cũng như không có sự tham gia của các enzyme và làm giảm mỡ trong máu

- Glycerol 1-hexadecanoate: Dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 65-670C, là một mono-ester của glycerin với acid Palmitic và công thức phân tử là C19H38O34.

- Acid palmitic: Là chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 48-510C, có đặc trưng của một acid béo no mạch thẳng

- Acid Salicylic: Thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 140-1420C và công thức phân tử là: C7H6O3 Acid salicylic có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn Acid salicylic tổng hợp được sử dụng trong nhiều loại chế phẩm dựa vào tính chất này

Với các họat tính nêu trên, sự có mặt của 1-triancontanol và acid salicylic trong lá cây Xuân Hoa có thể góp phần giải thích các hoạt tính đã được phát hiện thấy trong các công trình nghiên cứu trước đây cũng như giải thích tác dụng chữa bệnh của cây Xuân Hoa theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian

Tám hợp chất Dotriacontan, phytol, squalen, 24metylencycloartanol, loliolide, sitosterol, -sitosterol 3 -O-D-glucopyranosid và stigmasterol 3 -O-D-glucopyranosid lần đầu tiên được cô lập trong lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees) Radlk, họ Ô rô (ancathaceae) của Trần Kim Thu Liễu và cộng sự (2006)

-2.4 Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên [ 7 ] 2.4.1 Alcaloid

Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có hoạt tính sinh học rõ rệt Đa số alcaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có hoa nhưng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và thực vật hạ đẳng Đa số alcaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định Vài alcaloid ở dạng keo, vô định hình và alcaloid ở dạng lỏng (nicotin,

coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng; betanidin màu đỏ)

Các alcaloid ở dạng bazơ tự do thường hoà tan được trong dung môi hữu cơ, tuy nhiên các alcaloid ở dạng bazo tứ cấp thì chỉ hòa tan trong nước Muối của đa số alkaloid thì

hòa tan trong nước Độ hòa tan của alkaloid và các muối của chúng giữ vai trò quang trọng trong kỷ nghệ dược phẩm; trong việc trích ly chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alcaloid thành các dạng thuốc phù hợp

Đa số alcaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alcaloid cực kỳ nhạy cảm, dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ

Nhiều alcaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh Alcalid có tác dụng kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin Các alcaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối: morphin và các dẫn xuất của morphin như: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc) Có alcaloid được bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol

Một số alcaloid như: berberin, palmatin, taspin…có khả năng ức chế con men sao chép ngược (reverse trancriptase) đây là con men chủ yếu của retrovirus mà các loại thuốc kháng HIV tập trung tiêu diệt

2.4.2 Flavonoid

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn

Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid Các đường thường gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose…

Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên Các glicisid flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol Kaempherol rất thường xuyên hiện diện Antocyanidine dạng glicosid thí

dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái

Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam-đỏ Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái

Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường

acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella

oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật

Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon (trích từ dây thuốc cá Derris

elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc với các

động vật hữu nhũ Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất

pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc)

2.4.2 Tinh dầu

Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid Từ 2000 năm trước người ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho Mentol là alcol terpen trích từ tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của nó Các gia vị như: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hương…bên cạnh mùi vị làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn Nhiều tinh dầu có khả năng

kháng khuẩn mạnh như: tinh dầu rau ngỗ Enhydra fluctuans; tinh dầu hồi Illicium

verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long não Cinnamonium campho; tinh dầu

gừng Zingiber officinalist; tinh dầu nghệ Curcuma longa…

2.4.3 Saponin

Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200o

C trở

lên và có thể trên 300oC Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormone steroid có hoạt tính cao Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

2.5 Đại cương về vi khuẩn đường ruột [8, 12] 2.5.1 Định nghĩa

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào

2.5.2 Hình thể

Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-) Kích thước trung bình 2-4 m x 0,4-0,6 m Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không bao giờ sinh nha bào Mộ số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường

2.5.3 Tính chất nuôi cấy

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường, có thể phát triển thành váng trên bề mặt, nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy ống Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:

- Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

- Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

- Dạng M: Hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau

2.5.4 Đặc tính sinh hoá

Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột:

- Di động hoặc không di động

- Lên men hoặc không lên men một số loại đường Hai loại đường thường được xác định nhất là glucose và lactose

- Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường

- Có hay không có một số enzym Hai enzym thường được xác định nhất là urease và tryptophanase

- Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

- Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp Ví dụ: khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons

2.5.5 Sức đề kháng

Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100o

C và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thường Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền

2.5.6 Độc tố

Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố Bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị li giải Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ) Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc

Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố như S.Shiga,

E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET) Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho bệnh lỵ

nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này

C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5% Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị che lấp bới kháng nguyên này Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn Dựa vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh

- Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông Có bản chất là protein, để phá huỷ ở 100oC hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân huỷ trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại Để có kháng nguyên H người

ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá huỷ, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn

- Kháng nguyên K: Là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng

kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhy) Kháng nguyên

K nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra Trong trường hợp này cần phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này

2.5.8 Khả năng gây bệnh

Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tuỳ theo từng giống, từng loài

Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột

2.6 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm

2.6.1 Staphyllococcus aureus

- Là vi khuẩn gram dương, không giáp mô, không tạo bào tử

- Sức đề kháng: nhạy cảm với Penicillin, Authromycin và Ampicilin - Khả năng gây bệnh:

o Sưng mủ trên da, niêm mạc o Gây ung nhọt, áp xe

2.6.3 Escherichia coli (E.coli)

- Là vi khuẩn gram âm, không bào tử

- Sức đề kháng: Nhạy cảm với chloraphenicol, Streptomycin, Sunfamid, Trimethroprim

- Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh:

o Gây tiêu chảy

o Bệnh phù thủng ở heo con o Viêm ruột

o Trên môi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 18 giờ môi trường đục đều

o Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn lồi, bóng, thường không màu hoặc màu trắng xám

o Trên môi trường phân lập SS: Khuẩn lạc có màu hồng; Trên môi trường Istrati khuẩn lạc có màu xanh

- Độc tố:

o Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoặc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Payer bị phù nễ, đôi khi hoại tử Nội độc tố

có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella

o Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố có thể điều chỉnh thành giải giải độc tố

- Khả năng gây bệnh:

o Sốt thương hàn – phó thương hàn o Ngộ độc thức ăn

2.7 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3]

Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lượng Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl (OH), chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng như các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như DNA, lipid, protein…

Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase, catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ tương ứng, chúng được xem là các enzyme khử độc chính trong cơ thể Đôi khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vượt quá

giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho sinh vật Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn nhƣ các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Vật liệu

 Vật liệu:

Lá cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)

 Nguồn gốc lấy mẫu:

Lá Xuân Hoa được lấy từ 2 nguồn:

- Tại doanh nghiệp tư nhân trà 7 Nga (Tây Ninh) - Vườn thực nghiệm trường đại học Cần Thơ

3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

 Địa điểm

Tại phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường đại học Nông Lâm

 Thời gian

Đề tài được thực hiện qua 2 phần:

Phần 1: Tiến hành tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa và khảo sát tính kháng khuẩn

- Giai đoạn 1: Tiến hành chiết Soxhlet lá Xuân Hoa để thu các loại cao Thời gian tiến hành từ ngày 1/4/2007 đến 27/4/2007

- Giai đoạn 2: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao để xác định cao có hoạt tính mạnh nhất Từ ngày 29/4/2007 đến ngày 6/5/2007

- Giai đoạn 3: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform để tách các phân đoạn Thời gian thực hiện từ ngày 8/5/2007 đến ngày 23/6/2007

- Giai đoạn 4: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn để xác định phân đoạn kháng khuẩn Thời gian thực hiện từ ngày 25/6/2007 đến ngày 2/7/2007

- Giai đoạn 5: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên phân đoạn kháng khuẩn để tách chất sạch Thời gian thực hiện từ ngày 5/7/2007 đến ngày 19/7/2007

- Giai đoạn 6: Gửi mẫu chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất được tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học, Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội

Phần 2: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xuân Hoa Thời gian thực hiện từ 23/7/2007 đến ngày 30/7/2007

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

 Dùng cho các thử nghiệm sinh hóa:

Tủ sấy

Máy xay mẫu Bộ soxhlet Máy cô quay Bình lắc

Bình lắc quả lê Phễu

Giấy lọc

Ống chạy sắc cột Bình tam giác 50ml Bình triển khai Máy lắc

Bồn đánh siêu âm

Micropipette loại 100 – 1000 µl Đầu tipe loại 1000µl

Cân phân tích Máy làm đá

Máy đo nhiệt độ nóng chảy Máy đo OD

Ống nghiệm Giấy bạc Parafirm Pipette Pasteur Đèn cồn

Cây kẹp

 Dùng cho thử nghiệm vi sinh:

Ống nghiệm Đĩa petri Đèn cồn Tủ ấm Tủ sấy

Tủ hấp autoclave Bông không thấm

Micropipette loại 100-1000 µl Micropipette loại

Đầu tipe loại Que cấy vòng Tâm bông vô trùng

3.3.2 Hóa chất

 Dùng cho thử nghiệm sinh hóa:

Methanol (Trung Quốc, Merck) Ethanol (Trung Quốc)

Chloroform (Trung Quốc) Ete dầu hỏa

Acetone H2S04 98%

Môi trường BHI Môi trường TSA Môi trường thạch máu DMSO (dimethylsulfoxid)

3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Xử lý nguyên liệu

Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu