Định lượng astilbin trong chế phẩm dược liệu chứa thổ phục linh bằng hplc

Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh .... Trong khi đó, các thành phần của TPL cũng như các dược liệu khác thường khá phức tạp, không thể ứng dụng trực tiếp phương

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ THUỲ LINH

ĐỊNH LƯỢNG ASTILBIN TRONG CHẾ PHẨM DƯỢC LIỆU CHỨA THỔ PHỤC

LINH BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ THUỲ LINH

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích và Độc chất,

Trường Đại học Dược Hà Nội, dưới sự hướng dẫn, tận tình chỉ bảo của TS Trần Nguyên Hà và ThS Nguyễn Thị Thanh Nhài

Lời đầu tiên, tôi xin được phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

đến những người đã hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này: TS Trần Nguyên

Hà, ThS Nguyễn Thị Thanh Nhài, PGS TS Phạm Thị Thanh Hà, ThS Vũ Ngân Bình và ThS Nguyễn Hoàng Lê Các thầy, cô luôn tạo mọi điều kiện

thuận lợi nhất, luôn nhiệt tình giải đáp mọi thắc mắc, luôn khích lệ tinh thần, động viên tôi mỗi khi gặp khó khăn, cũng như gợi ý những hướng giải quyết những vấn đề tôi gặp phải

Tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô của bộ môn Hóa phân tích

và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo điều kiện, giúp

đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân và gia đình đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, xin kính chúc các thầy cô luôn có một sức khỏe dồi dào, luôn hạnh phúc và thành công trong tương lai

Hà Nội, ngày 07 tháng 06 năm 2021

Sinh viên

Hoàng Thị Thuỳ Linh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Astilbin và các thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh 4

1.1.3 Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh 8

1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 11

1.2.1 Khái niệm 11

1.2.2 Cấu tạo hệ thống HPLC 12

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Mẫu thử 13

2.1.2 Hoá chất 13

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Khảo sát qui trình xử lý mẫu 14

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

2.2.3.Thẩm định phương pháp 15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 21

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết 21

3.1.2 Khảo sát thời gian chiết 23

3.1.3 Khảo sát số lần chiết 23

3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 25

3.3 Thẩm định phương pháp 28

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 28

3.3.2 Độ đặc hiệu 28

3.3.3 Xây dựng đường chuẩn 29

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp 30

3.3.5 Độ đúng của phương pháp 31

3.3.6 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 32

3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm viên nang cứng có chứa thổ phục linh trên thị trường 32

3.5 Bàn luận 33

3.5.1 Về quy trình xử lý mẫu 33

3.5.2 Về xây dựng và thẩm định phương pháp 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

Kết luận 35

Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng

cao

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh 8

Bảng 2.1 Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn 19

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hàm lượng AST với các phương pháp chiết khác nhau 22

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết 23

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát số lần chiết 24

Bảng 3.4 Chương trình gradient chạy sắc ký 27

Bảng 3.5 Kết quả độ phù hợp hệ thống 28

Bảng 3.6 Kết quả đường chuẩn……… 29

Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại của phương pháp 31

Bảng 3.8 Kết quả độ đúng của AST 32

Bảng 3.9 Hàm lượng AST của một số chế phẩm chứa Thổ phục linh trên thị trường 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây thổ phục linh 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của AST 4

Hình 1.3 Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và dung môi 5

Hỉnh 1.4 Dihydroflavonol được tách từ rễ TPL 7

Hình 1.5 Một số các flavonoid khác được tách từ rễ TPL 7

Hình 1.6 Lignan glycoside được tách từ rễ TPL 8

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC 12

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 25

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát theo điều kiện sắc ký của Dược điển Việt Nam V26 Hình 3.3 Sắc ký đồ được chọn với pha động MeOH 60% : H20 = 38 : 62 27

Hình 3.4 Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc ở bước sóng 291 nm 28

Hình 3.5 Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ AST 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay bên cạnh các loại thuốc tổng hợp hóa học thì việc sử dụng các loại cây cỏ, thảo mộc để điều chế thuốc chữa bệnh, thực phẩm chăm sóc sức khỏe cũng được phát triển rộng rãi và ngày càng được ưa chuộng Không nằm ngoài xu hướng chung của thế giới, nguồn dược liệu thực vật Việt Nam ngày càng được khẳng định có giá trị to lớn trong việc chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe Nhiều loại thuốc được sản xuất từ dược liệu Việt Nam như Berberin, Palmatin… Đối với các nhà khoa học, các nhà quản lý, yêu cầu về việc kiểm soát thành phần cũng như hoạt tính sinh học của các dược liệu càng được đề cao nhằm mục đích sử dụng chúng một cách hợp lý, khoa học và hiệu quả Trong số các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu đầy đủ về hoạt chất và hoạt tính sinh học, trong đó phải kể đến là cây Thổ phục linh

Thổ phục linh (Smilax glabra)vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng miền núi ở nước ta Từ rất lâu, trong Y học cổ truyền Việt Nam, Thổ phục linh được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt, trị giun sán, ung nhọt, giải độc, chống viêm …[1] Theo Y học cổ truyền Trung Quốc thì rễ của Thổ phục linh (TPL) có tác dụng giải độc, làm giảm mất nước, có thể được sử dụng để điều trị bệnh trùng xoắn, viêm da, bệnh giang mai, bệnh brucella, cấp tính do vi khuẩn kiết lỵ…[1]

Y học hiện đại cũng chỉ ra trong rễ Thổ phục linh có chứa astilbin (AST), đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn hoạt động của acid uric trong máu, tăng sản hoạt dịch, giảm viêm, ngăn chặn xâm nhập tế bào vào màng hoạt dịch,

từ đó làm giảm quá trình ăn mòn sụn khớp [18, 21] Hơn nữa, trong các loài

TPL, chỉ có chi Smilax chứa AST có tác dụng dược lý và là chất chỉ điểm của

loài này [3] Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về thành phần hoá học [4], hoạt tính sinh học [3, 4] cũng như phương pháp định tính, định lượng trong dược liệu TPL [2, 4] Trong DĐVN V, AST đã được lựa chọn làm chất đánh dấu trong cả chỉ tiêu định tính và định lượng cho dược liệu TPL [2] Nhưng

chưa có nghiên cứu nào xây dựng phương pháp định lượng AST trong dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ từ TPL và các dược liệu khác Trong khi đó, các thành phần của TPL cũng như các dược liệu khác thường khá phức tạp, không thể ứng dụng trực tiếp phương pháp định lượng AST trong dược liệu của Dược điển Việt Nam vào các sản phẩm này Các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa TPL trên thị trường chủ yếu là dạng viên nang cứng, một số ít là dạng cao lỏng, nước uống, viên hoàn

Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng Astilbin trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng HPLC” nhằm mục tiêu như sau: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AST trong chế phẩm chứa Thổ phục linh bằng HPLC góp phần kiểm tra chất lượng sản phẩm

Thổ phục linh có tên khoa học là Smilax glabra hay còn gọi là Khúc

Khắc, Kim cang, khau đâu, cẩu ngổ lực (Tày), mọi hoi dòi (Dao), D’rang lò (Châu Mạ), tơ pớt (K’Ho), Lái (K’Dong), Smilax gabre, squine (Pháp) TPL

thuộc chi Khúc Khắc (Smilax) là chi của khoảng hơn 200 loài dây leo hay thân

thảo trong thực vật có hoa, nhiều loài trong số đó là các cây thân gỗ hay có gai

Các loài trong chi Smilax mọc thành dạng cây bụi, tạo ra bụi rậm dày đặc khó xuyên qua Chúng thuộc họ Smilacaceae Tên gọi là Sarsaparilla là tên chung cho nhiều loài thuộc họ Khúc Khắc (Smilacaceae)

Có rất nhiều loài của họ Smilacaceae mang chung một tên là Sarsaparilla

như loài offiinalis, aristolochiaefolia, glabra, febrifuga, ornata, regelii, japicanga mọc ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới nhưng giống nhau về hình dáng, về tính năng và thành phần hoá học cũng như sử dụng Họ Khúc Khắc bao gồm khoảng

350 loài, được phân bố tại những vùng khí hậu ôn hoà, nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Mỹ, Jamaica, Caribbean, Mexica, Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt

Nam,… Trong đó Smilax glabra ( Roxb) phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Đài

Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam Ở Việt Nam, TPL phẩn bố rải rác khắp các tỉnh ở miền núi cũng như trung du và một vài đảo lớn TPL là loại cây leo, sống lâu năm, trườn dài 4-5 m (có thể tới 10 m), phân nhiều cành Cành nhỏ, mềm, không gai, lá mọc so le, hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 5-11 cm, rộng 1-5 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên sáng bóng, mặt dưới bệnh như phấn trắng, lá khô có màu hạt dẻ rất đặc sắc, gân chính 3, cuống lá dài 1 cm mang tua cuốn mảnh và dài do lá kèm biến đổi Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cuống rất ngắn và gần như không cuống, mang 1 tán đơn gồm nhiều hoa màu vàng nhạt, cuống hoa mảnh như sợi chỉ, dài 1 cm hoặc hơn Hoa đực và hoa cái riêng rẽ, hoa đực có lá đài hình tim dày, cánh hoa bầu hơi khum, nhị không cuống, bao phấn thuôn, hoa cái giống hoa đực Sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm Tuy nhiên chỉ những cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả Quả mọng, hình cầu, đường kính 6-7 mm gần như 3 cánh, chứa 3 hạt, khi chín màu đen [1]

1.1.2 Astilbin và các thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh

Astilbin

- AST là một flavanonol, một dạng của flavonoid có dạng đồng phân 2R – trans, dạng neoisoastilbin là đồng phân (2S – cis) và isoastilbin là dạng đồng phân (2R-cis) AST được tìm thấy trong nhiều họ như Hypericaceae, Smilacaceae, ….như hình 1.2

- CTPT: C21H22O11

- Trọng lượng phân tử: 450 g/mol

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: (2R,3R) – 2 - (3”,4”- dihydroxyphenyl) - 5,7 – dihydroxy –

3 - [(2S,3R,4R,5R,6S) - 3,4,5 – trihydroxy – 6 – methyloxan – 1 - yl] oxy - 2,3 dihydrochromen – 4 - ol

- Tên thường gọi: Astilbin; Taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside

- Dạng đồng phân này của AST được phân lập từ rễ của cây thổ phục linh

(Smilax glabra Roxb) AST được xem là hoạt chất chính trong rễ Thổ phục linh

AST được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc, nó có tác dụng trừ sâu, kháng khuẩn và làm lành vết thương Những nghiên cứu mới đây đã chỉ ra AST

có tác dụng chống ung thư [19], tác dụng bảo vệ gan [32], chống oxy hoá [17]

và kháng khuẩn [20]

- Độ ổn định của AST:

Hình 1.3 Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và dung môi [29]

Sự phân huỷ của AST phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường cùng với

sự đồng phân hoá của AST thành 3 đồng phân lập thể của nó Quá trình phân

huỷ tuân theo mô hình động học bậc nhất và tốc độ phân huỷ có k tăng lên trong khi thời gian bán rã giảm khi pH và nhiệt độ tăng lên Tính ổn định của AST liên quan đến sự thay thế vòng B Ngoài ra, độ ổn định của AST khác nhau tuỳ thuộc vào dung môi và tuân thủ theo thứ tự 50% ethanol > ethanol > methanol > 50% methanol > nước [29] Độ ổn định của AST được mô tả trực tiếp như hình 1.3

Nhận xét:

- AST là hợp chất có vòng thơm benzen nên khả năng hấp thụ UV-VIS mạnh Do đó, có thể phát hiện AST bằng detector UV-VIS

- AST có độ ổn định phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và môi trường chiết xuất

Do đó, khi lựa chọn điều kiện chiết xuất, điều kiện định lượng cần lựa chọn dung môi, nhiệt độ, pH thích hợp để không ảnh hưởng đến kết quả

Thành phần hoá học trong rễ Thổ phục linh

Trong dịch chiết nước của rễ TPL, polysaccharid chiếm hàm lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ phục linh đã từng sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở Trung Quốc Rất nhiều các cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục linh quyết định dược tính đã được phân lập Trong đó, lớp chất các flavonoid được xem là các cấu tử hoạt tính chính, ngoài ra là các hợp chất phenylpropanoid glycoside, lignan glycoside, các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó bao gồm là các resveratrol, các acid hữu cơ và một số các hợp chất khác Tổng cộng có khoảng 40 hợp chất

đã được phân lập từ rễ TPL

Các flavonoid [45, 46]: Lớp hoạt chất chính trong rễ thổ phục linh là các flavonoid, trong đó có 12 flavonoid đã được tách ra thuộc về 5 hợp chất là dihydroflavonol, dihydroflavone, flavonol, isoflavon và flavanol Trong các flavonoid được phân lập thì dihydroflavonol có hàm lượng chính bao gồm khoảng 10 cấu tử là astilbin (3-O-alpha-L-rhamnoside-5,7,3’,4’-tetrahydroxydihydroflavonol)(1) hay (taxifolin-3-O-alpha-L-rhamnoside) và các dạng đồng phân lập thể của nó là neoastilbin(2), isoastilbin(3), neoisoastilbin(4),

stereoisomeride isoengeletin(8), smitilbin(9) và đồng phân lập thể của nó là neosmitilbin(10) được mô tả trong hình 1.4 Những flavonoid khác là các flavone là quercetin(11), naringenin(12), isoflavon 7,6”-dihydroxy-3”-methoxyisoflavon(13) và flavanol(-)-epicatechin(14) được trình bày trong hình 1.5

Hỉnh 1.4 Dihydroflavonol được tách từ rễ TPL

Hình 1.5 Một số các flavonoid khác được tách từ rễ TPL

Lignan glycoside: lignan glycoside là chất mới (+) – syringaresinol β-D-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside đã được tách ra với 12 cấu tử trên bởi Yuan(2003) [47]

4-O-Hình 1.6 Lignan glycoside được tách từ rễ TPL

Các hợp chất phenylpropanoid glycoside [12] là lớp chất thứ hai có 7 cấu

tử trong đó 5 cấu tử mới là smiglaside A-E

Các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó [45]: lớp chất này bao gồm 9 cấu tử gồm các resveratrol

Các acid hữu cơ bao gồm các butan diacid, palmitic acid, và

2,2-dimethylsuccinic acid

Các chất sterol gồm các β-sterol và stigmasterol Cuối cùng là các hợp chất khác như các fructoside, các hợp chất dị tố, các acid amine, protein, …

1.1.3 Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích AST từ dược liệu Thổ Phục Linh STT

lưu trong 1h - Bước sóng phát hiện 291

detector UV tại bước sóng

320 nm; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích bơm mẫu 10µl

- Pha động: gradient ACN:

HCOOH 0,2% thay đổi tỉ lệ

từ 20: 80 đến 95:5

- Định lượng đồng thời AST và emodin trong bài thuốc GK1 (gồm nhiều loại dược liệu) với hàm lượng được xác định lần lượt là 3,30 ± 0,02 mg/g và 0,55 ± 0,02 mg/g tính theo khối lượng khô tuyệt đối

- Hiệu suất chiết AST

là 94,86 ± 4,44 % và emodin là 62,61 ± 2,70 %

- Pha động Methanol : nước (0,3% acid acetic), chạy gradient

- Thời gian chạy 40 phút;

- 1,1% so với trọng lượng mẫu củ khô (trừ vùng Sơn La 0,74%)

- Pha động: acid acetic 0,1%

- acetonitril (70:30, v/v)

- LOD là 0,5 μg/ml, - LOQ là 1,5 μg/ml

- Thời gian lưu của AST ở khoảng 19 phút

- Thẩm định phương pháp cho độ chính xác cao (98,3 ± 4,6% đến 102,5 ± 1,0%) và

- Pha động: acetonitril và acid phosphoric 0,05% chạy

gradient

- Khoảng tuyến tính của AST là 0,018 – 0,288 mg/ml

- Độ thu hồi trung bình từ 99,6%-102,1% với RSD = 1,9%

Nhận xét:

- Qua các nghiên cứu trong nước và trên thế giới, nhóm nghiên cứu nhận thấy AST được xác định hàm lượng trong dược liệu Thổ phục linh mà chưa có trong các chế phẩm

- Để chiết AST, dung môi được sử dụng chủ yếu là Methanol và Ethanol với các phương pháp chiết khác nhau như hồi lưu, siêu âm, chiết nóng, chiết ở nhiệt độ phòng, …Trong đó, chiết siêu âm với dung môi Methanol cho kết quả

có độ chính xác khá cao, thao tác đơn giản và nhanh

- Phương pháp phân tích được sử dụng chủ yếu là HPLC với hệ pha động

và bước sóng phát hiện khác nhau Pha tĩnh được sử dụng chủ yếu là cột C18 của các hãng khác nhau

- Khoảng tuyến tính ở mỗi hệ dung môi trong các nghiên cứu khác nhau nhiều Hệ pha động Acetonitril và acid phosphoric có khoảng tuyến tính dài từ

Trong HPLC, tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký người ta chia thành:

- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC)

- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: Pha thường (Normal phase: NP-HPLC), Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)

1.2.2 Cấu tạo hệ thống HPLC

Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Hình 1.7) gồm các bộ phận sau:

- Pha động: Dung môi đưa mẫu đi qua cột

- Pha tĩnh: Cột sắc ký đặt trong buồng cột

- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột

- Detector (DAD): Phát hiện chất phân tích trong mẫu

- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

- Thời gian lưu giữ

- Hệ số phân bố và hệ số dung lượng

- Độ chọn lọc

- Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký

- Khả năng phân giải

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thử

Chế phẩm nghiên cứu là 6 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe (T1 đến T6) của Nanocare, Khương thảo đan, Goutcare, Viên gout Tâm Bình, Vương thảo kiện cốt với một số lô khác nhau Các mẫu được mua ngẫu nhiên trên thị trường Trong đó T1 được sử dụng để làm nền mẫu khảo sát xây dựng phương pháp định lượng

- Viên gout Nanocare: Sản xuất tại phân xưởng SX TPCN BKST2269 của Công ty CP Khoa học Kỹ thuật Bách Khoa; số lô sản xuất: 090419; hạn dùng:

- Viên gout Tâm Bình: Sản xuất tại Công ty Dược phẩm Tâm Bình; số lô

và ngày sản xuất: 06042020

- Gudcare: Sản xuất tại Công ty TNHH sản xuất DP công nghệ cao Nanofrance; Số lô sản xuất: 010120; số đăng kí: 66/2020/ĐKSP; hạn dùng: 18/01/2023

2.1.2 Hoá chất

- Chuẩn đối chiếu: AST mua từ Biopurify Phytochemicals ( Trung Quốc) (98,00%, Lot No PRF9022741)

- Dược liệu chuẩn mua tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (SKS:

CV 0116035.01), dược liệu mua ngẫu nhiên ở cửa hàng bán dược liệu

- Methanol (Merk) dùng cho HPLC

- Nước cất hai lần

- Acid acetic, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn hoá chất tinh khiết phân tích dùng cho HPLC

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 Series (Mỹ)

- Cột sắc ký Sunfire C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), sử dụng phần mềm

xử lý số liệu Agilent ChemStation

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)

- Phễu lọc Buchner, màng lọc cellulose 0,45 µm

- Cân phân tích A&D, Model GR-200, Nhật Bản, d = 0,1 mg

- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, vial, chày và cối

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thực hiện được khảo sát và xây dựng phù hợp với từng nội dung và theo hướng dẫn của AOAC 2013

2.2.1 Khảo sát qui trình xử lý mẫu

Tiến hành khảo sát phương pháp chiết, thời gian chiết, số lần chiết Dựa vào diện tích pic của chất phân tích trên thiết bị sắc ký HPLC để lựa chọn quy trình xử lý mẫu cho hoạt chất AST trong chế phẩm tối ưu sau khi chiết

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

phân tích để chọn pha động Các pha động được khảo sát là hỗn hợp của MeOH 60% và các dung dịch sau:

- Acid acetic băng 1%

- Acid phosphoric 0,1%

- Nước cất 2 lần

Các dung dịch trên được chuẩn bị như sau:

- Dung dịch acid acetic băng 1%: Hút chính xác 10,0 ml acid acetic 100% vào bình định mức 1000 ml Thêm nước cất 2 lần từ từ, định mức cho vừa đủ thể tích Lắc đều

- Dung dịch acid phosphoric 0,1%: Hút chính xác 600 µl acid phosphoric 85% vào bình định mức 100,0 ml Thêm nước cất 2 lần từ từ, định mức vừa đủ thể tích Lắc đều

- Methanol 60%: Lấy chính xác 600 ml dung dịch MeOH 100% cho HPLC vào bình định mức 1000,0 ml Thêm nước cất 2 lần định mức vừa đủ thể tích Lắc đều

- Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic và thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%

- Tiến hành:

+ Mẫu chuẩn gốc: Cân chính xác 5 mg AST cho vào bình định mức 5,0

ml, hoà tan và định mức bằng dung dịch MeOH 60%, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000 ppm (µg/ml)

+ Mẫu chuẩn làm việc: Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, định mức vừa đủ bằng MeOH 60% Mẫu có nồng độ 10 ppm

+ Tiêm 6 lần mẫu chuẩn làm việc

- Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn 100% có thời gian lưu (≤ 2,0%) và diện tích pic (≤ 2,0 %) của AST đều nằm trong khoảng cho phép thì hệ thống sắc ký là ổn định để định lượng AST

b) Độ đặc hiệu

- Độ đặc hiệu của phương pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất và các chất cản trở khác

- Yêu cầu: Thời gian lưu AST của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn phải tương đương nhau Pic trong mẫu thử và thử thêm chuẩn phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu Dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của AST trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

- Tiến hành: Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng MeOH 60%, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích của các pic thu được

- Chuẩn bị các mẫu như sau:

+ Mẫu trắng: dung dịch pha mẫu MeOH 60%

+ Mẫu chuẩn: mẫu chuẩn AST nồng độ 10 ppm

+ Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,1250 g chế phẩm T1 vào bình định mức 10,0 ml, định mức vừa đủ bằng dung môi MeOH 60% Xử lý mẫu như mục 3.1 thu được mẫu thử T1

+ Mẫu thử thêm chuẩn: chuẩn bị thêm một mẫu thử T1 như trên, thêm 70

µl chuẩn AST nồng độ 1000 ppm, trộn đều thu được mẫu thử thêm chuẩn

c) Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

đo được và nồng độ các chất phân tích

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở

đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích

- Thực hiện:

+ Mẫu chuẩn AST gốc: dung dịch chuẩn Astilbin trong MeOH 60% nồng

độ 1000 ppm

+ Mẫu chuẩn AST pha loãng: lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn AST

1000 ppm pha vào bình định mức 10,0 ml Thêm dung dịch MeOH 60% đến vạch để được dung dịch có nồng độ 100 ppm

+ Từ dung dịch chuẩn gốc AST tiến hành pha loãng bằng MeOH 60% để được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 1 ppm; 2 ppm; 5 ppm; 10 ppm;

15 ppm; 20 ppm

+ Dùng micropipet hút chính xác lần lượt 10 µl; 20 µl; 50 µl; 100 µl; 150 µl; 200 µl dung dịch chuẩn AST 100 ppm rồi thêm chính xác lượng dung môi MeOH 60% cho đủ 1000 µl

+ Viết phương trình thể hiện mối tương quan của diện tích pic theo nồng

độ của mỗi chất và đánh giá đường chuẩn dựa vào hệ số tương quan r

d) Độ chính xác của phương pháp

- Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định

+ Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng

+ Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác, đổi kiểm nghiệm viên và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác

𝑖=1

𝑁 − 1Trong đó: xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i

𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

N: Số lần thử nghiệm

- Yêu cầu:

+ Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch

chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng AST không quá 2%

+ Độ chính xác trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày và 12 lần thử trong hai ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn

tương đối RSD (%) của hàm lượng AST không quá 3%

e) Độ đúng

- Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

- Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

- Tiến hành: thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng hoạt chất một lượng chính xác chất chuẩn sao cho nồng độ AST trong mẫu thử ở các khoảng 5 ppm, 10 ppm và 15 ppm Mỗi mức nồng độ làm 03 mẫu Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Tính tỷ lệ lượng AST thu hồi lại được so với lượng thêm vào

𝑅(%) =𝐶𝑡𝑐 − 𝐶𝑛

𝐶𝑥 × 100 % R: độ thu hồi (%)

𝐶𝑡𝑐: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (ppm)

Cn: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (ppm)

𝐶𝑥: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppm)

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (85 - 110%) ở mỗi mức nồng độ và giá trị RSD

(%) của tỷ lệ thu hồi phải ≤ 6,0 % ở mỗi mức nồng độ

- Chuẩn bị các dung dịch thẩm định như sau:

+ Chuẩn bị 9 mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,1250 g bột thuốc mẫu T1

đã nghiền vào bình định mức 10,0 ml

+ Chuẩn bị 9 mẫu thử thêm chuẩn ở các mức nồng độ 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm: Thêm chính xác vào các mẫu thử đã cân ở trên x µl dung dịch chuẩn gốc AST 1000 ppm Thêm dung môi MeOH 60% vào lắc đều và định mức vừa đủ Làm tương tự các bước siêu âm, lắc xoáy và ly tâm như chuẩn bị dung dịch thử

ở phần 3.1 Hút dịch sau khi ly tâm vào xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µl vào

lọ đựng mẫu, thu được 9 dung dịch thử ở các mức nồng độ 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm

Bảng 2.1 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên

Bảng 2.1 Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn

f) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Pha loãng dần mẫu chuẩn bằng dung môi pha mẫu Tiến hành phân tích các dung dịch pha loãng trên Trên sắc ký đồ thu được, xác định đáp ứng pic

(chiều cao) tương ứng với mỗi mức nồng độ Xác định giá trị LOD của phương pháp dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu Trong đó LOD là giá trị nồng độ mà ở

đó có đáp ứng pic Astilbin gấp khoảng 3 lần giá trị nhiễu đường nền Sau khi xác định giá trị LOD, tính giá trị LOQ thông qua công thức:

LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt)

2.3 Áp dụng phương pháp

Áp dụng phương pháp trên tiến hành phân tích astilbin trong các mẫu chế phẩm chứa Thổ phục linh còn lại có dạng bào chế tương tự mẫu chế phẩm đã được khảo sát

- Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký

và nồng độ chất phân tích: Y=aX + b

Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT;

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết

Từ chuyên luận của Dược điển Việt Nam V: lấy 0,8 g nguyên liệu Thổ phục linh được chiết hồi lưu (HL) trong 100 ml MeOH 60% Tuy nhiên, nhận thấy các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa Thổ phục linh trên thị trường thường là dạng cao khô, viên nang cứng nên có thể chiết AST đơn giản hơn so với Dược điển Do vậy, tiến hành khảo sát phương pháp chiết siêu âm (SA) và HL đối với

cả 2 đối tượng:

- Nguyên liệu Thổ phục linh: dược liệu chuẩn mua tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKN) và mẫu mua ngoài thị trường (TT)

- Thực phẩm bảo vệ sức khỏe T1: phương pháp siêu âm (SA) và HL với tỉ

lệ khối lượng dược liệu/dung môi tương tự như Dược điển

Quy trình xử lý mẫu được áp dụng như sau:

+ Với các mẫu dược liệu cho phương pháp chiết SA: cân chính xác khoảng 0,0250 g bột dược liệu chuẩn (VKN) và dược liệu trên thị trường (TT)

đã được nghiền mịn vào từng bình định mức 10,0 ml, thêm MeOH 60% định mức vừa đủ 10 ml, lắc đều, siêu âm 10 phút Lắc đều rồi lấy 1 lượng dịch đem ly tâm Hút dịch sau khi ly tâm vào xylanh, lọc qua màng 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, được dung dịch VKN-SA và TT-SA nồng độ 2,5 mg/ml (khối lượng dược liệu/dung môi)

+ Với mẫu chế phẩm cho phương pháp SA: cân chính xác khoảng 0,1250

g bột chế phẩm đã nghiền mịn (tương đương 0,0250 g thổ phục linh) vào bình định mức 10,0 ml Làm tương tự với quy trình chiết trên được dung dịch T1-SA nồng độ 12,5 mg/ml (khối lượng chế phẩm/dung môi)

+ Với mẫu dược liệu cho chiết HL: cân chính xác khoảng 0,8000 g bột dược liệu chuẩn và bột dược liệu trên thị trường đã nghiền mịn vào từng bình nón nút mài, thêm chính xác 100 ml MeOH 60%, đậy nút cân Đun hồi lưu trong 1h, để nguội, đậy nút, cân lại Bổ sung khối lượng mất đi bằng MeOH 60%, lắc

đều, ly tâm Hút chính xác 312 µl dịch này và 688 µl MeOH 60% vào dụng cụ pha mẫu, trộn đều, lọc qua màng 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, được dung dịch VKN-HL và TT-HL nồng độ 2,5 mg/ml (khối lượng dược liệu/dung môi)

+ Với mẫu chế phẩm cho chiết HL: cân chính xác khoảng 2,000 g bột chế phẩm đã nghiền mịn (tương đương 0,4 g thổ phục linh) vào một bình nón nút mài, thêm chính xác 50 ml MeOH 60%, đậy nút cân Làm tương tự các bước như trên, được dung dịch T1-HL nồng độ 12,5 mg/ml (khối lượng chế phẩm/ dung môi)

Sau khi chiết, tiến hành sắc ký với 6 mẫu dung dịch, mỗi mẫu 1 lần thu được kết quả như bảng 3.1 và phụ lục 6

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hàm lượng AST với các phương pháp chiết khác

nhau Khối lượng

(mg)

Thể tích dung môi (ml) Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%, kl/kl)

và ở 55oC, t1/2 chỉ khoảng 2,5 giờ [29] Với phương pháp chiết HL với MeOH, nhiệt độ chiết HL ở khoảng 70oC, do đó nguyên nhân chiết HL thấp hơn có thể

do AST không bền với nhiệt Vì vậy lựa chọn phương pháp chiết SA trong chế phẩm cho các khảo sát tiếp theo

3.1.2 Khảo sát thời gian chiết

Do độ ổn định của AST bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ và môi trường nên cần khảo sát thời gian chiết để tránh chiết quá lâu, nhiệt độ tăng lên làm astilbin bị phân huỷ

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,2500 g bột chế phẩm T1 đã nghiền mịn vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi MeOH 60% vừa đủ, lắc đều Siêu âm liên tục Lấy dịch lọc ở các mốc thời gian lần lượt 5 phút, 10 phút, 20 phút và 30 phút Lọc dịch chiết qua màng lọc cellulose 0,45 µm lọ đựng mẫu Tiến hành sắc ký được kết quả như bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết Khối lượng

(mg)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%, kl/kl)

Khi siêu âm mẫu 10 phút, hàm lượng AST tăng lên 7,1% so với khi siêu

âm 5 phút, khi siêu âm đến 20 phút thì hàm lượng AST hầu như không tăng lên hoặc tăng lên rất ít Siêu âm đến 30 phút thì hàm lượng AST bắt đầu có xu hướng giảm Mặc dù quá trình chiết không gia nhiệt, nhưng khi thời gian chiết >

20 phút, nhiệt độ dung dịch bắt đầu bị tăng lên đáng kể, và tới 30 phút, nhiệt độ tăng lên lớn hơn 50°C Do đó, hàm lượng AST giảm khi tăng thời gian chiết SA cũng có thể do nhiệt độ Để tiết kiệm thời gian chiết mẫu trong quá trình làm thực nghiệm và tránh chiết lâu AST bị phân huỷ do nhiệt, thời gian chiết siêu âm được lựa chọn là 10 phút

10 phút, lấy dịch đem ly tâm Hút một lượng dịch bằng xylanh lọc qua màng lọc 0,45 µm vào lọ đựng mẫu thu được dịch T1-1 chiết lần 1 Gạn phần dịch còn lại trong ống nghiệm, thu phần cắn, rửa sạch nhiều lần bằng MeOH 60% Thêm tiếp 3 ml MeOH 60%, tiến hành siêu âm tương tự lần 1, thu được dung dịch T1-

2 chiết lần 2 Làm tiếp với 2 ml MeOH 60% thu được dịch T1-3 chiết lần 3 Tiến hành sắc ký các mẫu chiết, đánh giá hiệu suất và lựa chọn số lần chiết Kết quả được tổng hợp dưới bảng 3.3 và phụ lục 7

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát số lần chiết

Lần chiết Khối lượng

(mg)

Thời gian lưu ( phút)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%, kl/kl) Lần 1

126,1

(-): không phát hiện pic của AST

Kết quả cho thấy, sau lần chiết 1 siêu âm 10 phút thì hầu như Astilbin đã được chiết hết và đạt hàm lượng là 0,0296% Tiến hành chiết lần 2 và lần 3 thì không thấy xuất hiện pic của astilbin trên sắc ký đồ nữa Do đó, lựa chọn chiết 1 lần siêu âm 10 phút là phù hợp nhất

Như vậy, quy trình xử lý mẫu được xây dựng như hình 3.1:

Tháo bỏ lớp vỏ nang cứng của 20 viên chế phẩm, trộn đều và nghiện mịn phần bột, sau đó cân chính xác khoảng 0,1250 g bột trên (tương ứng với khoảng 0,0250 g dược liệu thổ phục linh) vào bình định mức 10,0 ml Thêm dung môi MeOH 60% vừa đủ định mức, lắc đều rồi đem siêu âm 10 phút Sau 10 phút lấy bình ra khỏi bể siêu âm Lấy một lượng dịch đem ly tâm Hút dịch sau khi ly tâm bằng xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, thu được dung dịch thử dùng để định lượng astilbin trong chế phẩm

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V về định lượng astilbin trong dược liệu Thổ phục linh, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện đấy trên chế phẩm T1 như sau:

Tháo lớp vỏ nang cứng của chế phẩm

Nghiền bột của 20 viên chế phẩm

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát theo điều kiện sắc ký của Dược điển Việt Nam

Hình 3.3 Sắc ký đồ được chọn với pha động MeOH 60% : H20 = 38 : 62

Từ kết quả thực nghiệm trên, xây dựng phương pháp phân tích AST trong chế phẩm có chứa thổ phục linh như sau:

3.3 Thẩm định phương pháp

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống

Chuẩn bị dung dịch chuẩn AST 10ppm như mục 2.2.3 Sau đó tiến hành sắc ký mẫu này 06 lần theo phương pháp đã xây dựng Ghi lại các sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic như bảng 3.5 và phụ lục 1

Bảng 3.5 Kết quả độ phù hợp hệ thống

(phút)

Diện tích pic (mAU.s)

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số phân tích

đều dưới 2% Như vậy, phương pháp đã đạt tiêu chuẩn về độ ổn định hệ thống với chất AST

3.3.2 Độ đặc hiệu

Chuẩn bị các mẫu như trong mục 2.2.3 Sau đó tiến hành sắc ký theo phương pháp ở mục 3.2 Kết quả được thể hiện dưới hình 3.4

Hình 3.4 Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc ở bước sóng 291 nm

- Trên sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn (mẫu thử thêm chuẩn - hình 2d)

có pic chất tương ứng với thời gian lưu của pic AST trong dung dịch chuẩn

- Pic tương ứng AST trong mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn được tiến hành chồng phổ với pic AST chuẩn, cho hệ số chồng phổ > 0,99 Độ tinh khiết của các pic AST trong mẫu thử và thử thêm chuẩn cũng đạt > 0,999 Như vậy phương pháp có độ đặc hiệu đối với AST

Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc với AST Pic AST có

thời gian lưu khoảng 19,90 phút

3.3.3 Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị các mẫu chuẩn như trong mục 2.2.3 Sau đó tiến hành sắc ký theo phương pháp đã xây dựng ở mục 3.2 Kết quả được thể hiện dưới bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả đường chuẩn

Nồng độ

(ppm) 1,076 2,152 5,380 10,76 16,14 21,52 Diện tích pic

Hình 3.5 Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ AST

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, đã có sự tương quan tuyến tính

giữa nồng độ và diện tích pic của AST Sự tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 1,076 ppm đến 21,52 ppm; hệ số tương quan r = 0,997

Kết luận: phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp

Chuẩn bị các mẫu thửnhư trong mục 2.2.3 theo quy định như trong mục 3.1 Sau đó tiến hành sắc ký theo phương pháp ở mục 3.2 Kết quả được thể hiện dưới bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại của phương pháp

Ngày STT m thử (mg) Nồng độ mẫu thử

astilbin (ppm)

% HL astilbin (kl/kl)

Nhận xét: Độ lặp lại trong ngày của hàm lượng AST đạt yêu cầu, thể hiện

bởi RSD < 2% và độ lặp lại khác ngày của hàm lượng AST đạt yêu cầu, thể hiện bởi RSD<3%

Kết luận: Phương pháp đạt về độ chính xác

3.3.5 Độ đúng của phương pháp

Chuẩn bị các mẫu như mục 2.2.3 theo quy định như trong mục 3.1 Sau

đó tiến hành sắc ký theo phương pháp ở mục 3.2 Kết quả được thể hiện dưới bảng 3.8 và phụ lục 4

Bảng 3.8 Kết quả độ đúng của AST

STT m thử

(mg)

Lượng AST trong mẫu thêm chuẩn (μg/ml)

Lượng chuẩn AST thêm vào (μg/ml)

Lượng chuẩn AST tìm lại (μg/ml)

Độ thu hồi (%)

Trung bình (%)

Nhận xét: Tỷ lệ tìm lại trung bình của các mức nồng độ lần lượt là

103,01% - 106,45% đạt yêu cầu về tỷ lệ thu hồi (80-110%)

Kết luận: Phương pháp đạt về độ đúng

3.3.6 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

So sánh đáp ứng của mẫu chuẩn AST ở nồng độ 0,083 ppm với nhiễu được kết quả S/N=3,5 Như vậy nồng độ 0,083 ppm được chấp nhận là LOD LOQ là 0,25 ppm Sắc ký đồ được thể hiện ở phụ lục 5

Như vậy, phương pháp đã xây dựng được thẩm định đầy đủ theo AOAC

2013, phù hợp định lượng AST trong chế phẩm chứa Thổ phục linh

3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm viên nang cứng có chứa thổ phục linh trên thị trường

Áp dụng quy trình trên để định lượng AST trong một số chế phẩm có chứa Thổ phục linh bán trên thị trường Kết quả được trình bày trong bảng 3.9