Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUỆ TRIỂN KHAI PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ÁP DỤNG VỚI MỘT SỐ CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG KHAI THÁC CỦA ĐỒNG BÀO PAKO – VÂN KIỀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: T.S Nguyễn Thùy Duơng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tơi nhận giúp đỡ quý báu tập thể, thầy cô giáo, bạn bè người thân Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thùy Dương, người thầy hướng dẫn tận tình quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu môn trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các thầy cô anh chị kĩ thuật viên môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận PGS.TS Nguyễn Thị Hồi, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Huế TS Phương Thiện Thương, Khoa Phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Lời cuối cùng, tơi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - người ủng hộ, chia sẻ, động viên tơi lúc khó khăn giúp tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng 5, năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Huệ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC CÁC BẢNG .v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh gút 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Mối liên quan bệnh gút tăng acid uric máu, vai trò enzym xanthin oxidase 1.1.3 Thuốc ức chế xanthin oxidase .5 1.2 Tổng quan xanthin oxidase .6 1.2.1 Nguồn gốc, phân bố .6 1.2.2 Cấu trúc, chế hoạt động 1.2.3 Động học enzym 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzym .9 1.3 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro 11 1.3.1 Phƣơng pháp đo quang 12 1.3.2 Phƣơng pháp đo áp 13 1.3.3 Phƣơng pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 14 1.4 Các dƣợc liệu có tiềm ức chế xanthin oxidase 14 1.5 Thông tin số dƣợc liệu đồng bào Pako- Vân Kiều 15 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .17 2.1.1 Dƣợc liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 18 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 18 2.2.1 Thuốc hóa chất 18 2.2.2 Thiết bị dụng cụ .19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .20 2.4.1 Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng 20 2.4.2 Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng thuốc đồng bào Pako – Vân Kiều 24 2.4.3 Phƣơng pháp thống kê 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết 26 3.1.1 Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng 26 3.1.2 Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng thuốc đồng bào Pako – Vân Kiều 31 3.2 Bàn luận 37 3.2.1 Về triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng 37 3.2.2 Về áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro thuốc có tiềm khai thác đồng bào Pako – Vân Kiều 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) AHP : 2-amino-4-hydroxypteridin DMSO : dimethyl sulfoxid HPLC : sắc kí lỏng hiệu cao (high-performance liquid chromatography) IC50 : nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration) IXP : isoxanthopterin NSAIDs : thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thông tin số thuốc đồng bào Pako – Vân Kiều 16 Bảng 2.1 Danh sách thuốc nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase allopurinol nồng độ khác Bảng 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase Quercetin nồng độ khác Bảng 3.3 33 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase 11 mẫu dược liệu nồng độ 10µg/mL Bảng 3.6 32 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase 11 mẫu dược liệu nồng độ 50µg/mL Bảng 3.5 30 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase 11 mẫu dược liệu nồng độ 100µg/mL Bảng 3.4 28 34 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase mán đĩa theo nồng độ khác 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa base purin Hình 1.2 Cấu trúc xanthin oxidase Hình 1.3 Cơ chế hoạt động xanthin oxidase Hình 1.4 Đồ thị hàm số ngược 1/v [S] có mặt vắng mặt chất ức chế 11 Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym 21 Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm xây dựng đồ thị phương trình Linewweaver – Burk Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase mẫu thử Hình 2.4 23 Quy trình thí nghiệm xác định chế ức chế xanthin oxidase Hình 3.1 22 24 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc theo thời gian lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD) với dung dịch enzym nồng độ khác 26 Hình 3.2 Đồ thị Lineweaver – Burk xanthin oxidase 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase allopurinol theo nồng độ Hinh 3.4 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase quercetin theo nồng độ Hình 3.5 30 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase cao tồn phần Mán đĩa theo nồng độ Hình 3.6 29 36 Đồ thị biểu diễn chế ức chế xanthin oxidase cao phần mán đĩa 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Gút bệnh chuyển hóa, có liên quan trực tiếp đến chế độ ăn uống giàu acid nucleic nhƣ thịt (đặc biệt nội tạng), loại đậu, số loại hải sản nấm men Bệnh xảy dân tộc, điều kiện địa dƣ khí hậu, có chiều hƣớng phát triển thành thị tầng lớp có mức sống cao [1] Trên giới nay, tỉ lệ mắc gút ngƣời trƣởng thành 1%, bệnh viêm khớp phổ biến nam giới [14] Ở Việt Nam gần đây, đời sống ngƣời dân ngày cao lại đƣợc quan tâm chẩn đoán nên tỉ lệ phát mắc gút ngày lớn [12] Trƣớc tình hình bệnh gút ngày phổ biến, nghiên cứu phát triển thuốc điều trị gút ngày đƣợc quan tâm Bên cạnh việc phát triển thuốc tổng hợp hóa học, thực vật dƣợc liệu nguồn nguyên liệu to lớn để tìm hƣớng cho trình điều trị bệnh gút Nhiều nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm dƣợc liệu có tiềm điều trị gút đƣợc tiến hành với thử nghiệm in vivo lẫn in vitro Trong đó, thử nghiệm in vitro thể lợi với ƣu điểm nhanh đỡ tốn Đặc biệt, đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều tác giả lựa chọn nhằm tìm kiếm dƣợc liệu có tiềm điều trị gút [30] Có nhiều phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, đó, phƣơng pháp đo quang dựa định lƣợng acid uric phƣơng pháp phổ biến, thực dễ dàng điều kiện nƣớc Bên cạnh đó, Việt Nam đất nƣớc có nhiều tài nguyên cỏ, cộng với y học cổ truyền phát triển với nguồn tri thức sử dụng thuốc dân gian 54 dân tộc khác Mỗi dân tộc có kinh nghiệm sử dụng dƣợc liệu khác nhau, nguồn liệu to lớn để nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh nói chung bệnh gút nói riêng Trƣớc yêu cầu điều kiện nhƣ vậy, đề tài nghiên cứu “ Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa 96 giếng áp dụng với số thuốc có tiềm khai thác đồng bào Pako – Vân Kiều” đƣợc thực với hai mục tiêu sau: Triển khai đƣợc phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa Costar 96 giếng Đánh giá khả ức chế xác định đƣợc IC50 thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh thuốc có tiềm khai thác đồng bào Pako –Vân Kiều CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh gút 1.1.1 Định nghĩa Gút bệnh rối loạn chuyển hóa liên quan đến tình trạng tăng acid máu [1],[7],[20] Bệnh biểu viêm khớp cấp tái diễn lặp lặp lại liên quan đến tinh thể urat kết tinh, bệnh thận gút, sỏi thận, lắng đọng natri urat (tophi) sụn, gân, màng hoạt dịch mô khác thể [20] 1.1.2 Mối liên quan bệnh gút tăng acid uric máu, vai trò xanthin oxidase ● Mối liên quan bệnh gút tăng acid uric máu Acid uric sản phẩm thối giáng cuối nucleoprotein có chứa nhân purin [1],[3],[20] Khi nồng độ acid uric vƣợt giới hạn tối đa hịa tan urat dung dịch có nồng độ natri nhƣ huyết tƣơng – tức tình trạng tăng acid máu, liên quan trực tiếp đến bệnh gút Trong trƣờng hợp, tăng acid uric máu dẫn đến tích lũy tinh thể urat mơ, tạo nên hạt microtophi Sự lắng đọng urat mô khác gây biểu khác Hạt tophi sụn khớp bị vỡ khởi phát gút cấp; lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch,trong mô sụn mô xƣơng dẫn đến bệnh xƣơng khớp mạn tính gút; có mặt vi tinh thể urat mơ mềm, bao gân tạo hạt tophi; viêm thận kẽ (bệnh thận gút) tinh thể urat lắng đọng tổ chức kẽ thận Acid uric niệu tăng toan hóa nƣớc tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu bệnh gút [7],[20] Tăng acid uric máu đƣợc xác định yếu tố nguy gút [20] Nồng độ acid uric máu cao nguy mắc gút lớn [37] Bất kì yếu tố làm tăng trình tổng hợp giảm thải trừ acid uric làm tăng nồng độ acid uric máu [20] ● Vai trò xanthin oxidase sinh chuyển hóa acid uric Xanthin oxidase enzym có vai trị quan trọng việc hình thành acid uric Enzym có vai trị xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin 32 Bảng 3.3 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase 11mẫu thuốc nồng độ 100 µg/mL % ức chế hoạt độ xanthin oxidase Cây thuốc ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase Chứng 0,529 ± 0,056 100 Mán đĩa 0,332 ± 0,012 * 62,8 37,2 Nắp ấm 0,518 ± 0,011 98,1 1,9 Ngõa lông 0,424 ± 0,023* 80,3 19,7 Gối hạc (cành mang lá) 0,481 ± 0,023 91 Gối hạc (rễ) 0.485 ± 0,035 91,9 8,1 Phèn đen 0,469 ± 0,058 88,9 11,1 Đuôi chuột 0,454 ± 0,030 86 14 Tóp mỡ thẳng 0,499 ± 0,039 94,5 5,5 Sâm bịng bong 0,511 ± 0,013 96,6 3,4 Kim phƣợng 0,509 ± 0,012 96,4 3,6 Dây hƣơng 0,456 ± 0,037 86,4 13,6 Ghi chú: *: p