1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu tác dụng điều trị bệnh gout trên thực nghiệm của chế phẩm viên nang chứa thổ phục linh, hy thiêm và một số dược liệu khác

156 3 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 156
Dung lượng 4,72 MB

Nội dung

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH NHÀI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NANG CHỨA THỔ PHỤC LINH, HY THIÊM VÀ MỘT SỐ DƢỢC LIỆU KHÁC LUẬN VĂN DƢỢC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II HÀ NỘI, NĂM 2022 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH NHÀI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NANG CHỨA THỔ PHỤC LINH, HY THIÊM VÀ MỘT SỐ DƢỢC LIỆU KHÁC LUẬN VĂN DƢỢC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LÝ VÀ DƢỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: CK 62720405 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thuỳ Dƣơng PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Nhài LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này, nhận giúp đỡ quý báu thầy cô, bạn bè người thân Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà - Người thầy ln tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy Đảng ủy, Ban giám hiệu, phịng Đào tạo sau đại học; PGS.TS Đào Thị Vui – trưởng Bộ mơn Dược lực tồn thể thầy cô, kỹ thuật viên môn Dược lực; PGS.TS Trần Ngun Hà – trưởng Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất tồn thể thầy cơ, kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất; thầy mơn, phịng ban khác Trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, nhà khoa học Hội đồng duyệt đề cương, Hội đồng chấm luận văn góp ý cho tồi nhiều kiến thức quý báu để hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, cán giảng viên Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình người thân, người ln bên cạnh ủng hộ hết lòng, nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2022 Nguyễn Thị Thanh Nhài MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT D NH MỤC ẢNG 10 D NH MỤC H NH 11 T VẤN Ề Chƣơng NỘI DUNG 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH GOUT 1.1.1 Đại cương bệnh gout 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh gout 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng bệnh gout 1.1.4 Điều trị bệnh gout 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM NGHIÊN CỨU 12 1.2.1 Các thuốc từ dược liệu có chứa thổ phục linh, hy thiêm có tác dụng điều trị bệnh gout 12 1.2.2 Các dược liệu có chế phẩm nghiên cứu 13 1.3 TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG VÀ CÁC MƠ HÌNH, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM THƢỜNG ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ GOUT CỦA THUỐC 19 1.3.1 Tiêu chuẩn chất lượng viên nang chứa dược liệu 19 1.3.2 Các mơ hình phương pháp nghiên cứu thực nghiệm thường sử dụng nghiên cứu tác dụng hạ acid uric thuốc 23 1.3.3 Các mơ hình phương pháp nghiên cứu thực nghiệm thường sử dụng nghiên cứu tác dụng chống viêm thuốc điều trị gout 29 Chƣơng ỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT VIỆU NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.2 Động vật thí nghiệm 34 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 34 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 35 2.1.5 Nội dung nghiên cứu 36 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Phương pháp xây dựng số tiêu chuẩn cho chế phẩm NC39 2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng điều trị gout thực nghiệm chế phẩm NC 40 2.2.3 Phương pháp đánh giá độc tính tiền lâm sàng chế phẩm NC 46 2.3 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 49 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG CƠ BẢN CHO CHẾ PHẨM 50 3.1.1 Lựa chọn tiêu chí đánh giá chế phẩm viên nang NC 50 3.1.2 Thử nghiệm khả thi thẩm định phương pháp kiểm nghiệm 50 3.1.3 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm NC đề xuất tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm NC 64 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ GOUT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CHẾ PHẨM NC 65 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng hạ acid uric chế phẩm NC mơ hình gây tăng AU máu cấp kalioxonat 65 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng chống viêm cấp chế phẩm NC 67 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NC 70 3.3.1 Độc tính cấp 70 3.3.2 Độc tính bán trường diễn 71 Chƣơng ÀN LUẬN 80 4.1 Về xây dựng số tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm NC 80 4.1.1 Bàn luận ngưỡng giới hạn tiêu kiểm nghiệm 80 4.1.2 Bàn luận phương pháp thử tiêu định tính, định lượng 81  Về xây dựng thẩm định phƣơng pháp 82 4.2 Về tác dụng điều trị gout thực nghiệm chế phẩm NC 83 4.2.1 Về tác dụng hạ acid uric máu thực nghiệm chế phẩm NC 83 4.2.2 Về tác dụng chống viêm cấp chế phẩm NC thực nghiệm 85 4.3 Về độc tính chế phẩm NC thực nghiệm 88 KẾT LUẬN 92 KẾT LUẬN VÀ Ề XUẤT 94 TÀI LIỆU TH M KHẢO 95 Bảng 11.1 Kết xác định tổng vi khuẩn hiếu khí xxiii Bảng 11.2 Kết xác định tổng nấm xxiii Bảng 11.3 Kết xác định tổng vi khuẩn Vi khuẩn gram âm dung nạp mật xxiii Hình 11.1 Hình ảnh sau cấy mẫu lên mơi trƣờng VRA xxiv Hình 11.2 Hình ảnh sau cấy mẫu lên mơi trƣờng thạch MacConkey xxv Hình 11 Hình ảnh sau cấy mẫu lên môi trường thạch muối manitol xxv Hình 11.4 Hình ảnh sau cấy mẫu lên môi trường thạch XLD xxvi PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT : Alanine aminotransferase AOAC : ssociation of Official nalytical Chemists (Hiệp hội nhà hoá phân tích thống) : ssociation of South East sian Nations (Hiệp hội Quốc gia ông Nam Á) ASEAN ATB : Astilbin AU CFU CMC-Na D VN DL/kg ED50 : Acid uric : ơn vị hình thành khuẩn lạc : Natri carboxymethyl cellulose : Dƣợc điển Việt Nam : Dƣợc liệu/kg : Mức liều đạt 50% đáp ứng EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid FDA : Food and Drug dministration (Cơ quan quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GLUT9 : Glucose transporter (kênh vận chuyển glucose 9) HGPRT : Hypoxanthin guanin phosphoribosyl transferase HL : Hồi lƣu HPLC : High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HPTLC : High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) HSV-1 : Herpes simplex virus type (virus herpes đơn dạng loại 1) IC50 KLTB : Nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzym KO mARN OAT : Kali oxonate : Messenger ribonucleic acid (acid ribonucleic thông tin) : Organic anion transporter (kênh vận chuyển anion hữu cơ) OAT1 : Organic anion transporter (kênh vận chuyển anion hữu 1) PEG : Polyethylen glycol PEG 400 PRPP : Polyethylen glycol 400 : Phosphoribosyl pyrophosphat PRPP RSV SA : phosphoribosyl pyrophosphate : Respiratory syncytial virus (virus hô hấp hợp bào) :Siêu âm TP TPBVSK TPCN URAT1 :Thực phẩm :Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ :Thực phẩm chức : Urate transporter (kênh vận chuyển urat VSV XO YHCT : Vi sinh vật : Xanthin oxidase : Y học cổ truyền : Khối lƣợng trung bình DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh llopurinol Febuxostat 10 Bảng 1.2 Tổng hợp tiêu giới hạn kim loại nặng, ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm chức 21 Bảng 1.3 Bảng quy định độ đồng khối lƣợng cho chế phẩm viên nang 21 Bảng 2.1 Thang điểm đánh giá mức độ viêm dựa theo triệu chứng 46 Bảng 3.1 Ký hiệu vị trí mẫu mỏng hệ chạy HPTLC 51 Bảng 3.2 Kết Rf Hy thiêm chế phẩm nghiên cứu 53 Bảng 3.3 Kết Rf astilbin chế phẩm 53 Bảng 3.4 Kết khảo sát hàm lƣợng AST với phƣơng pháp chiết khác 55 Bảng 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết 55 Bảng 3.6 Kết khảo sát số lần chiết 56 Bảng 3.7 Chƣơng trình gradient chạy sắc ký 59 Bảng 3.8 Kết độ phù hợp hệ thống 59 Bảng 3.9 Kết đƣờng chuẩn 61 Bảng 3.10 Kết độ lặp lại phƣơng pháp 62 Bảng 3.11 Kết độ ATB 63 Bảng 3.12 Hàm lƣợng ATB chế phẩm nghiên cứu 63 Bảng 3.13: Tổng hợp kết kiểm nghiệm 64 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng chế phẩm NC đến nồng độ acid uric huyết tỷ lệ giảm acid uric huyết so với lô chứng bệnh 65 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng chế phẩm NC lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột nhắt trắng thực nghiệm 67 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng chế phẩm NC lên mức độ phù chân chuột theo thời gian mơ hình gây viêm cấp 68 Bảng 3.17 Tác dụng chống viêm chế phẩm NC mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối natri urat 70 Bảng 3.18 Kết thí nghiệm cho thử nghiệm độc tính cấp mẫu thử NC 71 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng chế phẩm NC liều 1980 mg/kg dùng liên tục 28 ngày đến số huyết học chuột cống trắng 73 Bảng 3.20 Ảnh hƣởng chế phẩm NC lên thông số sinh hóa chuột 74 Bảng 3.21 Ảnh hƣởng chế phẩm NC dùng liên tục 28 ngày đến khối lƣợng quan chuột cống trắng 75 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng chế phẩm NC dùng liều lặp lại 28 ngày đến mô bệnh học gan chuột 77 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng chế phẩm NC dùng liều lặp lại 28 ngày đến mô bệnh học thận chuột 78 Khơng có Samonella 1g mẫu Chứng dƣơng Hình 11.4 Hình ảnh sau cấy mẫu lên môi trƣờng thạch XLD - Kết quả: Âm tính - Kết luận: Mẫu khơng chứa VK Salmonella Nhƣ vậy, mẫu thử NC đạt tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí; Tổng nấm men, nấm mốc; VK Gram âm dung nạp mật; vi khuẩn E coli; vi khuẩn S Aureus, Salmonella, PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ MẤT KHỐI LƢỢNG DO LÀM KHÔ Tiến hành xác định mẫu thử NC thời điểm giờ, giờ, cho thấy khối lƣợng mẫu sau sấy không đổi thời điểm Cơng thức tính kết quả: X%= u cầu: Khơng q 5% Kết đƣợc trình bày bảng m cân(g) m chén(g) m sau(g) 1,0001g 37,2389 38,1977 X% 4,21% Kết luận ạt PHỤ LỤC 13 KẾT QUẢ THỬ Ộ ỒNG ỀU KHỐI LƢỢNG MẪU NC Số TT viên thử 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Trung bình Khối lƣợng viên nang (mg) 0,6104 0,6016 0,5956 0,6126 0,6249 0,6305 0,6104 0,6042 0,5938 0,6057 0,6070 0,6096 0,6000 0,6278 0,6182 0,6171 0,6086 0,6024 0.5961 0,6058 Khối lƣợng vỏ nang (mg) 0,1000 0,0953 0,0918 0,0967 0,0959 0,0973 0,0982 0,0950 0,0987 0,0955 0,0939 0,0961 0,0979 0,0959 0,0953 0,0971 0,0948 0,0970 0,0968 0,0993 Khối lƣợng bột (mg) 0,5104 0,5063 0,5038 0,5159 0,5290 0,5332 0,5122 0,5092 0,4951 0,5102 0,5131 0,5135 0,5021 0,5319 0,5229 0,5200 0,5138 0,5054 0,4993 0,5065 0,5127 % chênh lệch so với KLTB -0,45 -1,25 -1,74 0,62 3,18 4,00 -0,10 -0,68 -3,43 -0,49 0,08 0,16 -2,07 3,74 1,99 1,42 0,21 -1,42 -2,61 -1,21 PHỤ LỤC 14 KẾT QUẢ THỬ Ộ RÃ : Số TT viên thử Thời gian rã (phút) 10 phút 10 phút 15 giây 12 phút 12 phút 15 giây 11 phút 10 phút PHỤ LỤC 15 CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CHẾ PHẨM NC Mô tả: Chế phẩm NC cao khơ đóng viên nang, có bột đồng nhất, màu xám đậm đến đen Định tính Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao A Tetrahydropalmatine Bản mỏng: Silicagel GF254 Dung môi khai triển: Toluen-Aceton-Ethanol-Amoniac (9:9:1,4:0,6) Dung dịch thử: Cân khối lƣợng bột viên bột cao dƣợc liệu khoảng 0,5g, thêm khoảng 10 ml ethanol - nƣớc (1:1), siêu âm 45 phút Lọc thu lấy dịch chấm sắc ki Dung dịch chuẩn: H a tan THP ethanol - nƣớc (1:1) để thu đƣợc dung dịch có nồng độ 130 µg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng dung dịch thử dung dịch chuẩn Triển khai sắc kí đến dung mơi đƣợc 9cm, lấy mỏng sấy khô Phát vết: ể khơ mỏng ngồi khơng khí 30 phút Soi đèn tử ngoại bƣớc sóng 255 nm 366 nm Trên sắc kí đồ dung dịch thử phải có vết tƣơng ứng giá trị R f dung dịch chuẩn B Vitexin Bản mỏng: Silicagel GF254 Dung môi khai triển: Ethyl Acetat – Acid Fomic – Acid Acetic băng – Nước (100:11:11:35) Dung dịch thử: Cân khối lƣợng bột viên bột cao dƣợc liệu khoảng 0,5g, them thêm khoảng 10 ml ethanol - nƣớc (1:1), siêu âm 10 phút Lọc thu lấy dịch chấm sắc kí Dung dịch chuẩn: H a tan VTX ethanol - nƣớc (1:1) để thu đƣợc dung dịch có nồng độ 100 µg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng dung dịch thử dung dịch chuẩn Triển khai sắc kí đến dung mơi đƣợc 9cm, lấy mỏng sấy khô Phát vết: ể khơ mỏng ngồi khơng khí 30 phút Soi đèn tử ngoại bƣớc sóng 254 nm 366 nm Hiện màu dung dịch 2-aminoethyl diphenyl borat % methanol Trên sắc kí đồ dung dịch thử phải có vết tƣơng ứng giá trị Rf với dung dịch chuẩn Mất khối lƣợng làm khô Không 5,0% Dùng 0, 100 g chế phẩm, sấy 105oC đến khối lƣợng không đổi (Phụ lục 9.6) Giới hạn kim loại nặng (phụ lục 9.4.11) Không ppm Định lƣợng Phƣơng pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) A Tetrahydropalmatin Pha động: Dung dịch đệm pH 4,5 – cetonitril (78:22) Lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,45 pm, lắc siêu âm Dung dịch đệm pH 4,5: Hỗn hợp gồm dung dịch kali dihydrophosphat 0,05 M-triethylamin (1000: 2), điều chỉnh pH acid phosphoric (TT) Dung dịch chuẩn: H a tan L-tetrahydropalmatin chuẩn pha động để thu đƣợc dung dịch có nồng độ xác khoảng 0,65 mg/ml Dung dịch thử: Cân xác lƣợng mẫu khoảng 0,05g cho vào bình nón 100ml, thêm xác 5,0 ml hỗn hợp CN-H2O tỉ lệ 1:1, chiết siêu âm 10 phút Lọc qua màng lọc 0,22µm Pha lỗng lần hỗn hợp CN-H2O tỉ lệ 1:1, thu đƣợc dịch chạy sắc kí Điều kiện sắc ký: Cột kích thƣớc (25 cm X mm) đƣợc nhồi pha tĩnh C18 (5 pm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bƣớc sóng 283 nm Tốc độ d ng: 1,5 ml/min Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu Dựa vào diện tích pic thu đƣợc sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lƣợng C21H25NO4 L-tetrahydropalmatin chuẩn, tính hàm lƣợng Ltetrahydropalmatin (C21H25NO4) chế phẩm Chế phẩm phải chứa 1,0% L-tetrahydropalmatin (C21H25NO4) B Vitexin Pha động: Dung dịch acid phosphoric 0,1% pH 2,6 – cetonitril (87,5: 12,5) Lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,45 pm, lắc siêu âm Dung dịch chuẩn: H a tan Vitexin chuẩn Ethanol 50% để thu đƣợc dung dịch có nồng độ xác khoảng 0,1 mg/ml Dung dịch thử: Cân xác lƣợng chế phẩm tƣơng ứng với khoảng 0,500 g chế phẩm cho vào bình nón Thêm 10 ml hỗn hợp dung môi nƣớc ethanol (4:6), chiết siêu âm 10 phút Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc chuyển vào vial qua màng lọc cellulose 0,22 µm iều kiện sắc ký: Cột kích thƣớc (25 cm X mm) đƣợc nhồi pha tĩnh C18 (5 pm) Detector quang phổ tử ngoại đặt bƣớc sóng 342 nm Tốc độ d ng: 1,3 ml/min Thể tích tiêm: 15 µl Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu Dựa vào diện tích pic thu đƣợc sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lƣợng C21H20O10 Vitexin chuẩn, tính hàm lƣợng Vitexin (C21H20O10) chế phẩm Chế phẩm phải chứa 80 µg/g Vitexin (C21H20O10) Giới hạn nhiễm khuẩn (phụ lục 13.6) Tổng VSV hiếu khí ≤ 103 Tổng nấm ≤ 102 Khơng có E coli; S aureus VK Gram âm dung nạp mật < 10 CFU/g Bảo quản ể nơi khơ thống mát tránh ánh sáng PHỤ LỤC 15: ÀI ÁO KHO HỌC Determination of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra using high-performance liquid chromatography Tran Nguyen Ha1, Hoang Thi Thuy Linh1, Vu Ngan Binh1, Nguyen Thi Thanh Nhai2, Phi Van Toan3, Pham Thi Thanh Ha11 Hanoi University of Pharmacy, Hanoi, Vietnam Hai Duong Central College of Pharmacy, Hai Dương, ietnam Hanoi University of Science and Technology, Hanoi, Vietnam (Received: 03/05/2021; Accepted: 07/06/2021) Abstract Smilax glabra rhizoma has been used in traditional medicine remedies for the treatment of joint pain and inflammation, and recently, has been presented in dietary supplements for supporting arthritis and gout treatment In the 5th Vietnamese Pharmacopoeia, astilbin was chosen as a chemical marker for the quality control of Smilax glabra as herbal medicine A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the qualitative and quantitative determination of of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra Ultrasonic extraction with methanol 60% was used for astilbin extraction from herbal products HPLC analysis was performed with a C18 column and a mobile phase consisting of methanol and water in gradient mode, with UV detection at 291 nm The method was validated according to AOAC International’s requirements with high specificity and precision Keywords: Astilbin, Smilax glabra, dietary supplement, high performance liquid chromatography, HPLC INTRODUCTION Smilax glabra rhizoma (Smilax glabra Roxb.) is a plant that grows wildly in the mountainous areas in Vietnam For a long time, in Chinese and Vietnam Traditional Medicines, Smilax glabra rhizoma has been used in many remedies to treat diseases of tendons, parasitic worms, ulcer, detoxification, anti-inflammatory, treatment of leptospirosis, dermatitis, syphilis, brucellosis, acute bacterial dysentery [ i ] Modern medicine also shows that Smilax glabra rhizoma’s root contains astilbin (AST), which plays an important role in reducing uric acid in the blood by inhibiting the activity of the enzyme xanthine oxidase and increasing the expression of metabolites uric acid secretion [2], and also has the effect of reducing the inflammatory response through inhibition of inflammatory mediators [3] In addition to the fact that Smilax glabra rhizoma presents in pharmaceuticals, it also presents in dietary supplements which are widely used without a doctor's prescription Therefore, quantifying AST in dietary supplements to control product quality becomes necessary In Vietnam, there are some studies about chemical components [ ii-iii], biological activity [ii-iii] qualitative and quantitative methods of Smilax glabra rhizoma [iii] In Vietnamese Pharmacopoeia V, AST has been selected as a marker in both qualitative and quantitative criteria for Smilax glabra rhizoma as a medicinal herb [Error! Bookmark not defined.] There are some publications of quantitative methods of AST in Smilax glabra rhizoma, which utilized high-performance liquid chromatography (HPLC) [ iv , Error! Bookmark not defined.] However, there has not been any method to determine AST in supplement products from Smilax glabra rhizoma Therefore, this study aims to develop a quantitative method to determine astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma by HPLC MATERIALS AND METHODS 2.1 Materials AST standard was purchased from Biopurify Phytochemicals (China) (98%, Lot.No PRF9022741); Smilax glabra rhizoma standard material was obtained from National Institute Corresponding author: Tel 0904882288 Email: thanhha.pham@gmail.com of Drug Quality Control (Vietnam) (SKS: CV 0116035.01); samples of dietary supplements (code from T1 to T5) which are preparations in the form of hard capsules containing dried medicinal herbs including Nanocare, Khuong Thao Dan, Goutcare, Vien gout Tam Binh, Vuong Thao Kien Cot Among those samples, the T1 sample was used as the matrix sample to develop the quantitative method 2.2 Equipment and chemicals An Agilent 1200 series Gradient HPLC with diode-array detection (DAD), Agilent Chemstation software (Agilent, Us) was used for the separation, qualitative and quantitative determination of AST Methanol (MeOH) of HPLC grade and other chemicals at analytical grade were obtained form Merck, Germany 2.3 Methods Method development: We conducted the extraction solvent selection, and other extraction parameters Based on some references, we optimized liquid chromatography conditions such as components of mobile phases, and gradient program Method validation: We validated the method according to the guideline of AOAC International Appendix K [ v ] with some criteria of selectivity, system suitability, calibration curve, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy, and precision To test the applicability of the method, we have quantified AST in several commercially available dietary supplements with Smilax glabra rhizoma as one of the main ingredients RESULTS AND DISCUSSION 3.1 Develop the quantitative method of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma 3.1.1 Investigation of chromatographic conditions We investigated the chromatographic conditions for quantifying AST in Smilax glabra rhizoma referring to Vietnamese Pharmacopoeia V, the conditions were as follow: C18 column (250 × 4.6 mm i.d.; particle size μm), detection wavelength of 291 nm, a flow rate of mL/min, injection volume of 20 μL, a mobile phase of methanol (MeOH) - 1% acetic acid in water (39 : 61, v/v) The results showed that the AST peak could not be separated from the product matrix We, then, investigated two other mobile phase systems: a) MeOH - 0.1% H3PO4 in water; b) MeOH - H2O with different ratios Consequently, the mobile phase of MeOH - H2O (38 : 62, v/v) gave the best separation of AST peak, and easily implement in the experiment However, the other compounds in the matrix had a relatively strong interaction with the column so the total analysis time last relatively long Based on the retention time of interferences in the matrix, to quickly remove them, the gradient program of MeOH - H2O was as follows: - 23 (38 : 62, v/v); 23.1 - 32 (85 : 15, v/v); 32.1 - 37 (38 : 62, v/v) 3.1.2 Investigate extraction method of astilbin in dietary supplement containing Smilax glabra rhizome T1 sample was firstly extracted follow the method in the Vietnamese Pharmacopoeia V An amount of sample equivalent to 0.8 g Smilax glabra rhizome was weighed, then it was conducted reflux extraction in 100 mL of 60% MeOH However, the extraction of astilbin in dietary supplements is considered easier compare to the extraction from Smilax glabra rhizome herbal Thus, T1 sample was extracted in 60% MeOH with the support of ultrasonic for ten minutes (AST is soluble in this solvent) The amount of AST in the T1 sample extracted by two methods was reported in Figure 0,040 1,60 1,40 Amount (%w/w) Amount (%w/w) 0,030 0,025 0,020 1,421 0,034 0,035 0,019 0,015 1,20 1,00 0,80 0,60 0,010 0,40 0,005 0,20 0,000 T1-HL1 T1-SA 1,091 0,00 0,391 0,262 VKN-HL VKN-SA TT-HL TT-SA Figure Amount % of astilbin in T1 sample, Smilax glabra rhizoma standard material (VKN), and commercial product (TT) extracted by reflux extraction (HL) and ultrasonic (SA) For the same sample extracted with two methods, the amount of AST extracted by SA tended to be higher than that of HL method The research of Qing-Feng Zhang’s group (2013) showed that astilbin can be decomposed by temperature from 45°C; at the temperature of 55°C, t1/2 was about 2.5 hours [vi] Our research group verified this result by an experiment After 30 minutes of heating the AST standard solution to 50°C, the concentration reduced significantly In the HL extraction method, the temperature of methanol was about 70°C Thus, the reason for the low efficiency of HL extraction was thermal decomposition Therefore, the SA extraction method was selected to extract AST from dietary supplements Our research group also compared the HL extraction method according to the Vietnamese Pharmacopoeia V and SA extraction method for raw material of Smilax glabra rhizoma The samples were Smilax glabra rhizoma standard material (VKN sample) obtained from the National Institute of Drug Quality Control (Vietnam) and the commercial one (TT sample) The results (Figure 1) showed that the amount of AST in samples extracted by the SA method was higher than that of the HL method 3.1.3 Investigate extraction time T1 sample was extracted by the SA method with different ultrasonic times in 5, 10, 20, 30 minutes, then analyzed by HPLC-DAD The result of ultrasonic for ten minutes increase 7.1% compared to ultrasonic for five minutes After ultrasonic 20 minutes, the amount of AST barely increased or increased insignificantly compared with the result of ultrasonic ten minutes Ultrasonic 30 minutes showed a tendency to decrease AST Although there was no heating process, after 20 minutes of ultrasonic, the temperature of the extraction solution started to increase, and after 30 minutes of ultrasonic, the temperature of the solution was greater than 50°C Thus the amount of AST decreased when increasing the ultrasonic time by thermal decomposition In conclusion, to save time and avoid decomposition of AST, the extraction time with ultrasonic was ten minutes 3.1.4 Investigate number of extractions Sample T1 was extracted three times, the solvent volumes were mL, mL, and mL, respectively, and each time was extracted by ultrasonic for ten minutes with 60% MeOH The result of HPLC-DAD analysis showed that after the first extraction, most of AST was extracted, and the amount was 0.0296% (w/w) Extraction solutions of the second and the third time did not show any signal of AST in the chromatogram Therefore, extraction one time with ten minutes of ultrasonic was the most suitable Finally, the extraction method was as follows: weighing an amount of sample equivalent to 50 mg Smilax glabra rhizoma, extracting the sample with mL of 60%MeOH for ten minutes, centrifuging the solution, filtering the solution through a 0.45 μm membrane, injecting 20 μl of the extraction solution into HPLC-DAD system 3.2 Method validation 3.2.1 Specificity Simultaneous analysis of four samples including blank, standard, test sample, and standard addition test sample (spiked sample) obtained the results shown in Figure In the chromatogram of standard solution, ST’s peak appeared at 19.9 (Figure 2b), and it did not show in Figure 2a (balnk sample) In the chromatograms of test sample (Figure 2c) and spiked sample (Figure 2d), there was a peak appeared at the same retention time ( t R) of AST The corresponding AST peak in the sample and the spiked sample was performed overlaid with the standard AST peak, giving a spectral superposition factor > 0.99 The purity of the AST peaks in the sample and spiked sample also reached > 0.999 Thus the method has specificity for AST Figure Chromatogram of blank (a), standard solution (b), test sample (c), and standard addition sample (d) 3.2.2 Systematic suitability Analysis of six replication of 10 ppm AST standard solution were recorded the retention time and peak area The results showed that the relative standard deviation (RSD) of the retention time is 0.7% (< 2%), of the peak area is 1.8% (< 2%) These figures meet the requirements of AOAC 2013 3.2.3 Calibration curve A series of AST standard solutions with actual concentrations of 1.077 ppm, 2.152 ppm, 5.380 ppm, 10.76 ppm; 16.14 ppm, and 21.52 ppm were prepared, then analyzed with the selected conditions The regression equation (y = 30.513x - 30.663) showed a good correlation between the peak area and the corresponding analyte concentration with the correlation coefficient r = 0.997, which meets the requirements of AOAC 2013 3.2.3 Repeatability T1 sample was weighed six times with a mass of about 0.125 g These samples were extracted ten minutes with 60% MeOH, then analyzed We conducted this experiment twice with different analysts on different days to calculate the average On the first day, the average amount of AST was 0.0353% w/w, RSD 1.50% On the second day, the average amount of AST was 0.0361% w/w, RSD 1.37% The repeatability was acceptable with RSD for the amount of AST was 1.83%, the average amount of AST was 0.0357% w/w 3.2.4 Accuracy The accuracy of the method was determined by the following experiment: Adding an amount of AST standard to T1 sample such that the amount of AST in the extraction solution has a concentration range of to 20 ppm; at each concentration, performing three replications The concentration of AST in the samples was determined from the calibration curve The results were presented in Table The recovery was from 103.01% - 106.45%; RSD < 8% meets AOAC 2013 regulations with a content of 0.01% (RSD < 6% at 0.1%, w/w) Table Result of recovery experiments Addition Recovery concentration Recovery Average Sample RSD (%) concentration (ppm) (ppm) (%) (%) 103.01 1.35 2.152 2.229 103.61 2.152 2.327 108.12 2.152 2.094 97.29 106.45 1.67 7.532 7.738 102.73 7.532 8.075 107.21 7.532 8.241 109.41 105.80 2.10 12.91 13.31 103.04 12.91 13.73 106.33 12.91 13.95 108.04 3.2.5 Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) AST standard solution was prepared at a concentration of 0.083 ppm The ratio of ST’s signal S and noise N (S/N) was 3.5 Thus, 0.83 ppm can be accepted as the LOD, and 0.25 ppm can be the LOQ So far, the developed method was validated fully according to AOAC 2013, and suitable to quantitatively determine AST in Smilax glabra rhizoma dietary supplements 3.3 Feasibility of the method To test the feasibility of the developed method, the above procedure was applied for the quantification of AST in several dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma on the market The results were presented in Table The results showed that the AST content has been determined in samples of the Smilax glabra rhizoma dietary supplements In the remaining four samples, there was no peak corresponding to the retention time of AST It means that other ingredients in the products not have peaks that affect the quantification of AST This proves the feasibility of the method when applied to real samples Some products containing Smilax glabra rhizoma did not show the peak of AST, although these products were assumed to have a high content in tablets Due to the limited number of samples applied, it is not possible to comment on product quality, but this can be a suggestion to cooperate with manufacturers in testing input materials for production according to Vietnamese Pharmacopoeia V, and controlling the production process to avoid decomposition of active ingredients Table Amount of AST in some Smilax glabra rhizoma dietary supplements Mass of a Concentration of AST in Amount of AST in a tablet Sample tablet (mg) extraction solution (μg/mL) (mg/tablet) T1 100 4,639 0.1819 T2 100 4,212 0.1630 T3 330 ND (*) ND (*) (*) T4 650 ND ND (*) (*) T5 100 ND ND (*) T6 100 ND (*) ND (*) ND - Not detected (< LOD 0.08 μg/mL in extraction solution) CONCLUSION The study has developed a method for the quantification of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma by high-performance liquid chromatography with a UV detector at (*) 291 nm and simple mobile phases The method of sample treatment by ultrasonic extraction with 60% methanol gives a high recovery, acceptable separation in the moderate analysis time, high sensitivity, repeatability, and accuracy meeting the AOAC guidelines [9] The method has proven feasibility in determining AST content in commercial dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma REFERENCES [1] D H Bich, D Q Chung, B X Cƣơng, N Thuong Dong, D T Dam, P V Hien, V N Lo, P D Mai, P K Man, D T Nhu, N Tap, and T Toan, “Medicinal plants and animals in Vietnam,” Hanoi: Science and Technology Publisher, vol.2, pp 883-886, 2003 [2] L Huang, J Deng, G Chen, M Zhou, J Liang, B Yan, J Shu, Y Liang, and H Huang, “The antihyperuricemic effect of four astilbin stereoisomers in Smilax glabra on hyperuricemic mice,” Journal of Ethnopharmacology, vol 238: 111777, 2019 [3] C-L Lu, Y-F Zhu, M-M Hu, D-M Wang, X-J Xu, C-J Lu, and W Zhu, "Optimization of astilbin extraction from the rhizome of Smilax glabra, and evaluation of its anti-inflammatory effect and probable underlying mechanism in lipi-polysaccharide-induced RAW264.7 macrophages", Molecules, vol 20, no 1, pp 625-644, 2015 [4] M Huong, “Research on biological activities and chemical compositions in the roots of Smilax glabra rhizoma (SMILAX GLABRA ROXB.) in Vietnam,” Master's Thesis in Experimental Biology, Institute of Ecology and Biological Resources, 2013 [5] P T H Minh, N Q Tien, T T T Hang, and P H Dien, “Research on the chemical composition of the Smilax glabra Roxb grown in Thai Nguyen,” Journal of Science, Hanoi National University of Education, vol 55, no 6, pp 62-70, 2010 [6] T T T Van, V V Chien, P T Hang, P V Cuong, N Q Vuong, Antioxidant activity of extracts and astilbin from the root of Smilax glabra of Vietnam, Malaysian Journal of Chemistry, 17, 12-19, 2015 [7] Pharmacopoeia Council - Ministry of Health, Vietnam Pharmacopoeia V, Medicine Publisher, vol II, pp 1344-1345, 2017 [8] L V Duc, V B Duong, T N Trung, and P T T Huong, “Quantitative study for determination of astilbin in Smilax glabra by high performance liquid chromatography,” Journal of Military Pharmaco-Medicine, vol 7, pp 8-12, 2015 [9] O C International, “ ppendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals”, AOAC Official Methods of Analysis, pp 3-32, 2013 [10] Qing-Feng Zhang, Ying-Juan Fu, Zhan-Wang Huang, Xin-Cheng Shangguang, Yu-Xian Guo, "Aqueous Stability of Astilbin: Effects of pH, Temperature, and Solvent", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61 (49), 12085-12091, 2013 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Astilbin thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa thổ phục linh sắc ký lỏng hiệu cao Trần Nguyên Hà1, Hồng Thị Thuỳ Linh1, Vũ Ngân ình1, Nguyễn Thị Thanh Nhài2, Phí Văn Tồn3, Phạm Thị Thanh Hà1, Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, Hải Dương, iệt Nam Trường Đại học Bách hoa Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) dƣợc liệu đƣợc sử dụng nhiều thuốc cổ truyền gân cốt, chống viêm, gần đƣợc sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khoẻ hỗ trợ điều trị viêm khớp điều trị gout ể kiểm soát chất lƣợng dƣợc liệu Thổ phục linh, astilbin hoạt chất đƣợc lựa chọn làm chất đánh dấu Dƣợc điển Việt Nam V Phƣơng pháp định tính định lƣợng astilibin sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa Thổ phục linh sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đƣợc xây dựng nghiên cứu stilbin chế phẩm đƣợc chiết siêu âm methanol 60%, phƣơng pháp định lƣợng HPLC sử dụng cột C18, pha động gồm methanol nƣớc theo chế độ gradient, phát với UV bƣớc sóng 291 nm Các tiêu chí thẩm định phƣơng pháp đƣợc thực đầy đủ theo hƣớng dẫn AOAC 2013 cho kết tin cậy Từ khóa: Astilbin, Smilax glabra, Thổ phục linh, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, sắc ký lỏng hiệu cao, HPLC ... định có chứng tác dụng nhằm ứng dụng điều trị, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu tác dụng điều trị bệnh gout thực nghiệm chế phẩm viên nang chứa thổ phục linh, hy thiêm số dƣợc liệu khác? ?? với mục... ? ?Nghiên cứu tác dụng điều trị gout thực nghiệm chế phẩm viên nang chứa Thổ phục Linh, Hy thiêm số vị dược liệu khác? ?? thực thử tác dụng chống viêm cấp chế phẩm, đó, chúng tơi tập trung vào tìm... dựng số tiêu chuẩn chế phẩm viên nang chứa thổ phục Linh, hy thiêm số vị dƣợc liệu khác ánh giá tác dụng điều trị gout (tác dụng hạ acid uric, chống viêm cấp) thực nghiệm chế phẩm nghiên cứu Xác

Ngày đăng: 14/08/2022, 13:19

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN