Nghiên cứu và sản xuất Huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab')2 từ huyết tương ngựa
MỤC LỤC
Phương pháp tủa bằng muối
Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. Tóm lại: sản xuất γ - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác.
HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN
Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32]. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:. Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫn cảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh. Để chế tạo được kháng nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc cần sản xuất HTKNR. Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại đúng loài rắn cần nghiên cứu. Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽ không có tác dụng. Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc tính di truyền từng loài rắn. Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao. Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần. Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn máu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC. Chế tạo kháng nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc. Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ.. có thể gây hủy hoại hoàn toàn những kháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp. Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test), kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng nguyên vô khuẩn (Sterility test). - Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà [126], [129]..Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ trước, nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do ngựa cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều đặn một khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang đến hiệu quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát triển, nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp.
TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM
Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh
(Malaysia) [137], đã thí nghiệm đánh giá tác dụng trung hòa độc tính nọc của rắn cạp nia nam Bungarus candidus (Malayan kraid) bằng hai loại HTKN rắn hổ đa giá thường dùng nhất ở Ấn Độ là Vins polyvalent antivenom (VPAV) và Bharat polyvalent antivenom (BPAV), kết quả: các loại HTKNR này đều không có tác dụng. “Bungarus candidus antivenom”, “Malayan Krait antivenin” do Viện Queen Saovabha Memorial Institute, Thái Lan sản xuất, liều dùng 50 ml (10ml/ống), trung hòa được 0.4 mg/ml nọc rắn cạp nia nam; và “Bungarus multicinctus and Naja atra antivenom”do Chinese Shanghai Vaccine & Serum Institute sản xuất, “Taipei Naja-Bungarus antivenin” do Đài Loan sản xuất [147].
Tại Việt Nam
Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân, cho đến nay, trong khi Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc đã cho ra thị trường sản phẩm thương mại, chúng ta vẫn chưa có HTKN rắn cạp nia đơn giá (Monospecific) trên thị trường. - Trên cơ sở những thành công trong nghiên cứu, sản xuất HTKN rắn cạp nia nam và HTKN rắn cạp nia bắc, việc nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 cho cả hai loài Bungarus candidus và Bungarus multicinctus là giải pháp tốt, đáp ứng kịp thời nhu cầu cấp cứu điều trị nạn nhân rắn cạp nia cắn hiện nay, nhất là khi chưa có VDK (Venom detection kits) đặc hiệu [15],[83].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nọc rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), nọc rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) đông khô, bảo quản đông lạnh: 3,1 gam. Tá dược Freund hoàn toàn (CFA), không hoàn toàn (IFA): hãng Sigma và tự chế.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Theo dừi hỡnh thành KT đặc hiệu bằng thử nghiệm Ouchternoly: sau mỗi lần gây mẫn cảm cho ngựa, lấy 10 ml máu ngựa, để đông, ly tâm, tách huyết thanh, pha loóng huyết thanh với cỏc độ pha loóng khỏc nhau, theo dừi mức độ, khả năng hình thành kháng thể đặc hiệu sau mỗi lần gây mẫn cảm. Tiến hành pha loóng tiếp, cỏch nhau 1,5 lần thành năm độ pha loãng liên tiếp, sao cho sau khi tiêm nọc rắn có độ pha loãng thấp nhất chuột phải chết 100% và tiêm nọc rắn có độ pha loãng cao nhất chuột phải sống 100% (sau khi pha xong lắc đều và để ở 37oC/30 phút, tránh ánh sáng).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN CẠP NIA ĐA GIÁ F(ab’) 2 ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
- Khảo sát tại miền Tây-Nam bộ và Nam Trung-Bộ: Nha Trang (Khánh Hòa), Trại rắn Đồng Tâm & Bảo tàng rắn Việt Nam (Tiền Giang), Cần Thơ, Bến Tre và Miền Đông Nam bộ: Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh, Bà Rịa- Vũng Tàu,..chúng tôi không gặp Rắn cạp nia bắc, Rắn khoang sông Hồng, Rắn cạp nong đầu đỏ; chỉ gặp Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus). - Sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 trong 18 tháng: tuyển chọn rắn và chế tạo khỏng nguyờn: 3 thỏng; miễn dịch ngựa, theo dừi hỡnh thành khỏng thể: 10 tháng, lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu và tinh chế HTKN- RCN: 2 tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia: 3 tháng.
BÀN LUẬN
SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐÁP ỨNG TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
Khi được tiêm liều kháng nguyên nọc rắn cạp nia nhắc lại, tế bào trí nhớ miễn dịch lập tức được phát động, nhân lên gấp bội để sinh kháng thể IgG (Nguyễn Năng An, Trương Đình Kiệt, 1986) [1]. Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp kháng nguyên và CFA để tăng mạnh hiệu giá khỏng thể cho thấy hiệu quả rất rừ rệt. kháng nguyên và 25% CFA), hoặc kháng nguyên + vắc xin nội độc tố uốn ván (tetanus toxoid), kháng nguyên + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, thu được kết quả tốt, hiệu giá kháng thể tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng kháng nguyên và tá dược là bentonite gel. Theo tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV đề ra ban đầu và tiêu chuẩn của WHO về HTKNR (WHO guidelines, 2008), ngoài việc thiết kế mục tiêu là HTKNR có chứa nhiều nhất F(ab’)2, cần loại bỏ hầu hết những chất không cần thiết của protein ngựa (albumin, globulin không cần thiết), chất bảo quản (phải trong giới hạn cho phép), ammonium sulfate; vi khuẩn, vi nấm, chí nhiệt tố và phải có đủ các điều kiện lý hóa cần thiết của HTKNR như pH trung tính, áp lực thẩm thấu đẳng trương, đảm bảo nồng độ chất bảo quản (thiomersan) ở dưới hàm lượng cho phép..vì vậy, tinh chế huyết tương chứa kháng thể kháng nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam) thành HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 là một quy trình rất quan trọng, ảnh hưởng quyết định đến chất lượng cuối cùng của sản phẩm.
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM
Cần phải giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm vi khuẩn, virus bằng việc thi hành một hệ thống kiểm tra chất lượng nguyên liệu ban đầu, bố trí qui trình sản xuất nhằm bất hoạt và loại bỏ virus còn sót lại trong suốt quá trình sản xuất HTKNR, tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn GMP ở tất cả các bước sản xuất, đáp ứng kịp thời và phù hợp với mọi sự cố nhiễm trùng được ghi nhận trong khi sử dụng HTKNR trên lâm sàng. Các hội nghị khoa học về HTKNR trên thế giới, gần nhất là Hội nghị độc chất học Châu Á –Thái Bình Dương tại Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 và Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X (APAMT) tại Penang, Malaysia (2011) [89], thông tin trên các tạp chí Quốc tế, chưa có tác giả nào thông báo sản xuất sản phẩm tương tự. Hiện nay, trong khu vực Đông nam Á, Thái Lan và Malaysia là hai nước phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh nhất. Về sản phẩm HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam, các nước trên có nhiều nghiên cứu đáng chú ý. Trước đó, Chanhome. fasciatus), cũng nhận thấy có nhiều sự tương đồng giữa nọc B.