Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel 2016.
18
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Chuẩn bị các dung dịch
Dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn vitexin gốc 100 ppm pha các dung dịch vitexin có nồng độ từ 2 đến 25 ppm, dung môi pha mẫu là ethanol 50%.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm đã được đồng nhất vào bình nón, thêm chính xác 10 ml hỗn hợp dung môi nước : ethanol tỉ lệ 4:6 hoặc hỗn hợp nước : methanol tỉ lệ 6:4, siêu âm 10 phút và lọc lấy dịch.
Dung dịch đệm KH2PO4 pH 4,5: cân chính xác khoảng 6,8 g KH2PO4 vào cốc đong, định mức vừa đủ 1l bằng nước cất 2 lần. Thêm 2 ml triethylamin, điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH = 4,5.
Dung dịch H3PO4 0,1%: hút chính xác 600µl dung dịch H3PO4 85% vào cốc đong, định mức vừa đủ 1l bằng nước cất 2 lần, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M đến pH = 2,5.
3.2.Khảo sát
Chuẩn bị mẫu chế phẩm chiết bằng ethanol 60 %, methanol 40 % và khảo sát các điều kiện sắc ký để tách vitexin.
3.2.1. Khảo sát bước sóng phát hiện
Thực hiện quét phổ UV từ 210 nm đến 400 nm của pic sắc ký khi tiêm mẫu chuẩn vitexin 10 ppm, chúng tôi nhận thấy xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 269 nm và 342 nm (hình 3.1) với cường độ tương đương nhau. Do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn tiến hành định lượng vitexin trong mẫu chế phẩm ở bước sóng 342 nm.
19
Hình 3. 1. Phổ hấp thụ UV của vitexin
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết
Dung môi và pH chiết là 2 yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và độ bền của các flavonoid [11].
Fu Y và cộng sự [26] đã khảo sát dung môi chiết vitexin trong lá cây Cajanus cajan với nước và hỗn hợp dung môi ethanol : nước. Kết quả cho thấy với sự tăng tỉ lệ ethanol trong hỗn hợp dung môi chiết thì hiệu suất chiết vitexin tăng lên rồi giảm dần. Hàm lượng vitexin thu được cao nhất khi chiết bằng ethanol 60%.
Pongpan N và cộng sự [43] dùng methanol 40% để chiết vitexin từ lá cây lạc tiên Passiflora foetida và định lượng vitexin bằng HPLC.
Trên cơ sở tham khảo những tài liệu nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết vitexin từ mẫu chế phẩm bằng hỗn hợp dung môi ethanol : nước tỉ lệ 6:4 và hỗn hợp dung môi methanol : nước tỉ lệ 4:6 (v/v). Kết quả được thể hiện trên các sắc ký đồ sau:
20
Hình 3. 2. Chế phẩm chiết bằng MeOH 40%
Hình 3. 3. Chế phẩm chiết bằng EtOH 60%
Nhận xét: Trong SKĐ của mẫu thử chiết bằng ethanol 60%, thời gian lưu của vitexin là 17,121 phút, purity factor là 0,997. Trong SKĐ của mẫu thử chiết bằng methanol 40%, thời gian lưu của vitexin là 15,443 phút, purity factor là 0,594. Thời gian lưu của vitexin khi chiết mẫu thử bằng methanol 40% ngắn hơn nhưng chỉ số purity factor thấp. Điều đó cho thấy tại vị trí của vitexin có thể có sự hiện diện của nhiều chất khác có cấu trúc hóa học tương tự vitexin ở vị trí pic tR = 15,443 phút, làm cho pic này không tinh khiết. Như vậy chiết bằng methanol 40% không thể tách được vitexin ra khỏi hỗn hợp dược liệu. Trong khi đó mẫu
21
thử chiết bằng ethanol 60% có chỉ số purity factor cao 0,997. Điều này có thể giải thích bởi vitexin có chứa nhiều nhóm hydroxyl linh động và cấu trúc phân tử lớn nên có độ phân cực gần với độ phân cực của ethanol 60% khiến chúng hòa tan tốt hơn.
Kết luận: Lựa chọn ethanol 60% làm dung môi chiết.
3.2.3. Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động có ảnh hưởng đến lực tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động. Do đó khi thay đổi thành phần pha động sẽ làm thay đổi thứ tự rửa giải các chất, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích.
Trong quá trình nghiên cứu, các điều kiện sau đây được giữ cố định trong suốt quá trình khảo sát:
- Cột phân tích SunfireTM C18 (250mm*4,6mm; 5µm); - Nhiệt độ cột: 25ºC;
- Thể tích tiêm: 20 µl; tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector DAD; bước sóng làm việc: 342 nm.
a. Hệ pha động thứ nhất
Theo tài liệu [36], khảo sát hệ pha động gồm đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 và ACN với các chương trình gradient khác nhau.
Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát chương trình gradient điều kiện thứ nhất
Chương trình gradient Thời gian (phút) % ACN
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử (phút) Kết quả Hệ số phân giải Purity factor Match 1 0 → 60 5 → 25 43,356 2 0 → 25 15 → 30 13,852 0,93 0,892 75,1% 3 0 → 25 15 → 25 15,489 1,23 0,998 94,2% 4 0 → 22 15 → 33 12,168 1,57 0,659 97,3%
22
Hình 3. 4. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 1
Hình 3. 5. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 2
Hình 3. 6. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 3
23
pic trùng với thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn ở 43 phút và có phổ giống nhau, như vậy trong mẫu chế phẩm có chứa vitexin. Tuy nhiên với điều kiện này, thời gian lưu giữ của vitexin trong cột quá dài nên cần thay đổi chương trình gradient pha động để tối ưu thời gian rửa giải và lượng dung môi sử dụng.
Với chương trình gradient 2 và 3, thời gian lưu của vitexin đều rút ngắn lại đáng kể tuy nhiên độ phân giải của pic vitexin với pic liền kề thấp, không tách được vitexin khỏi pic liền kề. Với chương trình gradient 4, hệ số phân giải của pic vitexin với pic liền kề tương đối phù hợp nhưng chỉ số purity factor lại thấp (0,659). Điều đó cho thấy tại vị trí của vitexin có thể có sự hiện diện của nhiều chất khác có cấu trúc hóa học tương tự vitexin ở vị trí pic tR = 12,168 phút, làm cho pic này không tinh khiết.
Kết luận: Hệ pha động gồm đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 và ACN với các chương trình gradient đã khảo sát chưa thể tách được vitexin ra khỏi nền mẫu.
b. Hệ pha động thứ hai
Theo tài liệu [30], khảo sát hệ pha động gồm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN với các tỉ lệ khác nhau để lựa chọn điều kiện tách được vitexin ra khỏi nền mẫu.
24
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát các chương trình đẳng dòng
% ACN tR mẫu thử (phút)
tR mẫu chuẩn
(phút) Kết quả
15 30,579 30,094
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau.
19 11,767 11,907
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau.
17 18,164 18,077
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau.
Hệ số match: 88,7% Purity factor: 0,998
17,5 16,298 16,293
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau.
Hệ số match: 96,4% Purity factor: 0,994
Nhận xét: Dựa trên kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy vitexin đặc biệt nhạy với độ phân cực của pha động. Chỉ cần thay đổi một tỷ lệ nhỏ ACN cũng gây nên ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu của vitexin. Ở tỉ lệ 19 % ACN thời gian
25
lưu của vitexin rút ngắn lại đáng kể. Tuy nhiên vì thời gian lưu quá ngắn nên vitexin chưa tách hoàn toàn khỏi các chất khác có trong hỗn hợp dược liệu. Từ kết quả khảo sát nhận thấy chương trình đẳng dòng 17,5 % ACN có khả năng tách tốt nhất, hệ số chồng phổ và độ tinh khiết pic cao.
Kết luận: Lựa chọn dung môi pha động là đệm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN theo chương trình đẳng dòng 17,5% ACN.
Hình 3. 7. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy đẳng dòng 17,5% ACN
3.2.4. Khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu
Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm
Tốc độ dòng (ml/phút) Thể tích tiêm (µl) Rs
1,2 20 1,21
1,3 20 1,44
15 1,50
1,4 20 1,43
Nhận xét: Ở tốc độ dòng 1,3 ml/phút, thể tích tiêm 15 µl các pic vừa đủ tách ra khỏi nhau và có thời gian lưu không quá dài, áp suất bơm cũng phù hợp cho quá trình chạy sắc ký và đảm bảo bơm hoạt động tốt. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa
26
chọn tốc độ dòng 1,3 ml/phút với thể tích tiêm 15 µl cho quá trình phân tích.
Kết luận điều kiện sắc ký: Cột SunfireTM C18 (250 mm*4,6 mm; 0,5 µm), bước sóng phát hiện 342 nm, nhiệt độ cột 250C, thể tích tiêm 15 µl, tốc độ dòng 1,3 ml/phút, pha động đệm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN (82,5:17,5).
3.3.Thẩm định phương pháp định lượng
3.3.1. Độ đặc hiệu
Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát với: - Mẫu trắng: dung dịch ethanol 60%
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn vitexin 10 ppm - Mẫu chế phẩm: chuẩn bị như mục 3.1
- Mẫu chế phẩm thêm chuẩn: hút chính xác 500µl dung dịch chế phẩm và 500 µl dung dịch chuẩn 10 ppm, lọc cho vào vial
Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu
Mẫu Thời gian lưu (phút)
Vitexin chuẩn 14,456
Chế phẩm 14,544
27
Hình 3. 8. Sắc ký đồ kết quả độ đặc hiệu
a) mẫu trắng b) mẫu chuẩn
c) mẫu chế phẩm d) mẫu chế phẩm thêm chuẩn
Nhận xét:
- Trên sắc ký đồ chuẩn vitexin ở bước sóng 342 nm xuất hiện pic ở vị trí 14,456 phút.
- Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không có pic tại thời gian tương ứng với thời gian lưu của vitexin trong mẫu chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu chế phẩm và mẫu chế phẩm thêm chuẩn có pic tại thời gian tương ứng với thời gian lưu của vitexin trong mẫu chuẩn. Hệ số match của vitexin trong mẫu chế phẩm là 97,3 %, trong mẫu chế phẩm thêm chuẩn là 95,7 %. Purity factor của vitexin trong mẫu chế phẩm là 0,995. Pic của vitexin trong mẫu thử tách hoàn toàn khỏi các pic khác trong nền mẫu với Rs = 1,53
a) b)
28
Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ đặc hiệu.
3.3.2. Độ ổn định hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vitexin 10 ppm và ghi lại giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Độ ổn định hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD. Kết quả độ ổn định hệ thống được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3. 5. Kết quả độ ổn định hệ thống
Lần tiêm Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
1 15,023 79,2 2 14,990 79,7 3 14,867 79,2 4 14,933 81,2 5 14,890 79,8 6 14,826 80,0 RSD (%) 0,5 0,9
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu nhỏ hơn 1,0 % và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic nhỏ hơn 2,0 %.
Kết luận: Hệ thống sắc ký ổn định đối với mẫu phân tích.
3.3.3. Đường chuẩn
Đường chuẩn được xây dựng trên một dãy dung dịch chuẩn gồm 8 dung dịch có nồng độ vitexin chuẩn biến thiên trong một khoảng 2 đến 25 ppm.
Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 108 ppm pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 2,16 ppm; 5,4 ppm; 8,65 ppm; 10,8 ppm; 12,96 ppm; 16,2 ppm; 21,6 ppm; 27 ppm.
29
tương ứng với vitexin và nồng độ vitexin chuẩn. Kết quả diện tích pic ở mỗi nồng độ được ghi ở bảng 3.6. Đồ thị hồi quy tuyến tính được thể hiện ở hình 3.9.
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát đường chuẩn
Mẫu Nồng độ (ppm) Diện tích pic
(mAU.s) C1 2,16 25,1 C2 5,4 130,1 C3 8,65 230,8 C4 10,8 292,2 C5 12,96 327,9 C6 16,2 387,3 C7 21,6 529,8 C8 27 666,5
Phương trình hồi quy tuyến tính
y = 24,953 x – 3,0846 r = 0,997
Hình 3. 9. Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ vitexin
Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, tương quan
25,1 130,1 230,8 292,2327,9 387,3 529,8 566,5 y = 24,953x - 3,0846 R² = 0,9935 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 5 10 15 20 25 30 Diệ n tíc h p ic ( m AU .s) Nồng độ (ppm)
30
tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic khảo sát như sau: vitexin tuyến tính trong khoảng nồng độ 2,16 – 27 µg/ml, hệ số tương quan r = 0,997.
Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu.
3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp
Cân mẫu chế phẩm 6 lần khác nhau, mỗi lần khoảng 0,5 g. Thực hiện quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm lần lượt vào hệ thống sắc ký, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD của hàm lượng vitexin trong mẫu chế phẩm. Kết quả độ lặp lại được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3. 7. Kết quả độ lặp lại
Mẫu Khối lượng
(g) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ (µg/ml) Hàm lượng (µg/g) M1 0,4979 118,7 4,881 98,02 M2 0,4952 118,7 4,881 98,56 M3 0,4944 129,7 5,321 107,63 M4 0,4957 125,2 5,141 103,71 M5 0,4949 128,3 5,265 106,39 M6 0,4964 132,6 5,438 109,54 Trung bình (µg/g) 103,98 RSD (%) 4,61
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng trung bình vitexin trong mẫu chế phẩm là 103,98 µg/g và độ lệch chuẩn tương đối là 4,61 %. Theo quy định của AOAC (2016), ở ngưỡng nồng độ 100 µg/g, phương pháp đạt tiêu chí độ lặp lại khi độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng nhỏ hơn 5,3%. Như vậy phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu.
3.3.5. Độ đúng của phương pháp
31
nón. Thêm dung dịch vitexin chuẩn, chiết siêu âm bằng ethanol 60 % trong vòng 10 phút, lọc lấy dịch chiết rồi tiêm lần lượt vào hệ thống sắc ký. Nồng độ vitexin trong mẫu được xác định từ đường chuẩn. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.8.
Bảng 3. 8. Kết quả độ đúng Mẫu Khối lượng mẫu thử (g) Lượng chuẩn Vitexin thêm vào (µg/ml) Lượng Vitexin trong mẫu (µg/ml) Lượng chuẩn tìm lại (µg/ml) Độ thu hồi (%) TB (%) RSD (%) 1 0,2456 3,24 5,197 2,643 81,59 81,82 0,71 2 0,2486 3,24 5,257 2,672 82,48 3 0,2462 3,24 5,197 2,637 81,40 4 0,2472 5,4 7,361 4,791 88,72 85,38 4,94 5 0,2456 5,4 6,908 4,355 80,64 6 0,2465 5,4 7,249 4,686 86,78 7 0,2486 7,56 8,768 6,183 81,79 81,51 1,52 8 0,2485 7,56 8,644 6,060 80,16 9 0,2458 7,56 8,800 6,244 82,60
Nhận xét: Tiêu chuẩn AOAC (2016) cho mức nồng độ 1 – 10 µg/ml: độ thu hồi 80 – 110 % và RSD 7,3 – 11 %. Độ thu hồi của vitexin nằm trong khoảng 80 – 89 % và RSD ở cả 3 mức nồng độ đều nhỏ hơn 7,3 %.
Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng trong khoảng nồng độ khảo sát.
3.3.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Tỉ lệ S/N bằng 3/1 thường được chấp nhận để thiết lập LOD. Tỉ lệ S/N bằng 10/1 thường được chấp nhận để thiết lập LOQ.
32
So sánh đáp ứng của mẫu chuẩn ở nồng độ 0,5 µg/ml với mẫu trắng được kết quả S/N = 15,3/1. Như vậy nồng độ 0,5 µg/ml được chấp nhận là LOQ.
So sánh đáp ứng của mẫu chuẩn ở nồng độ 0,2 µg/ml với mẫu trắng được kết quả S/N = 4/1. Như vậy nồng độ 0,2 µg/ml được chấp nhận là LOD.
Như vậy phương pháp đã được thẩm định qua các tiêu chí độ đặc hiệu, độ ổn định hệ thống, tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC (2016).
3.4.Xác định hàm lượng vitexin trong mẫu chế phẩm
Áp dụng phương pháp trên định lượng vitexin trong 2 mẫu chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên trên thị trường là Viên mất ngủ Nightcare (500 mg lạc tiên) (Công ty TNHH Dược Nanocare Việt Nam, số lô 011119, hạn dùng 17/11/2022) và Viên an thần Mimosa (600 mg lạc tiên) (Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC,