Định lượng vitexin trong chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng hplc

sau đó định lượng vitexin bằng HPLC [5] tuy nhiên chưa có công bố về phương pháp định lượng vitexin trong dược liệu lạc tiên cũng như chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng HPLC.. Vì

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được cảm ơn ThS Nguyễn Hoàng Lê – Giảng viên

Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, người đã chỉ bảo, giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới PGS TS

Phạm Thị Thanh Hà, ThS Vũ Ngân Bình và các thầy cô kỹ thuật viên của bộ

môn Hóa phân tích – Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng toàn thể các thấy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho

em những kiến thức và kỹ năng trong thời gian em theo học dưới mái trường Cuối cùng, lời cảm ơn thân thương nhất em muốn gứi đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên và âm thầm giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Đoàn Thị Tươi

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về lạc tiên Passiflora foetida L 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Tác dụng dược lý và công dụng 3

1.2 Tổng quan về vitexin 4

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 4

1.2.2 Tác dụng dược lý 5

1.2.3 Các phương pháp xác định 7

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 10

1.3.1 Định nghĩa 10

1.3.2 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký 10

1.3.3 Máy HPLC 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 13

2.1.1 Đối tượng 13

2.1.2 Nguyên liệu 13

2.1.3 Thiết bị - dụng cụ 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký 14

2.3.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký 14

2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 15

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Chuẩn bị các dung dịch 18

3.2 Khảo sát 18

3.2.1 Khảo sát bước sóng phát hiện 18

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 19

3.2.3 Khảo sát thành phần pha động 21

3.2.4 Khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu 25

3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 26

3.3.1 Độ đặc hiệu 26

3.3.2 Độ ổn định hệ thống 28

3.3.3 Đường chuẩn 28

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp 30

3.3.5 Độ đúng của phương pháp 30

3.3.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 31

3.4 Xác định hàm lượng vitexin trong mẫu chế phẩm 32

3.5 Bàn luận 32

3.5.1 Điều kiện xử lý mẫu 32

3.5.2 Xây dựng phương pháp định lượng 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tên tiếng Việt

HPLC High Performance Liquid

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của vitexin 5

Hình 1 2 Cấu tạo máy HPLC 12

Hình 3 1 Phổ hấp thụ UV của vitexin 19

Hình 3 2 Chế phẩm chiết bằng MeOH 40% 20

Hình 3 3 Chế phẩm chiết bằng EtOH 60% 20

Hình 3 4 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 1 22

Hình 3 5 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 2 22

Hình 3 6 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 3 22

Hình 3 7 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy đẳng dòng 17,5% ACN 25

Hình 3 8 Sắc ký đồ kết quả độ đặc hiệu 27

Hình 3 9 Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ vitexin 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Một số phương pháp phân tích vitexin bằng HPLC 9

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát chương trình gradient điều kiện thứ nhất 21

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát các chương trình đẳng dòng 24

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm 25

Bảng 3 4 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu 26

Bảng 3 5 Kết quả độ ổn định hệ thống 28

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát đường chuẩn 29

Bảng 3 7 Kết quả độ lặp lại 30

Bảng 3 8 Kết quả độ đúng 31

Bảng 3 9 Kết quả xác định hàm lượng vitexin trong một số chế phẩm 32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lạc tiên thuộc họ Lạc tiên (Nhãn lồng) Passifloraceae và chi Lạc tiên (Passiflora) có công dụng chính là an thần, thanh nhiệt, giải độc, trừ phong thấp,

chống viêm, dùng chữa các bệnh mất ngủ, tim hồi hộp, xương khớp, mụn nhọt, lở

ngứa, viêm loét chân, phù thũng [3] Thành phần hóa học chính của chi Passiflora

L là alkaloid, phenol, glycosyl flavonoid và các hợp chất cyanogenic [41] Trong

các C-glycosylflavon có trong cho Passiflora L này, vitexin và isovitexin là thành

phần chính, có khối lượng lớn nhất [35] Vitexin được biết đến với khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, an thần, chống virus, chống viêm, xơ cứng động mạch,

chuẩn vitexin từ cây lạc tiên (Passiflora foetida Linn.) sau đó định lượng vitexin

bằng HPLC [5] tuy nhiên chưa có công bố về phương pháp định lượng vitexin trong dược liệu lạc tiên cũng như chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng HPLC

Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Định lượng vitexin trong chế phẩm từ dược liệu

chứa lạc tiên bằng HPLC” để góp phần phục vụ công tác kiểm nghiệm và cung

cấp thêm các lựa chọn cho các nhà phân tích với mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng vitexin trong chế phẩm

từ dược liệu chứa lạc tiên bằng HPLC

2 Ứng dụng định lượng vitexin trong các chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên trên thị trường bằng HPLC

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về lạc tiên Passiflora foetida L

1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và phân bố

Cây leo bằng tua cuốn Thân mềm, tròn và rỗng, có lông thưa Lá mọc so le, chia 3 thùy, thùy giữa lớn hơn thùy hai bên, mép uốn lượn có lông mi nhỏ, gốc hình tim đầu nhọn, gân lá hình chân vịt, hai mặt có lông mịn, tua cuốn mọc ở kẽ

lá, đầu cuộn lại như lò xo Hoa to, đều, lưỡng tính, mọc riêng ở kẽ lá, tổng bao có

ba lá bắc rời nhau chia thành những dải nhỏ như sợi, bao hoa gồm năm lá đài màu xanh lục, mép viền trắng, mỗi lá đài có một phần phụ hình nhọn ở mặt ngoài, 5 cánh hoa rời nhau, màu trắng pha tím nhạt ở mặt giữa, xếp xen kẽ với các lá đài, một vòng tua gồm nhiều phần phụ của cánh hoa hình sợi chỉ, màu tím, ở giữa hoa,

có một cột nhỏ hình trụ (cuống nhị nhụy) mang 5 nhị có bao phấn đính lưng, màu vàng, bộ nhụy có 3 lá noãn, bầu thường một ô Quả mọng, hình trứng, dài khoảng

3 cm, bao bọc bởi tổng bao lá bắc tồn tại, vỏ quả mỏng khi chín màu vàng, hạt nhiều, có áo hạt thơm, ăn được [3]

Cây Passiflora foetida mọc hoang khắp nơi ở nước ta, nhất là các tỉnh Hòa

Bình, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Bình, Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng [7]

Trên thế giới, cây lạc tiên có ở Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia và một số nước Đông Nam Á khác [3]

1.1.2 Thành phần hóa học

Cây Lạc tiên (P.foetida L.) cũng được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều về

thành phần hóa học Hai thành phần hóa học chính của cây này cũng giống như

các loài khác thuộc chi Passiflora L là flavonoid và alcaloid [6], [9]

Tác giả Nguyễn Thị Yến và cộng sự đã xác định các flavonoid trong lạc tiên

3

gồm có apigenin, luteolin, chrysoeriol, tricin, quercetin-4'-metyl ete, vitexin, vitexin-2 "-O-xyloside, orientin, apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside và luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside [38] Trong đó, một số C-glycosyl flavonoid thường

gặp trong chi Passiflora L như vitexin, isovitexin, 2’’-xylosylvitexin,

luteolin-7-D-glucosid [9]

Ngoài ra trong lạc tiên còn có các cyanohydrin glycosid như tetraphyllin A, tetraphyllin B, tetraphyllin B sulphate, deidaclin, volkenin [14]; các acid béo như linoleic acid, linolenic acid [29]; các polyketide α-pyrone được đặt tên là passifloricin được phân lập từ nhựa cây [23]

Phân tích sơ bộ thành phần hóa học phần thân mang lá của cây lạc tiên mọc

ở Việt Nam, kết quả cho thấy có triterpene, flavonoid, alkaloid, acid hữu cơ, chất khử Trong đó các hợp chất phenol có mặt cả trong thân và lá, alkaloid phát hiện trong lá Nghiên cứu cũng xác định 2 flavonoid chính trong lá cây lạc tiên là vitexin và xylosyl vitexin [8]

1.1.3 Tác dụng dược lý và công dụng

Các nghiên cứu được thực hiện trên P foetida đã cho thấy chiết xuất của cây

có nhiều hoạt tính sinh học đầy hứa hẹn như an thần [28], chống tiêu chảy [45], giảm đau, chống viêm [48], chống trầm cảm [40], chống tăng huyết áp, chống tiểu đường [47], chống ung thư [51] và kháng khuẩn [37]

Lạc tiên làm tăng đáng kể tổng thời gian ngủ Sự gia tăng này là do tăng thời gian của động vật trong giấc ngủ sóng chậm SWS Ngược lại thời gian dành cho giấc ngủ REM (giấc ngủ có chuyển động mắt nhanh) có xu hướng giảm đi nhưng không đáng kể Sự suy giảm của giấc ngủ REM sau khi sử dụng chiết xuất của lạc tiên là do sự giảm sự xuất hiện của giai đoạn ngủ này, cũng như giảm thời gian trung bình của nó Việc tăng đánh kể tổng thời gian ngủ và tăng thời gian giấc ngủ sóng chậm SWS được tạo ra bởi các chất chiết được từ cây lạc tiên cho thấy rằng loài thực vật này sở hữu đầy đủ các đặc tính để được coi là chất gây ngủ [28]

4

Trong nghiên cứu của Asadujjaman Md và cộng sự, chỉ ra cao chiết EtOH

của Passiflora foetida có tác dụng giảm đau, chống tiêu chảy và gây độc tế bào

(nghiên cứu thực nghiệm trên chuột) [15]

Các thử nghiệm vi sinh đã chứng minh hiệu quả dịch chiết MeOH và nước

của P foetida có tác dụng chống nấm da, chống lại các loài Trichophyton và

Arthroderma, có liên quan đến chứng viêm da [18]

P foetida có khả năng chống đái tháo đường bằng cách ức chế các enzym

liên quan đến tăng đường huyết sau ăn Hoạt tính ức chế α-amylase tối đa được ghi nhận trong 100 µg/ml dịch chiết nước và ethanol của rễ với mức ức chế tương ứng là 80,3% và 83,3% [42]

Ranganatha N và cộng sự tiến hành nghiên cứu đánh giá các tác dụng hạ

huyết áp trên thực nghiệm của cao chiết ethyl acetat của P.foetida cho thấy ở mức

liều 300mg/ml có tác dụng hạ huyết áp tương đương với liều 5mg amlodipin [46]

Các nghiên cứu tiền lâm sàng đã chỉ ra rằng luteolin trong P.foetida có khả

năng ngăn chặn sự hình thành ung thư ở động vật, giảm sự phát triển của khối u trong cơ thể và làm tăng sự nhạy cảm của các tế bào khối u với tác dụng gây độc

tế bào của một số loại thuốc chống ung thư [34]

Ngọn và lá non làm rau, quả chín ăn được Toàn cây có tác dụng an thần, điều kinh, chữa mất ngủ, ho, suy nhược thần kinh, phù thũng Lá giã đắp chữa mụn nhọt, lở loét ở chân, viêm mủ da Toàn cây chữa bỏng lửa, bỏng nước sôi [3]

5

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của vitexin

Vitexin có công thức hóa học: C21H20O10, khối lượng phân tử: 432,4 g/mol Điểm nóng chảy: 248 - 2500C, điểm sôi: 767,70C ở 760 mmHg

Vitexin có tính acid yếu, pKa = 6,27

Vitexin ít tan trong nước (6,72 µg/ml) [22]

1.2.2 Tác dụng dược lý

Vitexin có tác dụng chống oxy hóa mạnh [44] Nghiên cứu trên nguyên bào sợi da người được nuôi cấy đã cho thấy khả năng mạnh mẽ của vitexin trong việc loại bỏ các gốc tự do sinh ra do quá trình tiếp xúc với tia UVB Điều này cho thấy tiềm năng của việc sử dụng vitexin trong việc ngăn ngừa tổn thương da do tiếp xúc với ánh nắng mặt trời [31]

Vitexin chống lại các loại phản ứng oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid và các tổn thương oxy hóa khác trong một loạt các bệnh liên quan đến oxy hóa, bao gồm co giật, suy giảm trí nhớ, thiếu máu cục bộ não, nhiễm độc thần kinh, tổn thương cơ tim, hô hấp và rối loạn chức năng trao đổi chất [17]

Trong một thí nghiệm với chuột, vitexin đã được chứng minh là có tác dụng

Nghiên cứu in vitro của Zhang W và cộng sự đã làm sáng tỏ tác dụng ức chế của vitexin đối với sự xâm lấn và di căn trong tế bào u ác tính A375 và C8161 Sau khi điều trị vitexin trong 24 giờ hoặc 48 giờ, khả năng xâm lấn và di chuyển của các tế bào u ác tính đã giảm phụ thuộc vào liều lượng và thời gian [55] Vitexin còn được đề xuất dùng như một chất để điều trị bệnh bạch cầu ở người, vì nó thúc đẩy sự biểu hiện của caspase-3 bị phân cắt và caspase-9 bị phân cắt trong các tế bào bệnh bạch cầu, đồng thời làm giảm biểu hiện Bcl-2 (protein

ức chế quá trình chết rụng của tế bào) và do đó gây ra quá trình apoptosis (quá trình chết tế bào theo chương trình) [33]

Vitexin và các chất tương tự của nó đã được nghiên cứu như một chất chống tăng đường huyết [12] Cho chuột uống vitexin hoặc isovitexin, báo cáo cho thấy vitexin làm giảm đáng kể hàm lượng đường huyết sau ăn, tác dụng hạ đường huyết phụ thuộc vào liều lượng [21], [49]

Vitexin ức chế α-glucosidase (một loại enzym phân hủy carbohydrat) có tác dụng làm giảm nguy cơ đái tháo đường type 2 [24], [54], [39]

Một nghiên cứu của Choi J S và cộng sự vào năm 2013 đã chứng minh rằng

7

vitexin và isovitexin có khả năng chống đái tháo đường nhờ tác dụng ức chế enzym PTP-1B – enzym điều hòa âm tính hoạt động của insulin ở mô đích [20]

Trong một nghiên cứu thực hiện trên thỏ và người tình nguyện khỏe mạnh, vitexin tạo ra tác dụng co bóp tích cực trên tâm nhĩ bị cô lập của thỏ mà không liên quan đến hoạt hóa thụ thể β1 - adrenergic Vitexin không có hoạt tính giãn mạch cũng như không thể đảo ngược phản ứng co mạch ở động mạch phổi bị cô lập của thỏ bằng kali clorua và phenylephrine Vitexin làm tăng đáng kể lưu lượng nước tiểu và bài tiết natri, kali trong nước tiểu ở những người tình nguyện khỏe mạnh và tăng huyết áp nhẹ ở thỏ Hơn nữa, vitexin làm giảm đáng kể huyết áp động mạch trung bình của những người tình nguyện và thỏ cao huyết áp nhẹ Tác dụng hạ huyết áp này của vitexin không liên quan đến việc giãn mạch trực tiếp hoặc chẹn các thụ thể α, β - adrenergic Cơ chế hoạt động có khả năng nhất của vitexin như một hợp chất hạ huyết áp là thông qua tác dụng lợi tiểu của nó [13]

Uống trà làm từ hoa lạc tiên, đặc biệt là Passiflora incarnata, từ lâu đã được

biết là có tác dụng an thần và gây ngủ [32] Nó là một loại thảo mộc rất an toàn, được đăng ký làm thực phẩm với Bộ An toàn Thực phẩm và Dược phẩm Hàn

Quốc (KFDA) Kim G và cộng sự đã tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất Passiflora incarnata với rượu etylic để tạo ra một sản phẩm gây ngủ an toàn Vitexin là sản

phẩm chính trong phương pháp chiết xuất đã được xây dựng của nhóm nghiên

cứu này [30] Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chiết xuất Passiflora incarnata chỉ có tác dụng gây ngủ, ít nhất là trên các mô hình động vật mà không

gây ra bất kỳ rối loạn hành vi hoặc chuyển hóa bất lợi nào (như tăng cảm giác thèm ăn, tăng trọng lượng cơ thể)

1.2.3 Các phương pháp xác định

Lữ Thị Kim Chi và các cộng sự [5] đã chiết xuất, phân lập vitexin từ cây lạc tiên và định lượng dung dịch vitexin tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với

8

detector PDA Các tác giả sử dụng điều kiện phân tích sắc ký khá đơn giản: Cột Phenomenex Gemini C18 (150 × 4,6 mm; 5 µm), pha động gồm acetonitril và acid acetic 0,1% (20:80), bước sóng phát hiện 340 nm Tuy nhiên quy trình chiết xuất vitexin tương đối phức tạp gồm 4 giai đoạn chiết, phân lập và tinh chế với các dung môi khác nhau: cồn 96 %, cloroform, n – butanol và cao n – butanol qua cột diaion HP 20

Pongpan N và cộng sự [43] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD để xác định trực tiếp hàm lượng vitexin trong lạc tiên Các tác giả sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động gồm isopropanol : THF: H2O (5 :15 : 80) và 0.3% formic acid, bước sóng phát hiện 340 nm Nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng vitexin có thể được tách và định lượng từ dịch chiết lá cây lạc tiên với RSD thấp, điều đó gợi ý rằng vitexin là một marker thích hợp cho dược liệu lạc tiên Vì vậy phương pháp HPLC được xây dựng có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng của các dược phẩm chứa lạc tiên

Một số phương pháp phân tích vitexin bằng HPLC được liệt kê trong bảng 1.1

Chiết xuất, phân lập, tinh chế vitexin qua 4 giai đoạn

C18 (150×4,6 mm; 5µm)

Acetonitril - acid acetic 0,1% (20:80)

PDA

[43]

Lạc tiên

Passiflora foetida

Methanol 40%, siêu

âm

C18 (250×4,6 mm; 5µm)

Isopropanol - THF - H2O (5:15:80) và 0,3% formic acid

DAD

[30]

Lạc tiên tây

Passiflora incarnata

Ethanol 50%, siêu

âm

C18 (250×4,6 mm; 5µm)

Low–Glu, Ficus deltoidea

Jack

Methanol, siêu âm

C18 (250×4,6 mm; 5µm)

Acetonitril đệm phosphat

-pH 4,5

DAD

là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích dịch sinh học nói riêng [1]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và yêu cầu của công việc Có thể thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến trong thực tế như sắc

ký phân bố (bao gồm các sắc ký cặp ion), sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc

ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2]

1.3.2 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký

Qs: lượng chất trong pha tĩnh

Qm: lượng chất trong pha động

tR: thời gian lưu

t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh

𝑡𝑅𝐴Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1

Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0

𝐹 = 𝑊2𝑎Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

W: chiều rộng ở đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

12

Trong đó:

tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

k’ là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh nhau cần phân tích

Trong thực tế, nếu các pic đối xứng thì để định tính (hai pic liền nhau) độ phân giải tối thiểu là Rs = 1,0 còn để định lượng Rs = 1,5 là phù hợp

1.3.3 Máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi [1]

Hình 1 2 Cấu tạo máy HPLC

13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu: vitexin

Đối tượng phân tích: chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên

Hóa chất, dung môi:

- Acetonitril, ethanol, methanol loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); acid phosphoric và kali dihydro phosphat tinh khiết phân tích (Merck, Đức)

- Nước cất 2 lần (dùng ngay sau khi cất)

2.1.3 Thiết bị - dụng cụ

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies Series 1200 với detector DAD và phần mềm Chemstation (Agilent, Mỹ), cột sắc ký SunfireTM C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Elma, Đức), máy lắc xoáy (Labinco L46, Đài Loan), cân phân tích GR200 (A&D, Nhật Bản), máy đo

pH Eutech Instruments (Singapore)

Micropipet 10 – 100 µl Nichipipet ABMATE pro, 100 – 1000 µl Nichipet

14

EX, màng lọc cellulose 0,45 µm, các dụng cụ khác: pipet chính xác 10 ml, bình định mức 50 ml, bình nón, cốc đong, pipet Pasteur, cốc có mỏ, vial, chày, cối sứ, phễu

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích vitexin trong chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ, độ đúng, độ lặp theo hướng dẫn của AOAC

(2016) [16]

- Ứng dụng phương pháp trên định lượng vitexin trong một số chế phẩm

từ dược liệu chứa lạc tiên trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc vitexin 108 ppm: Cân chính xác 5,4 mg vitexin chuẩn vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 50% đến vạch, bọc kín, bảo quản trong tủ lạnh

Cân 20 viên nang chế phẩm, tính khối lượng trung bình của hỗn hợp cao dược liệu trong nang và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 500 mg lạc tiên cho vào bình nón Thêm 10 ml hỗn hợp dung môi nước và ethanol (4:6), chiết siêu âm trong 10 phút Dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi chuyển vào vial qua màng lọc cellulose 0,45 µm

2.3.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký

Khảo sát dung môi chiết

15

- Khảo sát bước sóng phát hiện

Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử; xác định khả năng định tính và định lượng chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu

Cách xác định: Phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng trong cùng điều kiện sắc ký

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ

16

thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

Tiến hành: Xác định tính thích hợp hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn vitexin Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 1,0%

RSD của diện tích pic ≤ 2,0%

Yêu cầu: Hệ số tương quan 0,995 ≤ r ≤ 1

Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Cách xác định: Pha loãng mẫu chuẩn đến nồng độ thấp nhất còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N) LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiều

17

đường nền, thông thường lấy S/N = 3

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10

Độ lặp lại: là mức độ gần nhau giữa các kết quả riêng lẻ của các phép đo theo đúng quy trình thử nghiệm được lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

Cách xác định: Chuẩn bị 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký và tính toán độ lệch chuẩn tương đối Yêu cầu RSD (%) theo các mức nồng độ được quy định tại AOAC 2016

Yêu cầu: Tỉ lệ thu hồi và RSD (%) cho mỗi mức nồng độ được quy định tại AOAC 2016

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel 2016

Dung dịch đệm KH2PO4 pH 4,5: cân chính xác khoảng 6,8 g KH2PO4 vào cốc đong, định mức vừa đủ 1l bằng nước cất 2 lần Thêm 2 ml triethylamin, điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH = 4,5

Dung dịch H3PO4 0,1%: hút chính xác 600µl dung dịch H3PO4 85% vào cốc đong, định mức vừa đủ 1l bằng nước cất 2 lần, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M đến pH = 2,5

3.2 Khảo sát

Chuẩn bị mẫu chế phẩm chiết bằng ethanol 60 %, methanol 40 % và khảo sát các điều kiện sắc ký để tách vitexin

3.2.1 Khảo sát bước sóng phát hiện

Thực hiện quét phổ UV từ 210 nm đến 400 nm của pic sắc ký khi tiêm mẫu chuẩn vitexin 10 ppm, chúng tôi nhận thấy xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 269 nm và 342 nm (hình 3.1) với cường độ tương đương nhau Do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn tiến hành định lượng vitexin trong mẫu chế phẩm ở bước sóng 342 nm

19

Hình 3 1 Phổ hấp thụ UV của vitexin

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết

Dung môi và pH chiết là 2 yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và độ bền của các flavonoid [11]

Fu Y và cộng sự [26] đã khảo sát dung môi chiết vitexin trong lá cây Cajanus cajan với nước và hỗn hợp dung môi ethanol : nước Kết quả cho thấy với sự tăng

tỉ lệ ethanol trong hỗn hợp dung môi chiết thì hiệu suất chiết vitexin tăng lên rồi giảm dần Hàm lượng vitexin thu được cao nhất khi chiết bằng ethanol 60% Pongpan N và cộng sự [43] dùng methanol 40% để chiết vitexin từ lá cây lạc

tiên Passiflora foetida và định lượng vitexin bằng HPLC

Trên cơ sở tham khảo những tài liệu nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết vitexin từ mẫu chế phẩm bằng hỗn hợp dung môi ethanol : nước tỉ

lệ 6:4 và hỗn hợp dung môi methanol : nước tỉ lệ 4:6 (v/v) Kết quả được thể hiện trên các sắc ký đồ sau: