Nghiên cứu sản xuất HTKN RCN đa giá f(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo WHO ước tính, năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (2% dân số) [40], máu toàn phần chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, phải kể đến chế phẩm huyết như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152] đó, huyết kháng nọc rắn (antivenom) loại chế phẩm quan trọng, đặc biệt điều trị rối loạn đông cầm máu nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi đất nơng nghiệp, bờ biển dài 3000 km, Việt Nam có mơi trường thuận lợi cho rắn độc phát triển Mặt khác, phần lớn cư dân sinh sống, làm việc môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy bị rắn độc cắn cao (> 30.000 người /năm [21]); ngồi tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng phải truyền hàng chục lít máu huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai phải truyền ≈ 46 lít máu chế phẩm để cứu người bệnh [174] Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu huyết tương phải sử dụng điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế quan tâm đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đến nay, có số nghiên cứu thành cơng, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23] Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; có hai loại HTKNR cho rắn hổ đất rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho quốc gia (khuyến cáo WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt HTKNR cho loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; lồi đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) Việt Nam, loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong cao (> 80% không cấp cứu điều trị kịp thời) [14] Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn Việt Nam từ trước đến cho thấy: nước ta có hai lồi rắn cạp nia thường gặp chủ yếu rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” giống nhau, thống nhìn khó phân biệt Hai lồi rắn khác độc tính nọc biểu lâm sàng, chẩn đoán dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu khơng có tác dụng chéo chưa có VDK để chẩn đốn xác định [15] Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho hai loài rắn độc nguy hiểm nói giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn nước Để tăng tính an toàn chế phẩm, dạng F(ab’) tối ưu, đồng thời phải áp dụng giải pháp kỹ thuật kiểm sốt chất lượng tồn diện để chế phẩm đạt Tiêu chuẩn Quốc gia HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9] Với lý trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm” thực hiện, nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’) từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia Đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG 1.1.1 Máu: - Khái niệm: máu mô lỏng màu đỏ lưu thơng hệ thống tuần hồn; tạo thành từ tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước - Đặc điểm: máu chiếm 1/13 trọng lượng thể (60-70 ml/kg); thể tích nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31] - Máu động vật có vú gồm HC, BC, TC huyết tương, với chức cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ thể, tương tự người 1.1.2 Huyết tương: - Khái niệm: phần dịch lỏng thu sau ly tâm để lắng tự nhiên máu toàn phần chống đông - Thành phần chủ yếu nước (92%), chứa protein hòa tan (tức làalbumin, globulin fibrinogen), protein phân tử, đường, yếu tố đông máu, chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide [31],[167] - Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, yếu tố đông máu, yếu tố enzyme, protein liên kết với lipid, protein vận chuyển Các thành phần thay đổi bệnh lý Điện di protein, điện di miễn dịch tách thành phần protein Mỗi protein huyết tương có điểm đẳng điện tương ứng với pH Tính hịa tan protein chịu ảnh hưởng nhiệt độ tính hòa tan dung dịch muối Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hịa tan thay đổi, tính chất sinh học đi; yếu tố gây biến tính protein gồm: nhiệt độ, độ acid base, tia cực tím làm đứt gãy liên kết peptid, sóng siêu âm gây oxy hóa [31],[163] 1.2 CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG 1.2.1 Máu toàn phần: - Lấy từ mạch máu người cho, động vật cho máu, bảo quản túi (chai) có chất chống đông bảo quản máu Dung dịch bảo quản máu thông thường CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin Mỗi đơn vị 250 ml máu người cho khỏe mạnh có 30-40 gam hemoglobin [31],[170] - Bảo quản máu tồn phần 2-6oC, thời gian bảo quản tối đa 42 ngày (với dung dịch bảo quản CPDA) Máu tồn phần lưu trữ chứa thành phần hồng cầu, thu nhận cịn có tiểu cầu số yếu tố đông máu Bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ giải phóng chất trung gian; ngồi cịn chứa tế bào lympho yếu tố huyết tương - Khi sản xuất HTKNR, lấy máu túi 450 ml, túi đôi để dễ sản xuất, đảm bảo vơ trùng an tồn, khơng gây vỡ HC vận chuyển 1.2.2 Khối hồng cầu [31],[170]: - Là máu toàn phần ly tâm tách phần huyết tương sang túi khác Tuỳ cách sản xuất mà có loại khối hồng cầu sau: + Khối hồng cầu đậm đặc: khối hồng cầu có hematocrit khoảng 75% Thành phần có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết tương Bảo quản: 26°C Chế phẩm có tính chất đậm đặc nên phải truyền chậm + Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: sau tách huyết tương khỏi hồng cầu, trả lại dung dịch bảo quản Thành phần: hồng cầu dung dịch bảo quản, cịn bạch cầu Lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần Bảo quản: 2-6°C thời gian 42 ngày + Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: máu toàn phần tách huyết tương phần Buffy coast Thành phần: hồng cầu + bạch cầu loại bỏ khoảng 10% so với khối hồng cầu thông thường Ưu điểm: giảm phản ứng bạch cầu, giảm nguy lây bệnh mà tác nhân cư trú bạch cầu + Khối hồng cầu rửa: máu toàn phần khối hồng cầu, ly tâm bỏ hết huyết tương thay nước muối sinh lý, trộn ly tâm tiếp để rửa ba lần Thành phần: hồng cầu + nước muối sinhh lý Bảo quản: 2oC-6°C 24 giờ, 22°C + Khối hồng cầu lọc bạch cầu khối hồng cầu chiếu xạ: khối hồng cầu dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hai Bảo quản: 2-6°C hai tuần từ chiếu xạ, dùng màng lọc rời sau lọc khơng để 24 Thành phần: hồng cầu, bạch cầu lại ít, bạch cầu bị bất hoạt * Như vậy: sau tách huyết tương, tùy điều kiện nhu cầu truyền trả khối HC ngựa sớm hay muộn để định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi dưỡng HC phương pháp bảo quản, vận chuyển đường đến nơi truyền trả khối HC ngựa Nếu lấy máu ngựa vào túi 450ml, việc truyền khối HC trở lên đơn giản lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít) 1.2.3 Khối tiểu cầu: + Khối tiểu cầu tách từ máu toàn phần: ly tâm túi máu toàn phần, gạn lấy lớp Buffy coast ly tâm tách lấy tiểu cầu Thường từ 3-4 đơn vị máu tồn phần nhóm ABO sản xuất đơn vị pool tiểu cầu Bảo quản: chưa pool, để 22°C, lắc liên tục 3-5 ngày Nếu pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 Số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011 + Khối tiểu cầu tách chiết: dùng máy tách tế bào với kit chuyên dụng để lấy tiểu cầu từ người cho Thành phần: có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/ đơn vị, có bạch cầu + Bảo quản: 22°C máy lắc liên tục, tối đa ngày 1.2.4 Huyết tương tươi đông lạnh: - Huyết tương tách từ máu toàn phần kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh gọi huyết tương tươi đông lạnh - Thành phần: albumin, globulin miễn dịch, yếu tố đông máu bền vững, yếu tố VIII khoảng 70% Lượng huyết tương tách từ đơn vị máu (250 ml) có khoảng 125-150ml Thường pool lượng huyết tương tươi hai đơn vị máu tồn phần nhóm, dung tích khoảng 250-300ml Bảo quản: - 25°C/năm, ≤ - 25°C hai năm [31],[170] - Khi sản xuất HTKNR, không cần sử dụng huyết tương tươi đơng lạnh máu ngựa khơng cần sử dụng yếu tố đông máu Nếu cần bảo quản để sản xuất nhiều đợt thời điểm khác nhau, cần bảo quản nhiệt độ ≤ - 25°C 1.2.5 Tủa VIII (cryo): - Để huyết tương tươi đông lạnh 4°C, huyết tương tan có phần tủa, ly tâm thu nhận tủa cryo Thành phần: tủa VIII khoảng - đơn vị/ml, yếu tố V, fibrinogen - Trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn trọng lượng phân tử IgG (150 kD) [16] tách ta phương pháp tủa Cohn Fraction I, loại bỏ phần tách γ-globulin khơng cần thiết sử dụng 1.2.6 Huyết tương tươi tách tủa: - Phần huyết tương tách sau lấy tủa huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản -25°C Thành phần gồm có: albumin, globulin, số yếu tố đông máu Nếu sản xuất HTKNR theo phương pháp Cohn, phần cần thiết giữ lại để sản xuất có γ -globulin - Bảo quản huyết tương tươi đông lạnh 1.2.7 Huyết tương đông lạnh: - Thành phần: yếu tố huyết tương, yếu tố đông máu khơng bền vững cịn lại Đây huyết tương tách từ máu toàn phần sau kể từ lấy máu bảo quản - 25°C Bảo quản: huyết tương tươi đông lạnh - Chủ yếu tách huyết tương để sản xuất HTKNR theo dạng chế phẩm 1.2.8 Khối bạch cầu hạt: - Tách từ phần Buffy-coast pool nhiều người cho máu Thành phần: chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu số tế bào lympho, chất bạch cầu giải phóng Khối bạch cầu hạt tập hợp từ nhiều người nguy nhiễm virus cao - Bảo quản: 22°C ≤ 24 - Trong sản xuất HTKNR, cần tách huyết tương, cần để lại phần bạch cầu tiểu cầu với khối HC Chú ý truyền lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục 1.2.9 Albumin: - Albumin protein hình cầu, tính hịa tan cao, trọng lượng phân tử 66.500 Da, chiếm nhiều huyết thanh; chức trì 70 - 80% áp lực keo huyết tương liên kết, vận chuyển chất có phân tử nhỏ bilirubin, hormon, steroid, acid béo, phân tử thuốc Dung dịch albumin điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 - 20% protein tồn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa 5% protein [163] - Do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm theo phương pháp tủa Cohn thu albumin Fraction V, phần tủa Cohn cuối - Khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ Theo tiêu chuẩn tinh protein dược điển Việt Nam III-2002, albumin phép dạng vết, phát điện di miễn dịch [7] 1.2.10 Gamma globulin: Hình 1.1 Hình ảnh điện di protein huyết - Gamma globulin (-globulin) lớp globulin, xác định điện di protein huyết Có năm lớp -globulin IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; chiếm tỷ lệ nhiều IgG, sau IgM; IgD, IgA, IgE chiếm - Năm 1940, -globulin tách chiết lần đầu tiên; khơng lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IMIG) đưa vào sử dụng, tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -globulin huyết (1950) - Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IVIG) sản xuất đưa vào sử dụng năm 1970, đau, tác dụng nhanh IMIG - Năm 1981, Gamimune Mile phân lập, IVIG đăng ký Mỹ, Sandoglobulin hãng Sandoz có thị trường năm 1984 Gamimune chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986 sản phẩm đổi tên thành Gamimuner N Sau đó, số IVIG khác đăng ký Mỹ: Gammagard Hyland, Polygam hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam Immuno, Venoglobulin-I Alpha Therapeutic, Gammar-IV Armor GammaRaas RAAS (Mỹ) [167] - Năm 1991, IVIG sản phẩm dạng bột hoà tan lần chấp nhận (Venoglobulin-S) Năm 1994, sau vụ dịch viêm gan C liên quan đến Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột khơng hồ tan Gammagard Polygam bị đình - Năm 1980, bệnh nhân dùng IVIG điều trị giảm -globulin huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy tăng số lượng tiểu cầu Tiếp theo phát ngẫu nhiên này, việc sử dụng IVIG cho ITP nghiên cứu dùng cho định Kể từ IVIG có hiệu ITP, chúng tiếp tục đánh giá điều trị bệnh khác với giả định chế tự miễn Hầu hết sử dụng IVIG bệnh tự miễn có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre Các định -globulin thừa nhận gồm: suy giảm miễn dịch tiên phát, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực ghép tuỷ xương - Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IVIG) chế phẩm có 95% IgG từ huyết tương người hiến máu tinh chế IGIM chứa 15-18% protein, IgG chiếm 90% IGIM dung dịch suốt đục, có màu vàng nhạt nâu nhạt Cả hai loại dung dịch vô khuẩn, không chứa chất gây sốt, gồm globin chứa nhiều loại kháng thể có mặt máu người bình thường, pH 6,4 - 7,2 với thimerosal chất bảo quản - Sau tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết đạt đỉnh ngày IgG có IGIM phân bổ nhanh ngang khu vực mạch máu Ở người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy IgG khoảng 23 ngày Khi liều tiêm IGIM lớn 10 ml phải 10 chia thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhằm làm giảm đau chỗ bớt khó chịu Tổng liều lần tiêm bắp thịt không vượt 20 ml (ngay người lớn) Bảo quản nhiệt độ lạnh từ 2-8oC không để đông băng Thời hạn dùng IGIM không năm kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) nhà sản xuất [31],[123] Bảng 1.1 Các thành phần protein huyết tương: Globulins Albumins α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol α-globulins binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin, haptoglobin hormone, binding globulin, transferrin, β-globulins angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor H, plasminogen, properdin -globulin Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) Loại khác Lòng trắng trứng Serum albumin Fibronectin, macroglobulin/microglobulin, Transcobalamin Loại khác C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin, ricin Conalbumin, ovalbumin, avidin Human serum albumin, bovine serum albumin, prealbumin 1.2.11 Kháng huyết (KHT): - Khái niệm: kháng huyết sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có khả trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu từ huyết tương động vật huyết tương người, mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định loại bỏ protein không cần thiết [7],[9] - Một số KHT nghiên cứu, sử dụng Huyết học-Truyền máu: ... ? ?Nghiên cứu sản xuất HTKN- RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm phịng thí nghiệm? ?? thực hiện, nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu sản xuất HTKN- RCN đa giá F(ab’) từ huyết. .. đoán (Coombs test), sản xuất từ huyết tương thỏ, ngựa [22] - Hiện lượng KHT thiếu hụt nước nghèo nhà sản xuất sản xuất KHT từ huyết tương người từ ngựa tinh chế hai bước, an toàn giá thành tăng lên... nhà sản xuất KHT mong đợi hỗ trợ ngân sách từ tổ chức quốc tế, phủ tổ chức từ thiện để trì số lượng, chất lượng sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149] 1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG: