Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase và an pha glucosidase của lá dâu tằm bằng mô phỏng tương tác kết hợp thực nghiệm in vitro

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LẠI THÁI HUY NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA LÁ DÂU TẰM BẰNG MÔ PHỎNG TƯƠNG TÁC KẾT HỢP THỰC NGHIỆM IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LẠI THÁI HUY Mã sinh viên: 1501216 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE VÀ α-GLUCOSIDASE CỦA LÁ DÂU TẰM BẰNG MÔ PHỎNG TƯƠNG TÁC KẾT HỢP THỰC NGHIỆM IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.Ths Nguyễn Văn Phương 2.Ths Thân Thị Kiều My Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô, anh chị, bạn em sinh viên Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thu Hằng, Ths Nguyễn Văn Phương, Ths Thân Thị Kiều My, nhà giáo giành thời gian, tâm huyết bảo thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên môn Dược liệu, ThS Nghiêm Đức Trọng - Bộ môn Thực vật trường Đại Học Dược Hà Nội nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên, tạo điều kiện giúp đỡ thời gian qua Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè – người ln gắn bó, ủng hộ khích lệ tơi trong suốt trình học tập trường thời gian thực khóa luận Cuối xin kính chúc thầy ln mạnh khỏe, hạnh phúc gặt hái nhiều thành công công việc sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Lại Thái Huy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dâu tằm 1.1.1 Vị trí phân loại dâu tằm 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố dâu tằm 1.1.3 Thành phần hóa học dâu tằm 1.1.4 Tác dụng sinh học dâu tằm 1.1.5 Công dụng dâu tằm 10 1.2 Tổng quan phương pháp mô tương tác 10 1.2.1 Khái niệm 10 1.2.2 Nguyên tắc 11 1.2.3 Các bước tiến hành 11 1.2.4 Đánh giá kết 12 1.2.5 Ứng dụng .12 1.2.6 Ưu, nhược điểm 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Hóa chất, dung môi 15 2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ phần mềm 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Chiết xuất 16 2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm 16 2.3.3 Sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase hợp chất ức chế α-glucosidase phương pháp mô tương tác 18 2.3.4 Định lượng flavonoid toàn phần cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Chiết xuất 20 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm 21 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro 21 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro 22 3.3 Kết sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase hợp chất ức chế α-glucosidase dâu tằm phương pháp mô tương tác 22 3.3.1 Kết thẩm định phương pháp mô tương tác 22 3.3.2 Kết sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase dâu tằm 23 3.3.3 Kết sàng lọc hợp chất ức chế α-glucosidase dâu tằm .27 3.4 Định lượng flavonoid toàn phần cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm 31 3.4.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng 32 3.4.2 Kết định lượng flavonoid toàn phần cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết dâu tằm 36 3.5 Bàn luận 36 3.5.1 Về tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm 36 3.5.2 Sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase hợp chất ức chế α-glucosidase phương pháp mô tương tác 37 3.5.3 Về vai trò hợp chất flavonoid tác dụng ức chế xanthin oxidase dâu tằm 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DNJ – deoxynojirimycin DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ALT alanin aminotransferase AST aspartat aminotransferase CTCT Công thức cấu tạo DMSO Dimethyl sulfoxide Kd Hằng số liên kết IC50 The half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế 50%) LOD Limit of Detection (giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantification (giới hạn định lượng) Elk Năng lượng liên kết ΔGL Năng lượng tự Gibbs PĐ Phân đoạn RSD Relative Standard Deviation (độ lệch chuẩn tương đối) RMSD Root Mean Square Deviation (độ lệch trung bình khoảng cách nguyên tử tương ứng phối tử) SD Standard Deviation (độ lệch chuẩn) TLTK Tài liệu tham khảo R% Tỷ lệ thu hồi XO Xanthin oxidase DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các hợp chất flavonoid dâu tằm 1.2 Các hợp chất coumarin có dâu tằm 1.3 Các hợp chất aryl benzofuran có dâu tằm 1.4 Các hợp chất khác dâu tằm 3.1 Kết khối lượng cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết 21 từ dâu tằm 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro cao 21 ethanol cắn phân đoạn dịch chiết dâu tằm 3.3 Kết đánh giá tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao 22 ethanol cắn phân đoạn dịch chiết dâu tằm 3.4 Kết mô tương tác 50 phân tử với enzym XO 23 3.5 Kết mô tương tác 50 phân tử với enzym 28 α-glucosidase 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 33 3.7 Kết khảo sát độ phương pháp 35 3.8 Kết định lượng flavonoid toàn phần cao ethanol cắn 36 phân đoạn nước, ethyl acetat DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 2.1 Ảnh chụp toàn cành mang hoa dâu tằm thực địa 14 2.2 Sơ đồ tóm tắt bước định lượng flavonoid toàn phần cao 19 ethanol cắn phân đoạn dịch chiết dâu tằm 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất ethanol toàn phần phân 20 đoạn dịch chiết dâu tằm 3.2 Kết thẩm định phương pháp mô tương tác 23 3.3 Tương tác 2D quercetin số hợp chất với enzym 27 xanthin oxidase 3.4 Tương tác 2D acarbose quercetin 3- (6’-malonylglucosid) 31 với enzym α-glucosidase 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan độ hấp thụ nồng độ quercetin 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Dâu tằm (Morus alba L.) loại trồng phổ biến nhiều nơi để làm thức ăn cho tằm, lấy làm thuốc Các phận dâu tằm (tang diệp), (tang thầm), cành (tang chi), vỏ rễ (tang bạch bì) vị thuốc có giá trị y học cổ truyền, dùng để chữa đau đầu, hoa mắt chóng mặt, cao huyết áp, ho hen, đau nhức xương khớp, phù thũng, bụng trướng, mắt có màng,…[4], [6] Một số nghiên cứu giới dâu tằm có tác dụng hạ acid uric động vật thực nghiệm theo chế ức chế enzym xanthin oxidase [24] Bên cạnh đó, dâu tằm chứng minh khả hạ đường huyết chuột [20] số chế hạ đường huyết dâu tằm ức chế α-glucosidase Thành phần hóa học dâu tằm gồm flavonoid [16], coumarin [1], aryl benzofuran [51] số nhóm hợp chất khác Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sàng lọc hợp chất dâu tằm có liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase dâu tằm Mô tương tác hay cịn gọi docking phân tử cơng cụ quan trọng lĩnh vực sinh học cấu trúc phân tử thiết kế thuốc dựa hỗ trợ máy tính Phương pháp cho phép dự đốn tác dụng hợp chất mà không cần tiến hành thực nghiệm, giúp tiết kiệm đáng kể thời gian, công sức đạt hiệu kinh tế cao nghiên cứu phát triển thuốc [38] Tuy nhiên, phương pháp mô tương tác chưa ứng dụng rộng rãi nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu Đặc biệt, chưa có nghiên cứu áp dụng mô tương tác để xác định hợp chất liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase dâu tằm Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế xanthin oxidase α-glucosidase dâu tằm mô tương tác kết hợp thực nghiệm in vitro” thực với mục tiêu: Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm Sàng lọc hợp chất ức chế xanthin oxidase hợp chất ức chế α-glucosidase dâu tằm phương pháp mô tương tác Định lượng nhóm hợp chất liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase tác dụng ức chế α-glucosidase cao ethanol cắn phân đoạn dịch chiết từ dâu tằm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dâu tằm Tên khoa học dâu tằm: Morus alba L., họ Dâu tằm (Moraceae) [6] Tên tiếng Việt: Dâu tằm, mạy môn, dâu cang, tầm tang [6] Tên tiếng Anh: Mulberry 1.1.1 Vị trí phân loại dâu tằm Theo hệ thống phân loại tác giả Takhtajan (2009) [46], loài Morus alba L có vị trí phân loại sau: Giới - Plantae (Thực vật); Ngành - Magnoliophyta (Ngọc lan); Lớp - Magnoliopsida (Ngọc lan); Phân lớp - Dilleniidae (Sổ); Bộ - Urticales (Gai); Họ - Moraceae (Dâu tằm); Chi - Morus (Dâu tằm); Loài - Morus alba L (Dâu tằm) 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố dâu tằm Cây bụi, cao khoảng 3-10 m Cành có lơng mịn, chồi mọc vào mùa đơng, màu đỏ nâu, hình trứng, có lơng mịn Lá kèm hình mũi mác, dài 2-3,5 cm, có lơng ngắn [14] Lá mọc so le [6], cuống dài 1,5-5,5 cm, có lơng, phiến có hình bầu dục hình trứng rộng [14]; mép có cưa, có chia thùy [6], [14] Hoa đực có đài, mọc thành dạng bơng [6], [14] dài 2-3,5 cm; có lơng dày màu trắng; có đài màu xanh nhạt, hình elip rộng, nhị hướng [14] Hoa dài 1-2 cm, có lơng mịn, cuống dài 5-10 mm, có lơng [14]; khơng cuống, cánh hoa hình trứng, bầu nhụy khơng cuống, vỏ thân có nốt sần, cành phân nhánh [14] Quả non màu xanh trắng đỏ, chín chuyển sang màu đen tím, mùa từ tháng đến tháng [14] Cây dâu tằm có nguồn gốc Trung Quốc, di thực trồng nhiều nơi Việt Nam [6] 1.1.3 Thành phần hóa học dâu tằm Thành phần hóa học dâu tằm gồm nhóm chính: flavonoid, coumarin, aryl benzofuran số hợp chất khác 1.1.3.1 Flavonoid Căn vào cấu trúc hóa học, hợp chất flavonoid dâu tằm chia thành nhóm bao gồm flavon (1-12), flavonol (13 - 17), flavanon (18, 19), flavan (20 -25) chalcon (26 - 28) Cấu trúc hợp chất trình bảng 1.1 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp Mẫu Khối lượng cao (g) Độ hấp thụ 0,0111 0,0111 0,0111 0,0111 0,0104 0,0108 0,268 0,263 0,260 0,256 0,242 0,253 3,573 3,507 3,468 3,415 3,448 3,469 Hàm lượng flavonoid cao (mg/g) Trung bình 3,480 RSD 1,57% Nhận xét: Kết bảng 3.6 cho thấy phương pháp định lượng đảm bảo yêu cầu độ lặp lại với RSD = 1,57% - nằm giới hạn yêu cầu (