Thành phần pha động có ảnh hưởng đến lực tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động. Do đó khi thay đổi thành phần pha động sẽ làm thay đổi thứ tự rửa giải các chất, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích.
Trong quá trình nghiên cứu, các điều kiện sau đây được giữ cố định trong suốt quá trình khảo sát:
- Cột phân tích SunfireTM C18 (250mm*4,6mm; 5µm); - Nhiệt độ cột: 25ºC;
- Thể tích tiêm: 20 µl; tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector DAD; bước sóng làm việc: 342 nm.
a. Hệ pha động thứ nhất
Theo tài liệu [36], khảo sát hệ pha động gồm đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 và ACN với các chương trình gradient khác nhau.
Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát chương trình gradient điều kiện thứ nhất
Chương trình gradient Thời gian (phút) % ACN
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử (phút) Kết quả Hệ số phân giải Purity factor Match 1 0 → 60 5 → 25 43,356 2 0 → 25 15 → 30 13,852 0,93 0,892 75,1% 3 0 → 25 15 → 25 15,489 1,23 0,998 94,2% 4 0 → 22 15 → 33 12,168 1,57 0,659 97,3%
22
Hình 3. 4. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 1
Hình 3. 5. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 2
Hình 3. 6. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 3
23
pic trùng với thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn ở 43 phút và có phổ giống nhau, như vậy trong mẫu chế phẩm có chứa vitexin. Tuy nhiên với điều kiện này, thời gian lưu giữ của vitexin trong cột quá dài nên cần thay đổi chương trình gradient pha động để tối ưu thời gian rửa giải và lượng dung môi sử dụng.
Với chương trình gradient 2 và 3, thời gian lưu của vitexin đều rút ngắn lại đáng kể tuy nhiên độ phân giải của pic vitexin với pic liền kề thấp, không tách được vitexin khỏi pic liền kề. Với chương trình gradient 4, hệ số phân giải của pic vitexin với pic liền kề tương đối phù hợp nhưng chỉ số purity factor lại thấp (0,659). Điều đó cho thấy tại vị trí của vitexin có thể có sự hiện diện của nhiều chất khác có cấu trúc hóa học tương tự vitexin ở vị trí pic tR = 12,168 phút, làm cho pic này không tinh khiết.
Kết luận: Hệ pha động gồm đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 và ACN với các chương trình gradient đã khảo sát chưa thể tách được vitexin ra khỏi nền mẫu.
b. Hệ pha động thứ hai
Theo tài liệu [30], khảo sát hệ pha động gồm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN với các tỉ lệ khác nhau để lựa chọn điều kiện tách được vitexin ra khỏi nền mẫu.
24
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát các chương trình đẳng dòng
% ACN tR mẫu thử (phút)
tR mẫu chuẩn
(phút) Kết quả
15 30,579 30,094
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau.
19 11,767 11,907
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau.
17 18,164 18,077
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau.
Hệ số match: 88,7% Purity factor: 0,998
17,5 16,298 16,293
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau.
Hệ số match: 96,4% Purity factor: 0,994
Nhận xét: Dựa trên kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy vitexin đặc biệt nhạy với độ phân cực của pha động. Chỉ cần thay đổi một tỷ lệ nhỏ ACN cũng gây nên ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu của vitexin. Ở tỉ lệ 19 % ACN thời gian
25
lưu của vitexin rút ngắn lại đáng kể. Tuy nhiên vì thời gian lưu quá ngắn nên vitexin chưa tách hoàn toàn khỏi các chất khác có trong hỗn hợp dược liệu. Từ kết quả khảo sát nhận thấy chương trình đẳng dòng 17,5 % ACN có khả năng tách tốt nhất, hệ số chồng phổ và độ tinh khiết pic cao.
Kết luận: Lựa chọn dung môi pha động là đệm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN theo chương trình đẳng dòng 17,5% ACN.
Hình 3. 7. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy đẳng dòng 17,5% ACN