Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase và an pha glucosidase của quả mướp đắng bằng mô phỏng tương tác kết hợp thực nghiệm in vitro

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ TRẦN PHƯƠNG UYÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA QUẢ MƯỚP ĐẮNG BẰNG MÔ PHỎNG TƯƠNG TÁC KẾT HỢP THỰC NGHIỆM IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ TRẦN PHƯƠNG UYÊN MÃ SINH VIÊN: 1501536 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA QUẢ MƯỚP ĐẮNG BẰNG MÔ PHỎNG TƯƠNG TÁC KẾT HỢP THỰC NGHIỆM IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thu Hằng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thu Hằng (Trưởng môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội), người cô giành thời gian, tâm huyết để tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn, động viên khích lệ tơi suốt khoảng thời gian thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nghiêm Đức Trọng - Bộ môn Thực vật Trường Đại Học Dược Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị công tác môn Dược Liệu bạn, em sinh viên nghiên cứu khoa học môn tạo điều kiện giúp tơi q trình làm khóa luận Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Văn Phương, người đồng hành, đóng góp ý kiến giúp đỡ suốt quãng thời gian học tập nghiên cứu khoa học Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, phòng ban, tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới người thân u gia đình ln ủng hộ, cổ vũ, khích lệ nguồn động lực lớn lao cho tơi suốt q trình học tập trường thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Lê Trần Phương Uyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan mướp đắng 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố mướp đắng 1.1.2 Thành phần hóa học mướp đắng 1.1.3 Tác dụng sinh học mướp đắng 1.1.4 Công dụng mướp đắng 10 1.2 Tổng quan mô tương tác 11 1.2.1 Khái niệm 11 1.2.2 Nguyên tắc 11 1.2.3 Quá trình mơ tương tác 12 1.2.4 Ứng dụng 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Đối tượng, nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, phần mềm 15 2.1.3 Hóa chất, dung mơi 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Chiết xuất 16 2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng 16 2.3.3 Đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng 17 2.3.4 Sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng mơ tương tác 18 2.3.5 Dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Kết nghiên cứu 20 3.1.1 Chiết xuất 20 3.1.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng 21 3.1.3 Kết sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng mô tương tác 22 3.1.4 Kết dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng 33 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Về kết nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng 35 3.2.2 Về kết nghiên cứu tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng 36 3.2.3 Về ý nghĩa kết nghiên cứu 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADME Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ AGlc Acid glucuronic All Allose ALT Alanin transaminase Arg Arginin Asp Acid aspartic DMSO Dimethyl sufoxid Fuc Fucose Gal Galactose Glc Glucose Gly Glycin His Histidin IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym PĐ Phân đoạn Phe Phenylalanin Rha Rhamnose RMSD Độ lệch trung bình vị trí ngun tử TB Trung bình Thr Threonin TLTK Tài liệu tham khảo Trp Tryptophan Tyr Tyrosin XO Xanthin oxidase Xyl Xylose DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Các hợp chất saponin có mướp đắng STT Ký hiệu 1.1 1.2 1.3 1.4 3.1 3.2 3.3 3.4 Các thông số phức hợp enzym - phối tử lựa chọn 23 3.5 Kết mô tương tác 49 hợp chất mướp đắng với xanthin oxidase 26 10 3.6 Kết mô tương tác 49 hợp chất mướp đắng với α-glucosidase 30 3.7 Kết dự đốn số thơng số dược động học 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng 34 11 Các hợp chất flavonoid có mướp đắng Các acid phenolic dẫn xuất acid benzoic có mướp đắng Các acid phenolic dẫn xuất acid cinnamic có mướp đắng Khối lượng cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng Kết đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng Trang 8 21 21 22 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ STT Ký hiệu Tên hình 1.1 1.2 Sơ đồ tóm tắt q trình mơ tương tác 12 2.1 Ảnh chụp mướp đắng thực địa 14 2.2 Ảnh chụp mướp đắng 14 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất mướp đắng 20 3.2 3.3 3.4 3.5 10 3.6 Khung cấu trúc acid phenolic có mướp đắng Cấu trúc 3D phức hợp enzym - phối tử lựa chọn Biểu đồ Ramachandran cấu trúc tinh thể xanthin oxidase α-glucosidase Kết thẩm định phương pháp mô tương tác Các tương tác hợp chất số 31, 34, 49 quercetin với xanthin oxidase Các tương tác hợp chất số 31 acarbose với α-glucosidase Trang 23 24 25 28 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Mướp đắng loại gần gũi với nhân dân ta với nhiều tên gọi khác khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi Ngoài giá trị sử dụng làm thực phẩm, theo kinh nghiệm dân gian, mướp đắng sử dụng để điều trị rôm sảy, trị ho, hạ sốt… [2], [3] Một số nghiên cứu dịch chiết mướp đắng có tác dụng hạ đường huyết theo nhiều chế, có ức chế α-glucosidase [33], [44] Ngồi ra, dịch chiết mướp đắng cịn có tác dụng hạ acid uric thông qua đường ức chế xanthin oxidase [24], [30] Thành phần hóa học mướp đắng gồm có saponin, flavonoid, acid phenolic số hợp chất khác [24] Mặc dù có 50 hợp chất tìm thấy mướp đắng chưa có nghiên cứu sàng lọc để xác định hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase có dược liệu Trong năm gần đây, mô tương tác ứng dụng rộng rãi giới lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc Phương pháp dựa nguyên tắc lượng liên kết phức hợp enzym - chất thấp, tác dụng chất mạnh Từ dự đốn hợp chất có tác dụng dược lý mong muốn mà không cần tiến hành thực nghiệm Trong nghiên cứu dược liệu, sàng lọc phương pháp mô tương tác kết hợp với thực nghiệm in vitro giúp làm giảm đáng kể thời gian, công sức chi phí so với phương pháp sàng lọc truyền thống [12] Từ phân tích trên, đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase α-glucosidase mướp đắng mô tương tác kết hợp thực nghiệm in vitro” thực với ba mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng thực nghiệm in vitro Sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng mô tương tác Dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan mướp đắng Tên khoa học mướp đắng: Momordica charantia f abbreviata (Ser.) W.J.de Wilde & Duyfjes, họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [13] Tên đồng nghĩa: Momordica charantia L [2], [13] Tên Việt Nam: Khổ qua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi [1] Tên tiếng Anh: Bitter gourd, bitter melon [10] 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố mướp đắng 1.1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây dây leo hàng năm, có vị đắng Thân nhánh có lơng, đường kính khoảng 5-10 mm, dây bò dài 5-7 m, thân màu xanh nhạt, có góc cạnh, leo nhờ có nhiều tua dài khoảng 20 cm, có lơng măng bao phủ [1], [8] Lá đơn, nhám, mọc so le, hình trứng, kích thước 4-12 cm × 4-12 cm Cuống nhỏ, dài 4-6 cm, ban đầu có lơng tơ trắng, ánh kim Lá xẻ 5-7 thùy, thùy hình trứng thn, gân hình chân vịt, mép khía tai bèo phân thùy khơng đều, hình chóp nhọn chóp tù [8] Mặt màu xanh nhạt mặt lá, gân rõ mặt [1] Mướp đắng lưỡng tính Hoa mọc đơn độc kẽ lá, hoa đực hoa gốc, có cuống dài [1] Hoa đực có cuống nhỏ, mảnh khảnh, dài 3-7 cm, có lơng bao phủ, với bắc Lá bắc hình trịn hình thận, 5-15 mm, mép nguyên vẹn, hai bề mặt phủ lơng Đài hoa rời, hình trứng mác, 4-6 mm × 2-3 mm, có lơng trắng, chóp nhọn Tràng hoa cánh, màu vàng, rời nhau, hình trứng ngược, kích thước 15-20 mm × 8-12 mm, có lơng, nhị Bao phấn nửa Hoa có cuống nhỏ, dài khoảng 1012 cm, có bắc đế, bầu nhụy hình thoi, nhiều đốm nhỏ, đầu nhụy phồng ra, thùy [8] Quả hình thoi hình trụ, dài 10-20 cm, có nhiều u lồi to nhỏ khơng lên Quả chưa chín có màu xanh xanh vàng nhạt Khi chín, có màu cam, thịt chuyển dần từ màu trắng sang đỏ tươi nứt dần từ đầu, tách làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên Hạt hình thn dẹt, 10-20 mm × 10-15 mm Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ màng hạt gấc [1], [24], [39] 29 Momordicilin -7,5352 2,6753 24 Momordicin -7,3957 2,8148 49 Acid chlorogenic -7,3881 2,8224 36 Naringenin-7-O-glucosid -7,2608 2,9497 12 Kuguacin H -7,2425 2,9680 35 Apigenin-7-O-glucosid -7,2310 2,9795 Kuguacin B -7,0525 3,1580 34 Luteolin-7-O-glucosid -6,9962 3,2143 44 Acid o-coumaric -6,9139 3,2966 17 Kuguacin G -6,8005 3,4100 -6,7007 3,5098 5β, 19-Epoxy-3β, 25dihydroxycucurbita-6,23(E)-dien 16 Kuguacin F -6,5285 3,6820 32 Catechin -6,3086 3,9019 42 Acid protocatechuic -6,0478 4,1627 33 Epicatechin -6,0405 4,1700 14 Kuguacin D -5,9630 4,2475 28 Momordicinin -5,8308 4,3797 46 Acid cinnamic -5,7188 4,4917 43 Acid p-coumaric -5,6860 4,5245 45 Acid sinapinic -5,6596 4,5509 41 Acid gentistic -5,6089 4,6016 37 Acid benzoic -5,5031 4,7074 38 Acid gallic -5,1381 5,0724 47 Acid ferulic -5,0530 5,1575 13 Kuguacin C -5,0501 5,1604 40 Acid vanillic -5,0089 5,2016 39 Acid syringic -4,7262 5,4843 48 Acid caffeic -4,6980 5,5125 Trong đó: Elk: Năng lượng liên kết hợp chất 1- 49 với α-glucosidase EA: Năng lượng liên kết acarbose với α-glucosidase ( EA= -10,2105 kcal/mol) 31 Từ kết bảng 3.6 cho thấy số 49 hợp chất đem sàng lọc (ký hiệu từ đến 49), có hợp chất số 31 có lượng liên kết với α-glucosidase nhỏ so với lượng liên kết acarbose Từ dự đốn hợp chất số 31 có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh chất đối chiếu acarbose Các tương tác hợp chất số 31 acarbose với α-glucosidase trình bày hình 3.6 A Goyasaponin I (31) B Acarbose Hình 3.6 Các tương tác hợp chất số 31 acarbose với α-glucosidase Kết hình 3.6 cho thấy hợp chất số 31 acarbose tương tác với α-glucosidase thông qua liên kết hydro nhóm OH phần đường với amino acid His626, Asp357, Asp568, Arg552 Ngồi ra, hợp chất số 31 cịn tương tác với α-glucosidase thông qua liên kết hydro với amino acid Arg624, Trp565, Gly567, Tyr243, Arg238 32 3.1.4 Kết dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng Để đánh giá tiềm làm thuốc hợp chất sàng lọc mục 3.1.3.4, tiến hành dự đốn độ tan, số thơng số dược động học (khả hấp thu, chuyển hóa qua gan, ảnh hưởng bơm tống thuốc) tính điểm theo quy tắc Lipinski hợp chất chương trình SwissADME Trong đó, quy tắc Lipinski (còn gọi quy tắc năm Pfizer) quy tắc để đánh giá xem hợp chất hóa học với hoạt tính định có hay khơng đặc tính phù hợp để sử dụng làm thuốc theo đường uống Quy tắc Christopher A Lipinski đưa vào năm 1997, dựa quy tắc hầu hết loại thuốc dùng qua đường uống phân tử thân dầu với kích thước vừa nhỏ Quy tắc mô tả thuộc tính quan trọng hợp chất liên quan đến trình dược động học bao gồm khả hấp thu, phân bố, chuyển hóa thải trừ (viết tắt ADME) khơng dự đốn hoạt tính chất Đây quy tắc quan trọng trình nghiên cứu phát triển thuốc để tối ưu hóa cấu trúc chất dẫn đường Theo quy tắc này, thuốc dùng theo đường uống phải thỏa mãn 3/4 tiêu chí sau: - Tổng số liên kết N-H O-H không vượt - Tổng số nguyên tử N O không 10 - Khối lượng phân tử nhỏ 500 dalton - Hệ số phân bố octanol-nước (logP) không vượt Trong đó, tiêu chí vi phạm tính điểm Một hợp chất có số điểm thấp, khả phát triển thành thuốc cao ngược lại 3.1.4.1 Kết dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng Tiến hành dự đốn số thơng số dược động học 28 hợp chất (1, 2, 4, 5, 711, 13, 15-18, 20-31, 34, 49) có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng mục 3.1.3.4 Kết trình bày bảng 3.7 33 Bảng 3.7 Kết dự đốn số thơng số dược động học 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng Ký hiệu 10 11 13 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 34 49 Tên hợp chất Goyaglycosid C Goyaglycosid D 5β, 19-Epoxy-3β, 25dihydroxycucurbita6,23(E)-dien Goyaglycosid A Kuguacin B Goyaglycosid E Goyaglycosid F Goyaglycosid G Goyaglycosid H Kuguacin C Kuguacin E Kuguacin F Kuguacin G Momordicosid L Momordicosid B Momordicosid C Momordicosid D Momordicosid K Momordicin Momordicosid F1 Momordicosid F2 Momordicosid G Momordicinin Momordicilin Momordicosid I Goyasaponin I Luteolin-7-Oglucosid Acid chlorogenic Khả hấp thu Thấp Thấp Ảnh Chuyển hưởng hóa qua bơm gan tống thuốc Khơng Có Khơng Có Độ tan Quy tắc Lipinski Kém Kém 1 Cao Không Không Kém Thấp Cao Thấp Thấp Thấp Thấp Cao Cao Cao Cao Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Cao Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Khơng Khơng Có Khơng Có Có Có Có Khơng Khơng Có Có Có Có Có Có Có Khơng Có Có Có Khơng Khơng Có Có Kém Kém TB Kém Kém TB TB TB TB TB TB TB TB Kém TB Kém Kém Kém Kém Kém Kém Kém Kém 1 3 3 0 3 1 1 1 Thấp Khơng Có Tốt Thấp Khơng Khơng Tốt 34 Từ kết bảng 3.7 cho thấy 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng sàng lọc mục 3.1.3.4 khơng bị chuyển hóa qua gan lần đầu Phần lớn chất có độ tan nước mức - trung bình, trừ hai hợp chất số 34 49 tan tốt nước Bên cạnh đó, có tới 20/28 chất chịu ảnh hưởng bơm tống thuốc P-glycoprotein 11/28 hợp chất vi phạm từ tiêu chí trở lên theo nguyên tắc số Lipinski Như vậy, số 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng có hợp chất (là hợp chất số 4, 7, 13, 15 24) vừa có khả