NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LOÀI Balanophora subcupularis P. C. Tam, HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN QUÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LOÀI Balanophora subcupularis P C Tam, HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN QUÂN 1401501 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LOÀI Balanophora subcupularis P C Tam, HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS Nguyễn Thanh Tùng TS Nguyễn Quang Hưng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Liệu HÀ NỘI - 2019 LỜI CÁM ƠN Khóa luận thực Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội Trong thời gian làm khóa luận, nhận ủng hộ, động viên, giúp đỡ thầy cô, anh chị kĩ thuật viên, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng (Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội), người nhiệt tình hướng dẫn, động viên, ủng hộ truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian làm khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS Nguyễn Quang Hưng người hỗ trợ tơi q trình lấy mẫu thực địa, hỗ trợ kinh phí thực đề tài giúp đỡ tơi hồn thiện khóa luận Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS Nguyễn Văn Phương, DS Nguyễn Văn Hòa tồn thể thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội, tạo điều kiện cho tơi thực tốt khóa luận Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ, gia đình, bạn bè người ln sát cánh, ủng hộ động viên suốt quãng thời gian làm việc học tập trường đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cám ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Văn Quân MỤC LỤC 1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật chi Balanophora 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm chung chi Balanophora 1.2 Đặc điểm thực vật loài thuộc chi Balanophora Việt Nam 1.3 Thành phần hóa học lồi thuộc chi Balanophora nghiên cứu giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Việt Nam 1.4 Tác dụng sinh học loài thuộc chi Balanophora Việt Nam 1.5 Công dụng số cách dùng loài thuộc chi Balanophora 10 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 13 2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 13 2.3.3 Định tính phương pháp hóa học 14 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ức chế enzym xanthin oxidase in vitro 15 2.3.5 Chiết xuất, phân lập nhận dạng cấu trúc số hợp chất từ loài Balanophora subcupularis P.C Tam 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 19 3.1.1 Đặc điểm thực vật 19 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 20 3.1.3 Đặc điểm bột toàn 21 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 22 3.2.1 Định tính sơ nhóm chất phản ứng hóa học 22 3.2.2 Chuẩn bị phân đoạn từ loài Balanophora subcupularis 26 3.2.3 Triển khai sắc ký lớp mỏng phân đoạn loài B subcupularis 28 3.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase phân đoạn loài B subcupularis 29 3.2.5 Phân lập chất từ loài Balanophora subcupularis 29 3.3 Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B Balanophora MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetat CHCl3 Cloroform CH2Cl2 Dicloromethan H2O Nước XOD Xanthin oxidase SKLM Sắc ký lớp mỏng CC Column chromatography Danh mục bảng Bảng Danh sách loài thuộc chi Balanophora Việt Nam Bảng Kết phản ứng định tính nhóm chất loài B subcupularis 26 Bảng Kết hoạt tính ức chế enzym XOD phân đoạn loài B subcupularis 29 Danh mục hình Hình Đặc điểm hình thái lồi Balanophora subcupularis P.C Tam 19 Hình Vi phẫu củ loài Balanophora subcupularis 20 Hình Một số đặc điểm bột lồi Balanophora subcupularis 21 Hình Sơ đồ chiết xuất loài B subcupularis 27 Hình SKLM dịch tồn phần phân đoạn loài B subcupularis chất đối chiếu quan sát bước sóng λ = 366 nm sau phun thuốc thử NP/PEG 28 Hình Sắc ký đồ chất S1 hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic (5:5:1) ở: 32 Hình Cấu trúc hóa học Coniferaldehyde 33 Hình Sắc ký đồ chất S2 acid gallic với hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic (5:5:1) 34 Hình Cấu trúc hóa học acid gallic 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện Việt Nam, Nấm ngọc cẩu hay gọi Tỏa dương, cu chó… tên gọi chung cho loài thuộc chi Balanophora J.R & G Forst, thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) Các lồi khai thác, bn bán sử dụng với nhiều tác dụng bổ máu, bổ thận, thông tiểu, chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng, tráng dương, giúp phụ nữ phục hồi sức khỏe sau sinh… Số lượng loài Balanophora Việt Nam theo tài liệu có khác biệt: Theo Bertel Hansel (1973) Việt Nam có lồi B laxiflora, B latisepala, B fungosa subsp indica [12]; theo Danh lục loài thực vật Việt Nam GS Nguyễn Tiến Bân có lồi [4] Trong loài thống kê, ba loài B fungosa subsp indica, B latisepala, B laxiflora sử dụng để làm thuốc (theo Từ điển thuốc Việt Nam TS Võ Văn Chi) [5] Tuy nhiên thơng tin khoa học lồi thuộc chi Balanophora J.R.&G Forst Việt Nam tương đối hạn chế Trong đề tài mã số VAST.CTG.04/16-17 Viện sinh thái tài nguyên sinh vật (Viện hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam), nhóm nghiên cứu phát thêm ba loài ghi nhận cho hệ thực vật Việt Nam bao gồm: Balanophora subcupularis P.C Tam, Balanophora harlandii Hook.f Balanophora tobiracola Makino [6] Trong ba loài kể trên, loài Balanophora subcupularis P.C Tam gần chưa có thơng tin khoa học đáng kể Để bổ sung thêm thơng tin thành phần hóa học lồi Việt Nam, chúng tơi tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu đặc điểm hiển vi phân lập số hợp chất từ loài Balanophora subcupularis P.C Tam, họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) dựa định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase” với mục tiêu phân lập số hợp chất từ loài dựa định hướng tác dụng sinh học Đề tài gồm nội dung sau: Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Định tính thành phần hóa học, chiết xuất phân đoạn đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro phân đoạn mẫu nghiên cứu Phân lập số hợp chất từ loài phân đoạn thể tác dụng mạnh Chương TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại đặc điểm thực vật chi Balanophora 1.1.1 Vị trí phân loại Theo Thực vật hiển hoa Takhtajan 2009 [25], chi Dó đất (Balanophora J.R.&G.Forst) 16 chi họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) Vị trí phân loại họ Dó đất hệ thống phân loại sau: Giới thực vật: Plantae Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta Bộ Dương Đài: Balanophorales Họ Dó Đất: Balanophoraceae Thế giới họ Dó đất có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới châu Á châu Đại Dương chi Balanophora chiếm gần nửa số loài họ với khoảng 19 loài ghi nhận đến thời điểm [20] Ở Việt Nam, chi Dó đất hai lồi thuộc họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.) bao gồm chi Dó đất (Balanophora Forst & Forst.f.) với lồi chi Dó đất núi cao (Rhopalocnemis Jungh.) với loài, phân bố rải rác số tỉnh Việt Nam [4] 1.1.2 Đặc điểm chung chi Balanophora Chi Balanophora, họ Dó đất (Balanophoraceae) Cây thảo, nạc mềm, nom nấm, màu đỏ nâu, sống hay nhiều năm, kí sinh rễ khác, thường gỗ lớn rừng sâu Thân thối hóa thành củ ngun phân nhánh, có nhiều hình dạng khác nhau, sần sùi, khơng có Hoa đơn tính gốc khác gốc, mọc thành cụm lớn Cụm hoa đực hình trụ, dài 10 – 15 cm, gốc có vài bắc; bao hoa xẻ nhiều thùy (4 – 7) dày hẹp, dài nhau, nhị thường có bao phấn hình móng ngựa; cụm hoa hình thoi hình trứng, dài – cm, khơng có bao hoa, cụm hoa có nhiều phần phụ hình chùy khơng sinh sản ống có sắc ký đồ Tiến hành để bay dung môi, sấy khô thu chất màu trắng, ký hiệu S2 Cao EtOAc (1,8 g) Silicagel Hệ CH2Cl2 - MeOH BSE1 (4g) BSE2 CC, Silicagel Hệ CH2Cl2 BSE3 BSE4 o EtOAc (4g) BSE5 BSE6 CC, Silicagel Hệ MeOH: CH2Cl2 S1 S2 3.2.5.2 Biện giải cấu trúc phân lập a Chất S1 Tính chất : tinh thể hình kim, màu vàng nhạt Xuất vết SKLM bước sóng λ = 254 nm, λ = 366 nm phun thuốc thử vanilin/Ethanol/H2SO4 31 a b Hình Sắc ký đồ chất S1 hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic (5:5:1) ở: a 366 nm b Phun thuốc thử màu Vanilin/Ethanol/H2SO4 Chất S1 đem đo phổ MS để xác định khối lượng phân tử, phổ khối MH = 177,01 (phụ lục 2) H NMR (500 MHz, MeOD): δ7,47 (1H,s,H-2), 6,97 (1H,d, J = Hz, H-5), 7.13 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6), 7.41 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7), 6.62 (1H, dd, J = 7.5, 15.5 Hz, H-8), 9.66 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-9), 2.35 (3H, OCH3) Phổ 1H-NMR S1 cho tín hiệu nhóm methoxy δ2.35 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX δ7,47 (1H,s,H-2), 6,97 (1H,d, J = Hz, H5) 7.13 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6) Trên phổ 1H-NMR S1 cho thấy xuất tín hiệu nhóm CHO δ9.66 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-9) tín hiệu proton olefin δ7.41 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7), 6.62 (1H, dd, J = 7.5, 15.5 Hz, H-8) (phụ lục 3) 32 Dựa vào giá trị số tương tác spin-spin H-7/H-8 chúng tơi có kết luận mạch nhánh có nối đơi đồng phân hình học trans Kết hợp với liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo cho phép kết luận hợp chất S1 Coniferaldehyde [(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-cinnamaldehyd)] [20] HO H 3C O O Hình Cấu trúc hóa học Coniferaldehyde b Chất S2 Tính chất: S2 thu dạng bột màu trắng ngà S2 đem đo phổ MS để xác định khối lượng phân tử, phổ khối thu cho pic phân tử [M-H]- = 168,96 (Phụ lục 4) Đem chấm sắc ký thấy xuất huỳnh quang sáng SKLM bước sóng λ = 254 nm λ = 366 nm sau phun thuốc thử NP So sánh với Acid gallic đối chiếu ta thấy hai vết có giá trị Rf màu sắc huỳnh quang tương đồng (trị số Rf = 0,48) 33 a b c Hình Sắc ký đồ chất S2 acid gallic với hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic (5:5:1) ở: a Bước sóng 254 nm trước phun thuốc thử NP b Ánh sáng thường sau phun thuốc thử NP c Bước sóng 366 nm sau phu thuốc thử NP  Kết luận sợ S2 Acid gallic với cấu trúc hóa học hình Hình Cấu trúc hóa học acid gallic 34 3.3 Bàn luận 3.3.1 Về thực vật: Loài Balanophora subcupularis loài ghi nhận Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu Việt Nam giới loài Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu, mơ tả đặc điểm vi phẫu củ bột loài Kết nghiên cứu thực vật giúp xác định tính mẫu nghiên cứu 3.3.2 Về hóa học: Các nhóm chất hóa học đặc trưng loài gần giống với loài khác nghiên cứu trước có flavonoid, tanin, acid hữu cơ, sterol, carotenoid, chất béo Ngoài ra, từ SKLM ta thấy phân đoạn EtOAc có nhiều vết huỳnh quang sáng hợp chất phenolic tập trung chủ yếu phân đoạn Điều tạo sở tiến hành phân lập chất từ phân đoạn EtOAc 3.3.3 Về đánh giá hoạt tính sinh học: Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym XO phân đoạn n-hexan, ethyl acetat nước cho thấy phân đoạn EtOAc có hoạt tính ức chế enzym XO in vitro tốt Đây sở cho việc lựa chọn phân đoạn Ethylacetat để phân lập hợp chất từ lồi B subcupularis với mục đích tìm hợp chất có hoạt tính ức chế XO từ phân đoạn 3.3.4 Về phân lập chất: Phân đoạn EtOAc phân lập hai hợp chất S1 S2 Hợp chất S1 có liệu phổ 1H-NMR phổ khối tương đồng với hợp chất Coniferaldehyd, kết luận S1 Coniferaldehyd Hợp chất S2 có giá trị Rf tương ứng với hợp chất acid gallic (trị số Rf = 0,48), có phổ khồi lượng phân tử tương ứng với hợp chất acid gallic nên kết luận sơ hợp chất S2 acid gallic Cả hai hợp chất phân lập từ số loài chi, nhiên lần phân lập từ loài Balanophora subcupularis P.C.Tam 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận: Đề tài nghiên cứu dược liệu Balanophora subcupularis P C Tam sơ giải mục tiêu đề với kết cụ thể sau:  Về mặt thực vật: Xác định tên loài, đặc điểm loài chụp ảnh số đặc điểm vi học dược liệu, vi phẫu củ bột dược liệu  Về mặt hóa học: Sơ định tính nhóm chất có cây, nhóm chất xác định bao gồm: flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, sterol, anthranoid, carotenoid, chất béo  Về tác dụng sinh học: Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym XO tốt phân đoạn EtOAc lồi Từ làm sở để phân lập chất phân đoạn EtOAc  Về phân lập chất: Đã phân lập S1 S2 từ phân đoạn EtOAc Chất S1 xác định coniferaldehyd S2 xác định acid gallic  Kiến nghị: Sau thực xong đề tài, vài khó khăn q trình nghiên cứu thời gian thực nghiên cứu có hạn nên chúng tơi có số kiến nghị:  Tiếp tục nghiên cứu phân lập thêm chất tinh khiết phân đoạn EtOAc, phân đoạn n-hexan phân đoạn nước  Nghiên cứu thêm tác dụng khác loài tác dụng chống viêm tác dụng dọn gốc tự 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Hồng Anh, Đỗ Thị Hà, et al (2017), "Các hợp chất phenolic phân lập từ cặn ethyl acetat tỏa dương", Tạp chí Dược Liệu, 22 (1), pp 29-33 Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thị Hồng Anh, et al (2017), "Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric tỏa dương động vật thực nghiệm", Tạp chí Dược liệu, 22(1), pp 51-54 Nguyễn Thị Hồng Anh, Đỗ Thị Hà, et al (2017), "Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro phân đoạn hợp chất phân lập từ tỏa dương", Tạp chí dược liệu, 22(4), pp 230-234 Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh lục loài thực vật Việt Nam, pp 9- 10 Chi Võ Văn Từ điển thuốc Việt Nam pp Nguyễn Quang Hưng "Nghiên cứu sở khoa học cho việc sử dụng bảo tồn số lồi họ Dó đất (Balanophoraceae L.C & A Rich.) Việt Nam", mã số: VAST.CTG.04/16-17, TS Nguyễn Quang Hưng làm chủ nhiệm, pp Nguyễn Thanh Hương, Phan Anh Tuấn, et al (2015), "Nghiên cứu hoạt tính androgen cao lỏng Toả dương (Balanophora laxiflora) chuột đực", Tạp chí nghiên cứu Y học, (số 4), pp Nguyễn Thanh Hương, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, et al (2016), "Đánh giá ảnh hưởng cao chiết nước tỏa dương lên hành vi tình dục chuột cống đực trưởng thành", Tạp chí nghiên cứu Y học, 100(2), pp 5057 Huy Phạm Quang (2015), Đánh giá hoạt tính androgen ảnh hưởng cao Toả dương tới hành vi tình dục thực nghiệm, pp 10 Cầm Thị Ích, Nguyễn Thị Hồng Vân, et al (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết ethyl acetat tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) Việt Nam", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(5A), pp 96100 11 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam 2004 p 114 12 thuật NXB Khoa học Kỹ Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam pp 13 Thân Nguyễn Viết Cây thuốc Viêt Nam thuốc thường dùng Nhà xuất y học, pp 92 14 Nguyễn Quyết Tiến (2017), "Thành phần hóa học Ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) thu Tuyên Quang", Tạp chí khoa học, 55 (1), pp 48-51 15 Tường Nguyễn Văn (2014), Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học nấm toả dương (Balanophora laxiflora Hemsl.), pp  Tài liệu Tiếng Anh 16 Dai Z Wang GL, et al (2005), "Chemical constituents from Balanophora simaoensis (I)", Chin Tradit Herb Drugs, 36, pp 830-831 17 Falshaw CP Ollis WD, et al (1969), "The spectroscopic identification of coniferin", Phytochemistry, 8(5), pp 913-915 18 Ha D.T., Thu NT "Triterpenoids from Balanophora laxiflora Hemsl.", Journal of medicineal Materials, pp 19 Kazuyoshi Yagishita (1956), "Isolation and Identification of Taraxasterol and β-Amyrin from the Bird-lime of Balanophora japonica Makino", Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 20(4), pp 206-210 20 Lai-King Sy Geoffrey D.Brown (1999), "Coniferaldehyde derivatives from tissue culture of Artemisia annua and Tanacetum parthenium ", Phytochemistry, 1999, 50, pp 781-785 21 Li Fang Li XM, et al (2010), "Chemical constituents of marine mangrove plant Bruguiera gymnorrhiza", Marine Sciences, (10), pp 22 Pan Jianyu Zhang Si, et al (2008), "Separation of flavanone enantiomers and flavanone glucoside diastereomers from Balanophora involucrata Hook f by capillary electrophoresis and reversed-phase high-performance liquid chromatography on a C18 column", Journal of Chromatography A, 1185(1), pp 117-129 23 Quang D.N So T.C., et al (2018), "Balanochalcone, a new chalcone from Balanophora laxiflora Hemsl", Natural Product Research, 32(7), pp 767772 24 She Gai‐Mei Zhang Ying‐Jun, et al (2009), "Phenolic Constituents from Balanophora laxiflora with DPPH Radical‐Scavenging Activity", Chemistry & biodiversity, 6(6), pp 875-880 25 Takhtajan (2009), flowering plants, pp 427 26 Tanaka Takashi Uehara Rami, et al (2005), "Galloyl, caffeoyl and hexahydroxydiphenoyl esters of dihydrochalcone glucosides from Balanophora tobiracola", Phytochemistry, 66(6), pp 675-681 27 Wang Kai‐Jin Zhang Ying‐Jun, et al (2006), "A new hydrolyzable tannin from Balanophora harlandii with radical‐scavenging activity", elvetica Chimica Acta, 92(9), pp 1817-1822 28 Yadagiri B Raj K, et al (1984), "Triterpenoids from Balanophora abbreviata and Balanophora indica", Journal of natural products, 47(1), pp 182 29 Zhou Tong Zhang Xiao-hui, et al (2011), "New phenylpropanoids and in vitro α-glucosidase inhibitors from Balanophora japonica", Planta medica, 77(05), pp 477-481 30 Noro Tadataka, ODA YASUSHI, et al (1983), "Inhibitors of xanthine oxidase from the flowers and buds of Daphne genkwa", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 31(11), pp 3984-3987 Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học thực vật Phụ lục 2: Phổ khối (MS) S1 Phụ lục 3: Phổ 1H – NMR chất S1 Phụ lục 3: Phổ 1H – NMR chất S1 (tiếp) Phụ lục 3: Phổ 1H – NMR chất S1 (tiếp) Phụ lục 4: Phổ khối (MS) S2 ... thực vật - Mẫu dược liệu tươi (có đủ tiêu chuẩn dể định lồi gồm có: quan sinh sản, quan sinh dưỡng thông tin ghi chép thực địa) - Quan sát, mô tả sơ - Giám định tên khoa học tư vấn chuyên gia Bảo... quanh gỗ (5) phía Các tế bào mơ mềm bao quanh bó libe-gỗ (4) bắt màu xanh, tạo thành vòng rõ Hình Vi phẫu củ loài Balanophora subcupularis Tế bào kiểu biểu bì, Mơ mềm, Khối nhựa, Tế bào bao quanh... nhuộm tẩy, tiến hành quan sát hình ảnh vi phẫu kính hiển vi, chụp ảnh  Đặc điểm bột: Toàn sau thu tiền hành phơi sấy khơ sau nghiền thành bột cối sứ, rây qua rây thu bột mịn Quan sát kính hiển