96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều
● Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 mẫu dược liệu ở ba nồng độ khác nhau
Bố trí thí nghiệm nhƣ mô tả ở hình 2.3 với chất thử là dịch chiết các cây thuốc ở 3 nồng độ 10 µg/mL, 50µg/mL, 100 µg/mL.
- Đánh giá kết quả:
Tính I (% ức chế) theo công thức (1).
● Xác định IC50 của cây thuốc tiềm năng nhất.
Từ kết quả sàng lọc trong các dƣợc liệu ở trên, tìm ra dƣợc liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase cao nhất.
Bố trí thí nghiệm nhƣ mô tả ở hình 2.3 với chất thử là các nồng độ khác nhau của dƣợc liệu tiềm năng.
● Xác định sơ bộ cơ chế ức chế xanthin oxidase của cây thuốc tiềm năng nhất
- Bố trí thí nghiệm:
Lắc, ủ trong 15 phút ở 25ºC
Thêm 60 µl xanthin (với các nồng độ thay đổi từ 50 µM-100 µM)
Ủ trong 5 phút
Dừng phản ứng bằng 25 µl HCl 1N
Đo quang ở 290nm
Hình 2.4.
Quy trình thí nghiệm xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase
Song song với mỗi mẫu thử có một mẫu trắng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣng enzym đƣợc cho vào sau khi cho HCl 1N.
- Đánh giá kết quả:
Xây dựng đồ thị phƣơng trình Lineweaver – Burk cho nồng độ chất thử, dựa vào đồ thị xác định cơ chế ức chế enzym của dƣợc liệu.
Các giếng thử 65 µl đệm, 20 µl chất thử nồng độ 200 µg.mL, 30 µl dung dịch enzym. Các giếng chứng 85 µl đệm, 30 µl dung dich enzym.
2.4.3. Phương pháp thống kê
Số liệu đƣợc lƣu trữ và xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm SPSS 13.0.
Số liệu đƣợc biểu diễn dƣới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Xtb ± SD). Sử dụng One-way ANOVA với test hậu kiểm Dunnett (post hoc) để so sánh giá trị trung bình giữa các mẫu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nếu p< 0,05.
Sử dụng phân tích probit để tìm giá trị ức chế 50% hoạt động enzym IC50. Giá trị IC50 đƣợc biểu diễn với khoảng tin cậy 95%.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng
● Khảo sát động học enzym
Để lựa chọn đƣợc nồng độ enzym thích hợp mà tại đó lƣợng acid uric tạo thành tuyến tính theo thời gian nhất, thí nghiệm đƣợc tiến hành với 6 dung dịch enzym có hoạt độ khác nhau. Sự phụ thuộc của lƣợng acid uric tạo thành theo thời gian đƣợc biểu diễn dƣới dạng đồ thị. Kết quả thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD) với các dung dịch enzym có hoạt độ khác nhau.
Nhận xét:
- Ở hoạt độ 0,01 và 0,02 U/mL, enzym hoạt động khá yếu, lƣợng acid uric tăng chậm theo thời gian. Với các hoạt độ 0,06, 0,08 và 0,1 U/mL, enzym hoạt động mạnh, lƣợng acid uric tăng nhanh và đạt đến tình trạng bão hòa khi chƣa hết thời gian phản ứng. Ở hoạt độ 0,04 U/mL, enzym hoạt động tốt, lƣợng acid uric tạo thành tuyến tính theo thời gian. Vì vậy, hoạt độ này đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo của đề tài.
- Sau thời gian 30 phút, phản ứng đạt bão hòa đối với hầu hết các hoạt độ enzym. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo, phản ứng sẽ đƣợc dừng tại thời điểm 30 phút bằng HCl 1N.
● Xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase
Tiến hành thí nghiệm với các dung dịch cơ chất có nồng độ khác nhau. Kết quả đƣợc biểu diễn ở đồ thị hình 3.2.
Hình 3.2.
● Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của allopurinol và quercitin.
- Allopurinol là một chất thử đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro và in vivo. Để thẩm định phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động xanthin oxidase in vitro của dƣợc liệu trên đĩa 96 giếng, chúng tôi
tiến hành đánh giá tác dụng của chất này. Tiến hành thí nghiệm với chất thử là các dung dịch allopurinol ở nồng độ khác nhau. Kết quả đƣợc biễu diễn ở bảng 3.1 và hình 3.3.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của allopurinol ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ allopurinol (µg/ml) ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase 0 0,539 ± 0,066 100 0,2 0,479 ± 0,018 89,1 10,9 0,3 0,452 ± 0,025 84,1 15,9 0,4 0,353 ± 0,018 65,5 34,5 0,5 0,255 ± 0,065 47,1 52,9 0,6 0,079 ± 0,048 14,7 85,3 0,7 0,037 ± 0,014 6,9 93,1
Hình 3.3.
Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của allopurinol theo nồng độ Nhận xét:
Allopurinol ở các nồng độ khác nhau thể hiện sự ức chế rõ rệt hoạt động của xanthin oxidase, nồng độ càng lên cao, khả năng ức chế càng lớn. Tại nồng độ 0,7 µg/mL, khả năng ức chế đã đạt gần đến 100%.
Theo kết quả phân tích probit, nồng độ allopurinol ức chế 50% hoạt động xanthin oxidase là 0,456 (0,416-0,497) µg/mL.
- Quercetin là một flavonoid đƣợc chiết xuất từ dƣợc liệu và cũng đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế hoạt động của xanthin oxidase in vitro và in vivo.
Chúng tôi cũng sử dụng chất này để thẩm định phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng. Tiến hành thí nghiệm với chất thử là các dung dịch quercetin ở các nồng độ khác nhau. Kết quả đƣợc biểu diễn ở bảng 3.2 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của quercetin ở các nồng độ khác nhau.
Nồng độ
quercetin (µg/mL) ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase 0 0,610 ± 0,016 100 15 0,496 ± 0,023 81,3 18,7 20 0,380 ± 0,006 62,3 37,7 25 0,300 ± 0,022 49,2 50,8 30 0,261 ± 0,030 42,8 57,2 35 0,193 ± 0,021 31,7 68,3 40 0,141 ± 0,008 23,1 76,9
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của quercetin theo nồng độ
Nhận xét:
Quercetin thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase rõ rệt theo từng nồng độ, nồng độ càng cao, khả năng ức chế xanthin oxidase càng lớn.
Theo kết quả phân tích probit, IC50 của quercetin là 26,779 (24,953 - 28,543) µg/mL.
Nhƣ vậy, sử dụng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng cho kết quả phù hợp với allopurinol và quercetin.
3.1.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều
3.1.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 10 cây thuốc ở ba nồng độ khác nhau
Phƣơng pháp sau khi đƣợc thẩm định đƣợc áp dụng với mẫu thử là cao toàn phần của 10 cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều. Tiến hành thí nghiệm với 3 nồng độ khác nhau 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL cho mỗi mẫu cao toàn phần để xác định tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro.
- Tại nồng độ 100 µg/mL
Nồng độ 100 µg/mL thƣờng là nồng độ giới hạn trên đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng để nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các dịch
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11mẫu cây thuốc ở nồng độ 100 µg/mL.
Cây thuốc ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase Chứng 0,529 ± 0,056 100 Mán đĩa 0,332 ± 0,012 * 62,8 37,2 Nắp ấm 0,518 ± 0,011 98,1 1,9 Ngõa lông 0,424 ± 0,023* 80,3 19,7 Gối hạc (cành mang lá) 0,481 ± 0,023 91 9 Gối hạc (rễ) 0.485 ± 0,035 91,9 8,1 Phèn đen 0,469 ± 0,058 88,9 11,1 Đuôi chuột 0,454 ± 0,030 86 14 Tóp mỡ thẳng 0,499 ± 0,039 94,5 5,5 Sâm bòng bong 0,511 ± 0,013 96,6 3,4 Kim phƣợng 0,509 ± 0,012 96,4 3,6 Dây hƣơng 0,456 ± 0,037 86,4 13,6
Ghi chú: *: p<0,05 khi so với mẫu chứng (mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần) Nhận xét:
Ở nồng độ 100 µg/mL, chỉ có mán đĩa và ngõa lông thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase với % ức chế tƣơng ứng là 37,2% và 19,7% (p<0,05). Những dƣợc liệu khác đều không thể hiện tác dụng ức chế hoặc ức chế không đáng kể.
- Tại nồng độ 50µg/mL.
Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11mẫu cây thuốc ở nồng độ 50 µg/mL.
Dƣợc liệu ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase Chứng 0,529 ± 0,056 100 Mán đĩa 0,434 ± 0,016* 82,2 17,8 Nắp ấm 0,519 ± 0,016 100 0 Ngõa lông 0,446 ± 0,029* 84,5 15,5 Gối hạc (cành mang lá) 0,505 ± 0,048 95,7 4,3 Gối hạc (rễ) 0,530 ± 0,023 100 0 Phèn đen 0,480 ± 0,030 91 9 Đuôi chuột 0,497 ± 0,045 94,1 5,9 Tóp mỡ thẳng 0,478 ± 0,022 90,6 9,4 Sâm bòng bong 0,503 ± 0,012 95,3 4,7 Kim phƣợng 0,465 ± 0,044 88,1 11,9 Dây hƣơng 0,479 ± 0,009 90,7 9,3
Ghi chú: *: p< 0,05 khi so với mẫu chứng (mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần) Nhận xét:
Ở nồng độ 50 µg/mL, mán đĩa và ngõa lông vẫn tiếp tục thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase với tỉ % ức chế tƣơng ứng là 17,8% và 15,5% (p<0,05). Các cây còn lại không thể hiện khả năng ức chế enzym hoặc ức chế không đáng kể.
-Tại nồng độ 10µg/mL.
Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5.
Bàng 3.5. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 cây thuốc ở nồng độ 10µg/mL
Dƣợc liệu ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase Chứng 0,510 ± 0,009 100 Mán đĩa 0,502 ± 0,007 98,4 1,6 Nắp ấm 0,512 ± 0,019 100,4 - Ngõa lông 0,536 ± 0,031 105,3 - Gối hạc 0,522 ± 0,022 102,3 - Phèn đen 0,516 ± 0,024 101,7 - Đuôi chuột 0,531 ± 0,039 104,1 - Tóp mỡ thẳng 0,527 ± 0,037 103,3 - Sâm bòng bong 0,510 ± 0,021 100 Kim phƣợng 0,467 ± 0,013 91,8 8,2 Dây hƣơng 0,512 ± 0,013 99,4 0,6 Gối hạc (rễ) 0,507 ± 0,020 99,6 0,4
Ghi chú: mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Nhận xét:
Ở nồng độ 10 µg/mL, không có cây thuốc nào thể hiện tác dụng ức chế enzym rõ rệt, kể cả 2 cây mán đĩa và ngõa lông.
● Xác định IC50 của cây thuốc tiềm năng
Sau khi khảo sát ở 3 nồng độ, nhận thấy mán đĩa thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ổn định và rõ rệt nhất. Vì vậy, mán đĩa đƣợc khảo sát một lần nữa để xác định IC50. Thí nghiệm đƣợc bố trí với chất thử là dịch chiết mán đĩa ở các nồng độ 10 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 300 µg/mL. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của cây mán đĩa theo từng nồng độ khác nhau Nồng độ (µg/mL) ∆OD % hoạt độ xanthin oxidase % ức chế hoạt độ xanthin oxidase 0 0,360 ± 0,013 100 10 0,359 ± 0,014 99,7 0,3 20 0,343 ± 0,005 95 5 50 0,293 ± 0,012 81,1 18,9 100 0,239 ± 0,042 66,4 33,6 200 0,134 ± 0,047 37,2 62,8 300 0,033 ± 0,035 9,2 90,8
Hình 3.5.
Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của mán đĩa theo nồng độ Nhận xét :
Tuy không bằng allopurinol và quercetin nhƣng tác dụng ức chế xanthin oxidase của cao toàn phần mán đĩa cũng thể hiện rõ và tăng theo sự tăng của nồng độ.
Theo phân tích probit, IC50 của cao toàn phần mán đĩa là 161,7 (129,6- 203,3) µg/mL.
● Xác định sơ bộ cơ chế ức chế của dược liệu tiềm năng
Để xác định cơ chế ức chế enzym của cao toàn phần cây mán đĩa, thí nghiệm đƣợc bố trí với các dung dịch cơ chất có nồng độ thay đổi. Kết quả đƣợc biểu diễn ở dạng đồ thị phƣơng trình Lineweaver – Burk cho mẫu không có và có chất ức chế (hình 3.6).
Hình 3.6.
Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk với mẫu có và không có ức chế (mán đĩa) Nhận xét :
Dựa vào đồ thị cho thấy cơ chế ức chế xanthin oxidase của cao toàn phần mán đĩa là kiểu hỗn hợp.
3.2. Bàn luận
3.2.1. Về triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng
Xu hƣớng nghiên cứu về tác dụng ức chế xanthin oxidase của dƣợc liệu đang ngày càng phát triển, trên thế giới cũng có khá nhiều phƣơng pháp đánh giá hoạt độ xanthin oxidase cũng nhƣ phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase. Một số tác giả sử dụng phƣơng pháp đo áp [19], có tác giả sử dụng phƣơng pháp huỳnh quang [32], có tác giả lại dùng phƣơng pháp dựa trên chất màu ATBS [29] nhƣng đa phần đều sử dụng phƣơng pháp đo quang dựa trên việc định lƣợng acid
uric theo mô tả của Noro [31]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này thƣờng đƣợc các nhà nghiên cứu áp dụng đo quang trên cuvet [16],[34],[35], chỉ có một số ít tác giả trong nƣớc hay nƣớc ngoài áp dụng trên hệ thống ELISA [30]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với nội dung triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng.
Xanthin oxidase thƣờng đƣợc bảo quản ở 4ºC để đảm bảo hoạt tính. Tuy nhiên trong quá trình pha và tiến hành thí nghiệm, enzym có thể hoạt hóa và sau đó giảm hoạt động. Vì thế, cần phải giữ nhiệt độ thấp cho dung dịch enzym trong cả quá trình làm thí nghiệm bằng cách ngâm cốc đựng enzym trong nƣớc đá. Enzym và cả cơ chất đều chỉ đƣợc pha ngay trƣớc khi dùng. Các nghiên cứu trƣớc đây thƣờng sử dụng dung dịch enzym có hoạt độ 0,01 U/mL – 0,1 U/mL [30],[31],[35]. Trong đề tài của chúng tôi, sau khi khảo sát động học enzym, dung dịch enzym có hoạt độ 0,04 U/mL đã đƣợc lựa chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo bởi vì tại hoạt độ này enzym hoạt động xúc tác tốt, lƣợng acid uric tạo ra tỷ lệ tuyến tính nhất theo thời gian trong 30 phút đầu của phản ứng. Phản ứng đến phút thứ 30 đã đạt bão hòa nên chúng tôi cũng lựa chọn thời điểm sau 30 phút là thời điểm dừng phản ứng. Trong các nghiên cứu tiến hành trƣớc, cũng lựa chọn thời điểm sau 30 phút là thời điểm dừng phản ứng [30],[31].
Dƣợc liệu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase thƣờng đƣợc chiết bằng methanol và hòa tan trong DMSO để làm dịch thử hoặc chiết bằng nƣớc và hòa tan trong đệm hay hỗn hợp ethanol và tween 80 [16],[30],[31],[34],[35]. Các cây thuốc đƣợc sử dụng trong thử nghiệm của chúng tôi cũng đƣợc chiết bằng methanol, đƣợc hòa tan trong DMSO. Khi pha loãng mẫu thành các nồng độ khác nhau, mẫu đƣợc pha loãng bằng đệm để tránh ảnh hƣởng quá nhiều của DMSO.
Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96
giếng đã đƣợc thẩm định thông qua đánh giá tác dụng của allopurinol và quercetin. Allopurinol là một thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi trong gút, có tác dụng hạ acid uric máu thông qua cơ chế ức chế xanthin oxidase, nó thƣờng đƣợc sử dụng làm chất
chứng trong các thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase. Bên cạnh đó, quercetin là một flavonoid đƣợc chiết ra từ dƣợc liệu có tác dụng chống oxi hóa và ức chế hoạt động của enzym xanthin oxidase [13]. Trong phƣơng pháp này, allopurinol và quercitin đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase rõ rệt với IC50 lần lƣợt là 0,456 (0,416-0,497) µg/mL và 26,779 (24,953-28,543) µg/mL. Tuy nhiên giá trị IC50 này khá cao so với các thử nghiệm khác [17],[28]. Điều này có thể do phƣơng pháp sử dụng đĩa Costar 96 giếng 3596 (Corning, Mỹ). Giếng này thƣờng đƣợc sử dụng để đo quang ở bƣớc sóng lớn hơn 340 nm trong khi bƣớc sóng của thí nghiệm này là 290 nm. Điều này có thể đã gây sai số cho phép đo. Tuy phƣơng pháp còn nhiều hạn chế nhƣng nó có những ƣu điểm nhƣ nhanh, độ lặp lại khá ổn định, có thể làm đƣợc nhiều mẫu cùng một lúc, thích hợp với kiểu sàng lọc tác dụng. Bên cạnh đó, kinh phí cho việc sử dụng phƣơng pháp này cũng khá hợp