hấp thu tốt, vừa khơng bị chuyển hóa qua gan lần đầu không chịu tác động bơm tống thuốc Các hợp chất đáp ứng tiêu chí để phát triển thành thuốc 3.1.4.2 Kết dự đốn số thơng số dược động học hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng Kết sàng lọc mục 3.1.3.4 cho thấy, số 49 hợp chất từ mướp đắng, có hợp chất số 31 có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh so với acarbose Kết dự đoán số thông số dược động học hợp chất 31 trình bày bảng 3.7 Kết cho thấy hợp chất số 31 khơng bị chuyển hóa qua gan lần đầu Tuy nhiên, hợp chất có độ tan khả hấp thu qua đường uống kém, đồng thời chịu ảnh hưởng bơm tống thuốc P-glycoprotein vi phạm 3/4 tiêu chí quy tắc Lipinski Do vậy, dự đốn có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh so với chất đối chiếu acarbose hợp chất số 31 chưa đáp ứng tiêu chí để phát triển thành thuốc 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về kết nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng Khả ức chế enzyme xanthin oxidase in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng xác định dựa vào giá trị IC50 Kết cho thấy cắn phân đoạn ethyl acetat nước chiết xuất từ mướp đắng thể tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro rõ rệt phân đoạn lại Kết cho phép dự đốn hai phân đoạn ethyl acetat nước chứa nhiều hợp chất có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase Nhiều nghiên cứu enzym xanthin oxidase chứng minh rằng, hoạt động enzym xanthin oxidase nguyên nhân dẫn tới tạo nhiều gốc tự Do vậy, việc bổ sung chất ức chế enzym vừa có tác dụng ức chế tạo thành acid uric ngăn ngừa bệnh gút, vừa có tác dụng ngăn chặn stress oxy hóa nguyên nhân 35 gây tổn thương tế bào mô thể [14], [55] Kết in vitro gợi ý cho việc nghiên cứu sâu sàng lọc hoạt chất có tác dụng ức chế enzym XO mướp đắng, đặc biệt cắn phân đoạn ethyl acetat nước Kết mô tương tác hợp chất mướp đắng với enzym xanthin oxidase cho thấy số 49 hợp chất đem sàng lọc, có 26 hợp chất thuộc nhóm saponin dự đốn có tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh quercetin Do đó, thấy saponin nhóm hợp chất có liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase mướp đắng Về mặt hóa học, hợp chất có tính phân cực mạnh nên chiết xuất phân bố chủ yếu phân đoạn nước phân đoạn ethyl acetat Như vậy, kết docking tương đối phù hợp với kết thực nghiệm in vitro Kết phân tích tương tác hợp chất sàng lọc với xanthin oxidase cho thấy liên kết hydro chất với Arg880 Thr1010 phân tử xanthin oxidase có vai trị quan trọng tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất Kết phù hợp với nghiên cứu trước rằng: Arg880, Thr1010 hai số amino acid trung tâm hoạt động xanthin oxidase [47] Vai trò cụ thể amino acid Arg880 Thr1010 không tạo liên kết hydro với phối tử, mà tăng cường xúc tác trình gắn chất vào trung tâm hoạt động enzym tương tác tĩnh điện, từ đó, tham gia vào trình xúc tác xanthin oxidase [36] Kết dự đốn số thơng số dược động học đặc tính phù hợp để làm thuốc 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase xác định hợp chất tiềm có đặc tính phù hợp để làm thuốc hợp chất số 4, 7, 13, 15 24 Bước dự đốn số thơng số ADME 28 hợp chất giúp loại bỏ 23 hợp chất, lại hợp chất phù hợp làm thuốc để tiến hành thử nghiệm tiếp theo, từ giúp tiết kiệm đáng kể thời gian, chi phí cơng sức trình nghiên cứu phát triển thuốc 3.2.2 Về kết nghiên cứu tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng Các nghiên cứu α-glucosidase enzym quan trọng trình hấp thu carbohydrat Vì vậy, ức chế α-glucosidase làm chậm trình phân hủy hấp thu carbohydrat vào máu, từ hạn chế tăng nồng độ glucose máu sau ăn [45] Kết đánh giá mô hình thực nghiệm in vitro, từ giá trị IC50 mẫu thử cho thấy cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng không 36 thể tác dụng ức chế α-glucosidase Tuy nhiên, nồng độ 64 µg/ml, cắn phân đoạn ethyl acetat có xu hướng ức chế α-glucosidase với giá trị phần trăm ức chế (I%) cao so với acarbose nồng độ Từ gợi ý phân đoạn ethyl acetat có thành phần có tác dụng ức chế α-glucosidase Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng mô tương tác Kết quả, từ 49 hợp chất mướp đắng đem sàng lọc có hợp chất số 31 dự đốn có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh acarbose Kết phân tích tương tác hợp chất 31 acarbose với α-glucosidase cho thấy tham gia amino acid His626, Asp357, Asp568, Arg552 Kết phù hợp với nghiên cứu trước bốn số amino acid trung tâm hoạt động α-glucosidase [50] Kết góp phần khẳng định thêm tính xác phương pháp dự đoán hợp chất số 31 có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh acarbose Mặc dù hợp chất số 31 dự đốn có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh so với acarbose kết dự đốn số thơng số dược động học cho thấy hợp chất có độ tan nước Cấu trúc hóa học hợp chất số 31 cho thấy hợp chất tan phần ethyl acetat Kết tương đối phù hợp với việc cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng tác dụng ức chế α-glucosidase rõ rệt nghiên cứu đánh giá tác dụng in vitro, nồng độ 64 µg/ml, cắn phân đoạn ethyl acetat có xu hướng ức chế α-glucosidase với giá trị phần trăm ức chế (I%) cao so với acarbose nồng độ 3.2.3 Về ý nghĩa kết nghiên cứu Hiện giới có nhiều nghiên cứu áp dụng phương pháp mô tương tác sàng lọc hợp chất tự nhiên [31], [53] Tuy nhiên, nghiên cứu tiến hành sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng phương pháp docking phân tử Thuốc thảo dược thường có thành phần hóa học tác dụng phức tạp Do vậy, vấn đề đảm bảo tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào thành phẩm sản phẩm trung gian cần thiết Để giải vấn đề này, thông thường một vài hợp chất chọn làm chất đánh dấu (marker) để đánh giá chất lượng thuốc từ dược liệu Một marker lý tưởng thường yêu cầu phải phản ánh thành phần có 37 tác dụng dược lý với dược liệu thuốc thảo dược nghiên cứu Tuy nhiên, đa số marker lựa chọn chưa xác định tác dụng dược lý cách rõ ràng Do đó, cần thiết phải có phương pháp giúp xác định nhanh chóng hoạt chất có dược liệu cách xác để lựa chọn marker phù hợp Bằng phương pháp mô tương tác kết hợp với thực nghiệm in vitro, đề tài sàng lọc 28 hợp chất có tác dụng ức chế XO gồm 26 saponin (1, 2, 4, 5, 7-11, 13, 15-18, 20-31), 01 flavonoid (34), 01 acid phenolic (49) 01 hợp chất (31) có tác dụng ức chế αglucosidase mướp đắng Từ cho thấy saponin mướp đắng nhóm hoạt chất liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase dược liệu Các kết sở cho nghiên cứu nhằm mục đích chiết xuất tối đa hoạt chất xác định từ mướp đắng tiêu chuẩn hóa dược liệu theo hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết sau: Đã tiến hành đánh giá tác dụng ức chế XO tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng Kết cho thấy cao ethanol chiết xuất từ mướp đắng có tác dụng ức chế XO in vitro trung bình với giá trị IC50 138,40 µg/ml Cắn phân đoạn nước cắn phân đoạn ethyl acetat thể tác dụng ức chế XO mạnh rõ rệt tất phân đoạn với giá trị IC50 111,80 µg/ml 139,40 µg/ml Cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ mướp đắng tác dụng ức chế α-glucosidase Tuy nhiên, nồng độ 64 µg/ml, cắn phân đoạn ethyl acetat có xu hướng ức chế α-glucosidase với giá trị phần trăm ức chế (I%) 39,0%, so sánh với giá trị phần trăm ức chế acarbose nồng độ 27,0% Đã tiến hành sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase hợp chất ức chế α-glucosidase mướp đắng phương pháp mô tương tác Kết thu 28 hợp chất tiềm có tác dụng ức chế xanthin oxidase (1, 2, 4, 5, 711, 13, 15-18, 20-31, 34, 49) hợp chất tiềm có tác dụng ức chế α-glucosidase (31) mướp đắng Saponin mướp đắng nhóm chất có liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase dược liệu Đã tiến hành dự đốn độ tan, số thơng số dược động học (khả hấp thu, chuyển hóa qua gan, ảnh hưởng bơm tống thuốc) tính điểm theo quy tắc Lipinski 28 hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase mướp đắng Kết thu hợp chất có đặc tính dược động học phù hợp làm thuốc bao gồm hợp chất số 4, 7, 13, 15 24 KIẾN NGHỊ Chiết xuất phân lập hợp chất saponin phân đoạn dịch chiết ethyl acetat phân đoạn nước mướp đắng Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất phân lập Trong nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu mướp đắng theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase cần lựa chọn nhóm hoạt chất marker saponin 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung (2018), "Nghiên cứu chiết tách hợp chất có hoạt tính ức chế alpha - glucosidase trái khổ qua thử nghiệm tác dụng kiểm soát đường huyết sau ăn", Đề tài NCKH cấp sở khoa học công nghệ TP.HCM Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 735 Viện Dược liệu (2017), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 341 Tiếng Anh 10 11 12 13 Ahamad Javed, Amin Saima, et al (2017), "Momordica charantia Linn.(Cucurbitaceae): Review on phytochemistry and pharmacology", Phytochemistry, 11(2), pp 53-65 Ahmed Danish, Kumar Vikas, et al (2014), "Target guided isolation, in vitro antidiabetic, antioxidant activity and molecular docking studies of some flavonoids from Albizzia Lebbeck Benth bark", BMC complementary alternative medicine, 14(1), pp 155 Ahmed I, Adeghate E, et al (1998), "Effects of Momordica charantia fruit juice on islet morphology in the pancreas of the streptozotocin-diabetic rat", Diabetes research clinical practice, 40(3), pp 145-151 An Xiaojuan, Li Wenping, et al (2018), "Fruit quality components of balsam pear (Momordica charantia L.) and soil respiration in response to soil moisture under two soil conditions", Journal of Food Measurement Characterization, 12(2), pp 710-720 Anmin Lu, Charles Jeffrey (2011), Cucurbitaceae, In: Wu, Z Y., P H Raven & D Y Hong (eds), Flora of China, Vol 19, (Cucurbitaceae through Valerianaceae, with Annonaceae and Berberidaceae), Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press Begum Sabira, Ahmed Mansoor, et al (1997), "Triterpenes, a sterol and a monocyclic alcohol from Momordica charantia", Phytochemistry, 44(7), pp 1313-1320 Braca Alessandra, Siciliano Tiziana, et al (2008), "Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil", Fitoterapia, 79(2), pp 123-125 Budrat Parichat, Shotipruk Artiwan (2009), "Enhanced recovery of phenolic compounds from bitter melon (Momordica charantia) by subcritical water extraction", Separation Purification Technology, 66(1), pp 125-129 Cheung Imelda WY, Nakayama Satoko, et al (2009), "Angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity of hydrolysates from oat (Avena sativa) proteins by in silico and in vitro analyses", Journal of agricultural food chemistry, 57(19), pp 9234-9242 Commitee MHM Forest Research Institute Malaysia (2012), "Malaysian herbal monograph", Forest Research Institute Malaysia, 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Cotelle Nicole (2001), "Role of flavonoids in oxidative stress", Current topics in medicinal chemistry, 1(6), pp 569-590 Deng Yuanyuan, Tang Qin, et al (2017), "Protective effect of Momordica charantia water extract against liver injury in restraint-stressed mice and the underlying mechanism", Food nutrition research, 61(1), pp 1348864 Gürbüz İlhan, Akyüz Çiğdem, et al (2000), "Anti-ulcerogenic effect of Momordica charantia L fruits on various ulcer models in rats", Journal of Ethnopharmacology, 71(1-2), pp 77-82 Harinantenaina Liva, Tanaka Michi, et al (2006), "Momordica charantia constituents and antidiabetic screening of the isolated major compounds", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 54(7), pp 1017-1021 Horax Ronny, Hettiarachchy Navam, et al (2005), "Total phenolic contents and phenolic acid constituents in varieties of bitter melons (Momordica charantia) and antioxidant activities of their extracts", Journal of food science, 70(4), pp C275-C280 Huang Sheng-You, Grinter Sam Z, et al (2010), "Scoring functions and their evaluation methods for protein–ligand docking: recent advances and future directions", Physical Chemistry Chemical Physics, 12(40), pp 12899-12908 Hwang Eun-Sun (2018), "Comparison of antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity between bitter melon (Momordica charantia) fruit and leaf extract", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 8(4), pp 189 Ibrahim Taghreed A, El-Hefnawy Hala M, et al (2010), "Antioxidant potential and phenolic acid content of certain cucurbitaceous plants cultivated in Egypt", Natural product research, 24(16), pp 1537-1545 Irwin John J, Shoichet Brian K (2005), "ZINC− a free database of commercially available compounds for virtual screening", Journal of chemical information modeling, 45(1), pp 177-182 Jain Ajay N (2006), "Scoring functions for protein-ligand docking", Current Protein Peptide Science, 7(5), pp 407-420 Jia Shuo, Shen Mingyue, et al (2017), "Recent advances in Momordica charantia: functional components and biological activities", International journal of molecular sciences, 18(12), pp 2555 Joseph Baby, Jini D (2013), "Antidiabetic effects of Momordica charantia (bitter melon) and its medicinal potency", Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 3(2), pp 93-102 Kenny O, Smyth TJ, et al (2013), "Antioxidant properties and quantitative UPLC-MS analysis of phenolic compounds from extracts of fenugreek (Trigonella foenum-graecum) seeds and bitter melon (Momordica charantia) fruit", Food chemistry, 141(4), pp 4295-4302 Khanna Pushpa, Jain SC, et al (1981), "Hypoglycemic activity of polypeptide-p from a plant source", Journal of Natural Products, 44(6), pp 648-655 Kim Sunghwan, Thiessen Paul A, et al (2016), "PubChem substance and compound databases", Nucleic acids research, 44(D1), pp D1202-D1213 Kitchen Douglas B, Decornez Hélène, et al (2004), "Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications", Nature reviews Drug discovery, 3(11), pp 935-949 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Kubola Jittawan, Siriamornpun Sirithon (2008), "Phenolic contents and antioxidant activities of bitter gourd (Momordica charantia L.) leaf, stem and fruit fraction extracts in vitro", Food chemistry, 110(4), pp 881-890 Lin Chun-Mao, Chen Chien-Shu, et al (2002), "Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine oxidase", Biochemical Biophysical Research Communications, 294(1), pp 167-172 Lin Kai-Wei, Yang Shyh-Chyun, et al (2011), "Antioxidant constituents from the stems and fruits of Momordica charantia", Food chemistry, 127(2), pp 609614 Matsuura Hideyuki, Asakawa Chikako, et al (2002), "α-glucosidase inhibitor from the seeds of balsam pear (Momordica charantia) and the fruit bodies of Grifola frondosa", Bioscience, biotechnology, biochemistry, 66(7), pp 15761578 Morris Garrett M, Lim-Wilby Marguerita (2008), "Molecular docking", Molecular modeling of proteins, Springer, pp 365-382 Nhiem Nguyen Xuan, Van Kiem Phan, et al (2010), "α-Glucosidase inhibition properties of cucurbitane-type triterpene glycosides from the fruits of Momordica charantia", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 58(5), pp 720-724 Nishino Tomoko, Okamoto Ken, et al (2008), "Mammalian xanthine oxidoreductase–mechanism of transition from xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase", The FEBS journal, 275(13), pp 3278-3289 Noro Tadataka, Oda Yasushi, et al (1983), "Inhibitors of xanthine oxidase from the flowers and buds of Daphne genkwa", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 31(11), pp 3984-3987 Okabe Hikaru, Miyahara Yumi, et al (1982), "Studies on the constituents of Momordica charantia L III Characterization of new cucurbitacin glycosides of the immature fruits Structures of momordicosides G, F1, F2 and I", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 30(11), pp 3977-3986 Okabe Hikaru, Miyahara Yumi, et al (1980), "Studies on the constituents of Momordica charantia L I Isolation and characterization of momordicosides A and B, glycosides of a pentahydroxy-cucurbitane triterpene", Chemical Pharmaceutical Bulletin, 28(9), pp 2753-2762 Ozusaglam M Asan, Karakoca K (2013), "Antimicrobial and antioxidant activities of Momordica charantia from Turkey", African Journal of Biotechnology, 12(13), pp Parawansah Parawansah, Nuralifah Nuralifah, et al (2016), "Inhibition of Xanthine Oxidase Activity by Ethanolic Extract of Piperomia pellucida L., Acacypha indica L and Momordica charantia L", The Indonesian Biomedical Journal, 8(3), pp 161-6 Patel S, Patel T, et al (2011), "Evaluation of antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of Momordica charantia Linn fruit", Adv Res Pharmacol Biol, 1, pp 120-9 Paul Ananya, Raychaudhuri Sarmistha Sen (2010), "Medicinal uses and molecular identification of two Momordica charantia varieties-a review", Electronic Journal of Biology, 6(2), pp 43-51 Poovitha Sundar, Parani Madasamy (2016), "In vitro and in vivo α-amylase and α-glucosidase inhibiting activities of the protein extracts from two varieties of 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 bitter gourd (Momordica charantia L.)", BMC complementary alternative medicine, 16(1), pp 185 Proenỗa Carina, Freitas Marisa, et al (2017), "α-Glucosidase inhibition by flavonoids: an in vitro and in silico structure–activity relationship study", Journal of enzyme inhibition medicinal chemistry, 32(1), pp 1216-1228 Rahman Inayat Ur, Bashir Mohammad, et al (2011), "Bitter melon (Momordica charantia) reduces serum sialic acid in type2 diabetics: evidence to delay the process of atherosclerosis", Chinese Medicine, 2(4), pp 125 Roy Subhajit, Narang Bawneet K, et al (2018), "Molecular docking studies on isocytosine analogues as xanthine oxidase inhibitors", Drug research, 68(07), pp 395-402 Singh Neera, Gupta Manushma (2007), "Regeneration of β cells in islets of langerhans of pancreas of alloxan diabetic rats by acetone extract of Momordica charantia (Linn.)(bitter gourd) fruits", Indian journal of experimental biology, 45, pp 1055-1062 Singh Pushpendra, Bast Felix (2014), "Multitargeted molecular docking study of plant-derived natural products on phosphoinositide-3 kinase pathway components", Medicinal Chemistry Research, 23(4), pp 1690-1700 Tagami Takayoshi, Yamashita Keitaro, et al (2013), "Molecular basis for the recognition of long-chain substrates by plant α-glucosidases", Journal of Biological Chemistry, 288(26), pp 19296-19303 Tan Sing P, Parks Sophie E, et al (2014), "Greenhouse‐grown bitter melon: production and quality characteristics", Journal of the Science of Food, 94(9), pp 1896-1903 Tien Nguyen Truong, Thanh Bui Tho (2018), "Predicting binding modes and affinities for non-nucleoside inhibitors to HIV-1 reverse transcriptase using molecular docking", Science and Technology Development Journal-Natural Sciences, 2(1), pp 53-58 Umamaheswari Muthuswamy, Madeswaran Arumugam, et al (2011), "Discovery of potential xanthine oxidase inhibitors using in silico docking studies", Der Pharma Chemica, 3(5), pp 240-247 Upadhyay Aparna, Agrahari Pooja, et al (2015), "A review on salient pharmacological features of Momordica charantia", Int J Pharmacol, 11(5), pp 405-413 Van Hoorn Danny EC, Nijveldt Robert J, et al (2002), "Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of flavonoids", European journal of pharmacology, 451(2), pp 111-118 Vilar Santiago, Cozza Giorgio, et al (2008), "Medicinal chemistry and the molecular operating environment (MOE): application of QSAR and molecular docking to drug discovery", Current topics in medicinal chemistry, 8(18), pp 1555-1572 Wang Yan-Hong, Avula Bharathi, et al (2008), "Determination and quantitation of five cucurbitane triterpenoids in Momordica charantia by reversed-phase high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection", Journal of chromatographic science, 46(2), pp 133-136 58 59 60 61 62 63 64 65 Wu Shu-Jing, Ng Lean-Teik (2008), "Antioxidant and free radical scavenging activities of wild bitter melon (Momordica charantia Linn var abbreviata Ser.) in Taiwan", LWT-Food Science Technology, 41(2), pp 323-330 Xiang Leiwen, Huang Xiaonan, et al (2007), "The reparative effects of Momordica Charantia Linn extract on HIT-T15 pancreatic beta-cells", Asia Pac J Clin Nutr, 16(1), pp 249-252 Yong-Mu Kim Myeong-Hyeon Wang, Hae-Ik Rhee (2004), "A novel alphaglucosidase inhibitor from pine bark", Carbohydrate Research, 339(3), pp 715717 Yuwai Kuri E, Rao Koyyalamudi Sundar, et al (1991), "Chemical composition of Momordica charantia L fruits", Journal of Agricultural Food Chemistry, 39(10), pp 1762-1763 Zhang Fan, Lin Lihua, et al (2016), "A mini-review of chemical and biological properties of polysaccharides from Momordica charantia", International journal of biological macromolecules, 92, pp 246-253 Zhang Huan, Wang Yajing, et al (2014), "Impact of the subtle differences in MMP-12 structure on Glide-based molecular docking for pose prediction of inhibitors", Journal of Molecular Structure, 1076, pp 153-159 Zhang Li-Jie, Liaw Chia-Ching, et al (2014), "Cucurbitane-type glycosides from the fruits of Momordica charantia and their hypoglycaemic and cytotoxic activities", Journal of Functional Foods, 6, pp 564-574 Zhu Ji Xiao, Wang Ying, et al (2004), "Effects of Biota orientalis extract and its flavonoid constituents, quercetin and rutin on serum uric acid levels in oxonateinduced mice and xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase activities in mouse liver", Journal of ethnopharmacology, 93(1), pp 133-140 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN ... ? ?Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase α -glucosidase mướp đắng mô tương tác kết hợp thực nghiệm in vitro? ?? thực với ba mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế. .. lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α -glucosidase mướp đắng mô tương tác Tiến hành sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng. .. học hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất có tác dụng ức chế α -glucosidase mướp đắng Dựa vào kết sàng lọc mục 2.3.4, từ lựa chọn hợp chất có tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp