NGHIÊN cứu một số ðặc ðiểm DỊCH tễ, BỆNH lý lâm SÀNG BỆNH tụ HUYẾT TRÙNG TRÂU, bò

LÊ VĂN PHƢỢNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ÐẶC ÐIỂM DỊCH TỄ, BỆNH LÝ LÂM SÀNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI 3 HUYỆN QUẢNG XƢƠNG, NÔNG CỐNG, TĨNH GIA TỈNH THANH HÓA VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN – 2015 LÊ VĂN PHƢỢNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ÐẶC ÐIỂM DỊCH TỄ, BỆNH LÝ LÂM SÀNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI 3 HUYỆN QUẢNG XƢƠNG, NÔNG CỐNG, TĨNH GIA TỈNH THANH HÓA VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN – 2015 L I CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu của nhiều cá nhân và tập thể tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Trước hết tôi xin bày tỏ sự cảm ơn trân trọng nhất tới giảng viên hướng dẫn khoa học PGS.TS. Ðặng Xuân Bình người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn sự góp ý của các thầy cô giáo khoa Chăn nuôi Thú y, Trường ại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Thú y Vùng 3 (Vinh), Cục thú y Trung ương, Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Thanh Hóa, Ban lãnh đạo Trạm thú y huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tỉnh Gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân, các cán bộ, đồng nghiệp luôn luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Lê Văn Phƣợng L I CAM ÐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, lần đầu tiên nghiên cứu đồng thời trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Tĩnh Gia, Nông Cống, tỉnh Thanh Hóa và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Các thông tin khoa học trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Lê Văn Phƣợng MỤC LỤC Trang MỞ ÐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc 4 1.1.1. Trên thế giới 4 1.1.2. Ở Việt Nam 5 1.2. Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng 7 1.2.1. Nguồn bệnh và phương thức lây lan 7 1.2.2. Loài mắc bệnh 7 1.2.3. Tuổi mắc bệnh 8 1.2.4. Mùa phát bệnh 8 1.2.5. Vùng phát bệnh 10 1.3. ặc tính sinh học của mầm bệnh 11 1.3.1. Phân loại 11 1.3.2. Hình thái và đặc tính nuôi cấy 11 1.3.3. ặc tính sinh hóa 15 1.3.4. Kháng nguyên của vi khuẩn 16 1.3.5. ộc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida 18 1.3.6. Sức đề kháng 20 1.4. ặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 21 1.4.1. Cơ chế sinh bệnh 21 1.4.2. Biểu hiện đặc trưng của trâu bò bị bệnh tụ huyết trùng 22 1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh 24 Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Nội dung nghiên cứu 25 2.1.1. Tình hình dịch bệnh chủ yếu ở trâu, bò trong phạm vi cả nước năm 2014 25 2.1.2. ặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa 25 2.1.3. Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 25 2.1.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể, vi thể ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 25 2.1.5. Tình hình mang khuẩn Pasteurella multocida trong dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 25 2.1.6. Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 25 2.1.7. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của trâu, bò đối với 2 loại vắc xin bổ trợ nhũ dầu và keo phèn sau 6 tháng được tiêm vắc xin phòng bệnh tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa 26 2.1.8. ánh giá hiệu quả điều trị bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò bằng một số phác đồ thực tế tại cơ sở 26 2.1.9. Tình hình phòng bệnh bằng vắc xin cho đàn trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa năm 2014 26 2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu 26 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn 26 2.2.2. ộng vật thí nghiệm 26 2.2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 28 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida 29 2.3.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được. 32 2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ 34 2.3.5. Xác định tình trạng miễn dịch của trâu, bò khỏe trong các ổ dịch cũ bằng phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) 35 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Tình hình dịch bệnh chủ yếu ở trâu, bò trong phạm vi cả nước năm 2014 36 3.2. ặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa 37 3.2.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa từ năm 2011 2014 37 3.2.2. Tình hình các xã có dịch tụ huyết trùng trâu, bò, trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia giai đoạn 2011 2014 39 3.2.3. Tình hình dịch tụ huyết trùng trâu, bò, trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia giai đoạn 2011 – 2014 theo vụ 40 3.3. Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 43 3.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể, vi thể ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 45 3.5. Tình hình mang khuẩn Pasteurella multocida trong dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 46 3.6. Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, Thanh Hóa 50 3.6.1. Giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 51 3.6 2. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được53 3.6.3. Xác định type kháng nguyên của chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân được 54 3.7. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của trâu, bò đối với 2 loại vắc xin bổ trợ nhũ dầu và keo phèn sau 6 tháng được tiêm vắc xin phòng bệnh tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa 56 3.8. ánh giá hiệu quả điều trị bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò bằng một số phác đồ thực tế tại cơ sở 58 3.9. Tình hình phòng bệnh bằng vắc xin cho đàn trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa năm 2014 60 KẾT LUẬN VÀ ÐỀ NGHỊ 62 1. Kết luận 62 2. ề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN BHI: Brain Heart Infusion ÐC: Ðối chứng ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay TN: Thí nghiệm LD50: Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% P. multocida: Pasteurella multocida PCR: Polymerase Chain Reaction Cs: Cộng sự DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Kết quả điều tra hồi cứu về tình hình dịch bệnh chủ yếu, thường gặp ở trâu, bò trên phạm vi cả nước năm 2014 36 Bảng 3.2: Kết quả điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa giai đoạn 2011 – 2014 38 Bảng 3.3: Kết quả điều tra t lệ các xã có dịch tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa giai đoạn 20112014 40 Bảng 3.4: Kết quả xác định t lệ trâu, bò ốm, chết do bệnh tụ huyết trùng theo Vụ 41 Bảng 3.5: Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 44 Bảng 3.6: Kết quả theo dõi bệnh tích đại thể, vi thể ở gan và phổi trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 45 Bảng 3.7: Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khỏe (không có triệu chứng lâm sàng) 46 Bảng 3.8: Kết quả xác định mang t lệ trùng vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò theo tính biệt 48 Bảng 3.9: Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe theo tuổi gia súc 49 Bảng 3.10: Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng 50 Bảng 3.11: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 51 Bảng 3.12: Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 52 Bảng 3.13: Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 53 Bảng 3.14: Kết quả xác định type kháng nguyên của các chủng Pasteurella multocida phân lập được 54 Bảng 3.15: Kết quả thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 56 Bảng 3.16: Ðáp ứng miễn dịch của trâu, bò tiêm được tiêm phòng bệnh bằng vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu và keo phèn sau 6 tháng 57 Bảng 3.17: Kết quả điều trị bệnh cho trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng bằng phác đồ kháng sinh 58 Bảng 3.18. Tình hình phòng bệnh bằng vắc xin cho đàn trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống và Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa năm 2014 .......................................................................................................... 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Sơ đồ 2.1: Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida 33 Hình 3.1. Chế phẩm kháng sinh D.O.C MAR dùng trong phác đồ 1 59 HÌnh 3.2. Chế phẩm kháng sinh TIACOL dùng trong phác đồ 2 59 MỞ ÐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chăn nuôi trâu bò ở Việt Nam trong những năm qua đã có những bước phát triển đáng kể nhằm cung cấp thịt sữa cho nhu cầu thực phẩm của người dân; sức kéo cho nhu cầu sản xuất nông nghiệp, tiểu thủ công nghiệp và cung cấp nguyên vật liệu cho công nghiệp chế biến, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội. Bên cạnh sự phát triển đó, ngành chăn nuôi trâu bò luôn phải đối mặt với các bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng, trong đó có bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thể bại huyết (Hemorrhagic Septicemia) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi trâu, bò. Hàng năm trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta, các báo cáo về tình hình bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở trâu, bò đã cho thấy những thiệt hại kinh tế to lớn. Theo các bào cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết quả nghiên cứu của Ðặng Xuân Bình và cs (2010) 2; tại tỉnh Hà Giang năm 2008 đã có 276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng; tương tự như vậy, tại tỉnh Thanh Hóa trong năm 2008 đã có 455 trâu, bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng. Ðể khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, chế tạo, sử dụng để tiêm phòng cho trâu, bò nhưng bênh vẫn liên tục xảy ra, đặc biệt trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc. Ðinh Duy Kháng và cs (2000) 14 cho biết: Việc tiếp tục phân lập xác định vi khuẩn Pasteurella là cần thiết để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh để tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh. Lê Văn Tạo và cs (1998)32 cũng khuyến cáo: Nên tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò đạt t lệ cao (>80%) với loại vắc xin có sự tương đồng kháng nguyên với chủng vi khuẩn Pasteurella gây bệnh ở địa phương. Về đáp ứng miễn dịch của một số loại vắc xin hiện đang được sử dụng để phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở nước ta, Hoàng Xuân Nghinh và cs (2004) 22 trao đổi: Hiện nay ở Việt Nam có hai loại vắc xin sản xuất trong nước được các địa phương sử dụng. Tuy nhiên t lệ trâu bò mắc bệnh và chết vẫn không ngừng gia tăng dẫn tới chúng ta phải suy nghĩ xem có phải chất lượng kháng nguyên trong vắc xin chưa được chuẩn hoá hay đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella ở mỗi vùng có sự khác nhau. Tổng đàn trâu, bò tại Thanh Hóa tính đến cuối năm 2014 bao gồm: Ðàn trâu có 190.566 con giảm 2,1%, đàn bò 205.300 con giảm 3,6%. Kết quả điều tra cho thấy, sản lượng thịt bò hơi xuất chuồng 5,1 nghìn tấn, tăng 0,3%, thịt trâu hơi 3,2 nghìn tấn. Bên cạnh những kết quả đạt được, chăn nuôi trâu, bò của Thanh hóa thường xuyên bị bệnh tụ huyết trùng gây thiệt hại kinh tế lớn trong ngành chăn nuôi của địa phương. Ðầu năm 2014, tại huyện Thường Xuân, tỉnh Thanh Hoá đã phát hiện 60 con trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ở 2 xã Vạn Xuân và Xuân Chính. Ðặc biệt chỉ trong mấy ngày Tết ở thôn Hang Cáu của xã Vạn Xuân, có gần 40 con trâu bò chết. Nguyên nhân xuất hiện bệnh tụ huyết trùng trên đàn gia súc huyện Thường Xuân là do vào những ngày Tết thời tiết thay đổi thất thường, bên cạnh đó do tập quán thả rông trâu, bò của bà con và do công tác tiêm phòng dịch chưa triệt để. Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, căn cứ vào cơ sở khoa học và năng lực của cơ quan nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, bệnh lý lâm sàng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tỉnh Gia tỉnh Thanh Hóa và biện pháp phòng trị”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, bệnh lý lâm sàng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại các huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa. Khảo sát tình trạng mang vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò khỏe và phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng. Khảo sát mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella phân lập được ở trên thực địa tại các huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia thuộc tỉnh Thanh Hóa. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài là nguồn tư liệu bổ sung về đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa. Kết quả giám sát sự lưu hành, phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa học, yếu tố độc lực và xác định serotype kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là cơ sở để lựa chọn vắc xin phòng bệnh, kê đơn thuốc điều trị và phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp tư liệu về serotype kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida trên thực địa tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa. Cơ sở thực tế để lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò có khả năng bảo hộ cao. Góp phần khống chế bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò nuôi tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia tỉnh Thanh Hóa và trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc 1.1.1. Trên thế giới Bệnh tụ huyết trùng được Bollinger phát hiện lần đầu tiên trên bò năm 1878 ở Munich (Ðức). Những năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới, trên nhiều loài gia súc, gia cầm. Năm 1885, Kitt đã phân lập được vi khuẩn. Khi nghiên cứu vi khuẩn tụ huyết trùng gây bệnh ở các loài gia súc, các nhà khoa học thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh, tương đồng kháng nguyên, nhưng khác nhau về tính gây bệnh cho các loài vật. Năm 1887, Trevisan đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur, người có nhiều đóng góp nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn này (De Alwis, 1992) 50. Vi khuẩn pasteurella gây bệnh cho nhiều loài gia súc nên tên của chúng được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh: Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò Pasteurella oviseptica gây bệnh ở dê, cừu Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà… Ðến năm 1939, Rosenbush và Merchant 79 đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn này là Pasteurella multocida, để chỉ khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của chúng, tên này đã được công nhận chính thức trên thế giới và sử dụng cho đến ngày nay. Lignieres (1900)62 cho rằng: bệnh tụ huyết trùng có ít nhất ở 6 loài vật nuôi khác nhau. Hai thuật ngữ chỉ bệnh là Haemorrhagic septicaemia và Pasteurellosis được xem là đồng nghĩa. Tuy nhiên, gần đây theo quy ước của tổ chức FAO (FAOWHOCIF, 1970), trong các tài liệu quốc tế về súc sản, hai thuật ngữ này được dùng phân biệt, Haemorrhagic septicaemia dùng chỉ bệnh do Pasteurella multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosisdùng chỉ bệnh do vi khuẩn Pasteurella gây ra. Ở Châu , bệnh tụ huyết trùng trâu, bò do Pasteurella multocida gây ra thường ở hai thể chủ yếu: Nhiễm trùng máu xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia HS) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumonic pasteurellosis). Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu, Pasteurella multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc gia cầm. Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng Pasteurella multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau. 1.1.2. Ở Việt Nam Bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam được phát hiện vào những năm cuối thế k 19: Cudamie thông báo về bệnh ở trâu thuộc tỉnh Bà Rịa và Long Thành năm 1868, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersin phát hiện bệnh ở ở các tỉnh miền Trung vào các năm 18891895. Năm (1901) Shein bằng phương pháp phân lập và tiêm truyền qua động vật thí nghiệm đã xác nhận ổ dịch ở trâu, bò xảy ra ở Tây Ninh là do vi khuẩn Pasteurella multocida (Phan Ðình Ðỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) 4). Theo Ðoàn Thị Băng Tâm (1987)31, tại Việt Nam bệnh thường xảy ra ở Nam bộ và đặc biệt ở miền tây Nam bộ, vào những năm 1910, 1919, 1920, 1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn và mạnh. Bệnh gây thiệt hại và lây lan nhiều hơn ở những vùng đất trũng, thấp, khí hậu ẩm ướt. Bùi Quý Huy (1998) 11 cũng cho biết: Trước đây bệnh tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc. Trong những năm 70 có 80% số ổ dịch tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh tụ huyết trùng thuộc về các tỉnh ở phía Nam. Ðến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên nhiều, hàng năm có 20 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành. Ở nước ta khí hậu nóng ẩm, mỗi miền Bắc Trung Nam có điều kiện khí hậu và hệ sinh thái khác nhau. Các tác giả Nguyễn Vĩnh Phước (1978)25, Nguyễn Ngã (1996)21, Nguyễn Thiên Thu (1996)34 đã nhận định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với những cơn mưa ở từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa. Nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella multocida, phương pháp chẩn đoán, phân lập và chế tạo vắc xin phòng bệnh. Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007)8 tiến hành nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ trâu, bò, lợn. Phan Thanh Phượng (1986 1990)28 đã nghiên cứu, chế tạo và sử dụng vắc xin nhũ hoá bằng công nghệ lên men sục khí để phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ. Dương Thế Long (1995)18 đã phân lập được vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La. Nguyễn Ngã (1996)21, Nguyễn Thiên Thu (1996)34 đã phân lập được vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và xác định tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được với chủng vắc xin Iran. Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng như Bùi văn Dũng (2000) 3 nghiên cứu tình hình bệnh tụ huyết trùng và vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ở tỉnh Lai Châu. Hoàng Ðăng Huyến (2004) 12 nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Bắc Giang. Nguyễn Ðăng Minh (2005) 20 nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh THT và xác định t lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu, bò tỉnh Hà Tây. Ðỗ Ngọc Thúy và cs (2007) 35 đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ vật nuôi. 1.2. Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng 1.2.1. Nguồn bệnh và phương thức lây lan Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là những trâu, bò, lợn và gia cầm bị bệnh và mang trùng. Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, Pasteurella multocida ở một điều kiện nhất định, vi khuẩn thường tồn tại ở đường hô hấp trên của vật chủ, đây không phải là quan hệ cộng sinh. Khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn tăng độc lực và tác động gây bệnh. Cho đến nay không rõ là vi khuẩn tồn tại bằng cách truyền lần lượt trong một số dãy cá thể của một quần thể hay nó còn tồn tại lâu dài một số con. Có nhiều cách lây bệnh khác nhau: Nhiễm qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, qua vết xước trên da, bệnh có thể lây từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc. Bệnh lây lan do việc giết mổ gia súc ốm, chó mèo và một số côn trùng hút máu như ruồi, mòng… cũng có thể là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) 25. Trong giai đoạn đầu của bệnh, khi con vật còn đi lại được, vi khuẩn từ nước dãi, phân, nước tiểu được bài ra xung quanh. Ổ dịch rộng hay hẹp tùy theo điều kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịch của đàn (Phan Thanh Phượng, 1994) 29. 1.2.2. Loài mắc bệnh Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú và loài chim đều mẫn cảm với bệnh. Theo Lignieres (1900)62 ít nhất có 6 dạng bệnh tụ huyết trùng khác nhau: Ở gà, trâu, bò, lợn, cừu, dê, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh này đều thấy ở thỏ. Bệnh thấy ở trâu, bò, lợn, thỏ, chó, mèo, hươu, ngựa, chồn, khỉ, dê và cừu (Carter, 195944). Bệnh còn thấy ở bò rừng, nai, sơn dương, lợn rừng, thỏ rừng, voi, lạc đà và báo tuyết ở Hymalaya (De Alwis, 198248). Nhiều tác giả đã khẳng định: Nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thì ở đó người ta cũng phát hiện bệnh này ở động vật hoang dã. De Alwis (1982)48 cho rằng loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò. T lệ mắc bệnh và t lệ chết của các loài vật với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như mức độ cảm nhiễm của vùng, mức độ bùng nổ của các vụ dịch trước đó, mức độ miễn dịch toàn đàn, đặc biệt phụ thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh. Ở Việt Nam, trâu dễ bị nhiễm và mắc bệnh nặng hơn bò. Trâu, bò rừng cũng mắc bệnh (Ðoàn Thị Băng Tâm, 1987) 31. Trâu thường chết khi gặp thể quá cấp hoặc cấp tính. 1.2.3. Tuổi mắc bệnh De Alwis (1984)49 cho biết mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già, kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy ở bò và trâu t lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6 tháng là 3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là 30 32%, ngược lại trâu, bò trên 2 năm tuổi t lệ mắc bệnh chiếm từ 3 5% toàn đàn. Nghiên cứu cũng cho thấy t lệ chết của trâu, bò trong mỗi ổ dịch là 84 và 91% tập trung vào lứa tuổi 6 tháng đến 18 tháng. Bệnh xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi, những con đang bú mẹ ít mắc hơn những con trưởng thành. Trâu, bò 13 tuổi dễ mắc hơn trâu bò già và khi mắc thì t lệ chết cao hơn. Trâu bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và t lệ chết cao. Bê, nghé dưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh (Bùi Quý Huy, 1998) 11. Cao Văn Hồng (2002) 9 tại Ðắk Lắk cũng cho thấy lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 tháng tuổi. Hoàng Ðăng Huyến (2004) 12 cho biết tại Bắc Giang trâu, bò nhỏ hơn 2 năm tuổi mẫn cảm với bệnh nhất. 1.2.4. Mùa phát bệnh Bệnh tụ huyết trùng phụ thuộc rất lớn vào thời tiết, khí hậu. Mustafa và cs (1978)64 nghiên cứu về ảnh hưởng của mùa vụ tới bệnh tụ huyết trùng đã nhận xét bệnh thường liên quan tới điều kiện khí hậu ẩm ướt. Theo Yeo và Mukhtar (1992)83 khi nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng vì những yếu tố này ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của mầm bệnh trong môi trường sinh sống của động vật cảm nhiễm. Mùa phát bệnh tụ huyết trùng ở các nước Châu tập trung vào các tháng và mùa khác nhau trong năm. Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 4 đến tháng 8; Ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh năm song thường ở tháng 4 đến tháng 6 hàng năm (FAO, 199154). Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiện vào cuối mùa khô, đầu mùa mưa (Natalia và cs, 199271), bệnh xảy ra các tháng 8, 9 ở Malaysia (Yeo và Mukhtar, 199283). Yeo và Mukhtar (1992)83 theo dõi dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở đảo Sabah Malaysia từ 1983 1991 cho biết số lượng ổ dịch và số lượng trâu, bò chết hàng năm ở các huyện rất khác nhau: Một số huyện xảy ra dịch từ tháng giêng đến tháng 3, trong khi phần lớn lại xảy ra dịch từ tháng 7 đến tháng 11. Từ số liệu theo dõi của mình, tác giả đã so sánh giữa 2 vùng trong cùng một đất nước về loài vật mắc bệnh, tuổi mắc bệnh, thời gian xảy ra bệnh và cho rằng sở dĩ có sự khác nhau này là do điều kiện thời tiết khí hậu có sự khác nhau giữa 2 vùng, đồng thời phương thức chăn nuôi giữa 2 vùng cũng khác nhau. Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy tại từng địa phương, từng quốc gia khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng, vì những yếu tố này ảnh hưởng tới sự tồn tại, phát triển của mầm bệnh trong môi trường sinh sống của động vật cảm nhiễm Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) 25, ở nước ta bệnh tụ huyết trùng trâu, bò chỉ là những ổ dịch nhỏ, lẻ tẻ nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm thì bệnh lây lan thành dịch, bởi nhiệt độ ẩm của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của mầm bệnh. Bùi Quý Huy (1998) 11 cho biết ở miền Bắc bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào các tháng mưa nhiều từ tháng 7 đến tháng 9, ở miền Nam bệnh xảy ra mạnh sau khi mưa và nắng từ tháng 4 đến tháng 10. Nguyễn Ðăng Minh (2005) 20 thông báo, bệnh tụ huyết trùng xảy ra rải rác quanh năm tập trung từ tháng 3 đến tháng 8, vào các tháng đầu mùa mưa của vụ hè thu, cao nhất là tháng 5, 6 vì đây là các tháng nắng nóng, nhiệt độ cao, ẩm độ cao. 1.2.5. Vùng phát bệnh Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra ở những vùng đất trũng, khí hậu nóng và ẩm ướt. Theo Phan Ðình Ðỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958)4 bệnh thường xảy ra ở vùng ẩm thấp, khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, đặc biệt là đầu mùa mưa. Ðiều kiện tự nhiên, khí hậu và phương thức chăn nuôi cũng ảnh hưởng đến quá trình lây lan và phát sinh bệnh. Ðặc biệt ở những vùng đất trũng, ẩm thấp, lầy lội, bị ngập lụt, có nhiều ruộng nước, nhiều kênh rạch, bệnh thường xảy ra và lây lan mạnh làm chết nhiều gia súc Ðoàn Thị Băng Tâm, 198731). Năm 1990 riêng ba tỉnh Sơn La, Hoàng Liên Sơn, Bắc Thái số ở dịch tụ huyết trùng gia súc chiếm 60% và trong đó có tới 70% số gia súc chết so với toàn miền Bắc (Bùi Quý Huy, 199811). Ðỗ Văn Ðược (2003)6 cho biết ở Lạng Sơn vùng núi đất, có độ dốc lớn, nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, tập quán chăn nuôi còn lạc hậu, chăn thả tự do thì t lệ bị nhiễm bệnh và chết cao. Theo Hoàng Ðăng Huyến (2004) 12 ở Bắc Giang những vùng đồi núi thấp t lệ mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng cao. Nguyễn Văn Minh (2005)20 thông báo ở Hà Tây t lệ trâu, bò ốm chết vì bênh tụ huyết trùng ở vùng đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùng đồng bằng. Ở những vùng mà phương thức chăn nuôi còn thả rông, không có người chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùn lầy, ngập nước, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng kém thì khả năng xảy ra bệnh cao. Ngoài ra, trình độ dân trí thấp, nhận thức của người dân về công tác phòng chống bệnh chưa cao, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc phòng chống dịch bệnh còn nhiều khó khăn… cũng không tránh khỏi việc dịch bệnh thường xuyên xảy ra. 1.3. Ðặc tính sinh học của mầm bệnh 1.3.1. Phân loại Giống Pasteurella có nhiều loài, căn cứ vào tính chất gây bệnh cho các loài động vật, người ta chia giống Pasteurella thành 3 loài, trong đó loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là Pasteurella multocida và với từng giống gia súc, gia cầm khác nhau bệnh tụ huyết trùng lại do các serotype khác nhau gây ra. Theo phân loại của Bergey (1994) 41 , Pasteurella spp thuộc: Bộ (order) Eubacteriales Họ (family) Parvobacteriaceae Tộc (tribe) Pasteurellceae Giống (genus) Pasteurella 1.3.2. Hình thái và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Pasteurella multocida có dạng cầu trực khuẩn, bắt màu Gram âm (), kích thước 0,250,4 × 0,41,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) 33. Theo Carter (1967)46 có mối liên quan về tính đa dạng của vi khuẩn khi phát triển trong điều kiện thiếu O2. Vi khuẩn thường đồng nhất trong máu động vật. Trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình dạng, hình trứng, hình cầu...Tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy nhiều lần trong môi trường nhân tạo, chiều dài của vi khuẩn tăng lên. Trong cơ thể gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh hoặc máu vỡ, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khi nhuộm khó thấy. Khi nhuộm tiêu bản bệnh phẩm, Pasteurella multocida bắt màu sẫm ở hai đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu nên người ta gọi Pasteurella multocida là vi khuẩn lưỡng cực. Nguyên nhân này là do nguyên sinh chất của vi khuẩn dồn về 2 đầu. Trong canh khuẩn vi khuẩn có hình trứng, hình cầu đứng riêng lẻ hay thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng thay đổi hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường có khi dài 23µm. Vi khuẩn không có lông, không di động không hình thành nha bào. Pasteurella dễ nhuộm với thuốc nhuộm thông thường như anilin, Methylen Bleu, Fuchsine và Giemsa. Vi khuẩn Pasteurella multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường như: Môi trường nước thịt, môi trường thạch thường. Theo (Seleim R. S. (2005) 80, để vi khuẩn Pasteurella multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng. Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, vi khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 510% huyết thanh hoặc máu động vật. Pasteurella multocida là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, ưa kiềm nhẹ, pH=7,27,4, có thể nuôi cấy ở nhiệt độ từ 130C đến 380C, thích hợp nhất là 370C Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém. Vi khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 5 10 % huyết thanh hoặc máu động vật. Trên môi trường nước thịt: Sau khi cấy 24h ở nhiệt độ 370C vi khuẩn làm đục môi trường, đáy ống có cặn nhày, lắc có hiện tượng vẩn như sương mù rồi lại mất, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường. Môi trường có mùi đặc biệt giống mùi tanh của nước dãi khô. Theo Carter, (1952)42 mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển nhanh, để lâu mùi tanh giảm dần (trong môi trường nước thịt Pasteurella multocida phát triển theo 4 pha: Pha chậm, pha phát triển nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái). Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lau khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường. Theo Carter (1955)43, Namioka và Murata (1961a, b)67, 68 trên môi trường thạch Pasteurella multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc: + Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và có độc lực mạnh. + Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, độc lực trung bình. + Khuẩn lạc R (Rough): Có rìa xù xì, thường không có dung quang, độc lực yếu. Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi cấy chuyển qua môi trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật. Từ dạng S chúng có thể chuyển sang dạng R hoặc M và ngược lại. Tính biến dạng này đặc biệt rõ khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng có các loại đường mà chúng lên men. Trong những môi trường đó chúng xếp thành từng chuỗi. Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: Vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng cho vi khuẩn tụ huyết trùng. Ðặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán. Theo Namioka và murata (1961c)69 YPC (Yeast extract Pepton LCystin) có thêm Sucrose và sodium sulfite là môi trường nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn Pasteurella multocida, môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi khuẩn và cũng là môi trường phân lập, giữ giống và nhân giống. Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: Ðây là môi trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella. Trên môi trường này vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp (khoảng 20 lần) và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 450. Những khuẩn lạc dạng S từ canh trùng thường mới có tính dung quang. Khuẩn lạc dạng M và R không có đặc điểm nói trên. Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau: + Nếu vi khuẩn có độc lực cao: Khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 23 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 13 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: Khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent). + Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: Khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong. Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy sau 24h. Nếu để lâu sau 72h thì huỳnh quang sẽ mất đi. Theo Smith (1990)81 đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của vi khuẩn tụ huyết trùng. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng tụ huyết trùng có tính kháng nguyên và miễn dịch cao. Như vậy, vi khuẩn tụ huyết trùng có thể phát triển trên nhiều loại môi trường, song có một số loại môi trường được các tác giả cho là thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng, đó là: Môi trường YPC, môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến. Cần lưu ý là khi cấy chuyển trên môi trường nhân tạo nhiều lần, vi khuẩn tụ huyết trùng có sự biến đổi về khả năng mọc, đặc điểm hình thái và giáp mô cũng như sự tạo khuẩn lạc, đồng thời có sự thay đổi về độc lực, thay đổi về tính kháng nguyên của chủng nuôi cấy. 1.3.3. Đặc tính sinh hóa Lignieres đã phát hiện một số đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn tụ huyết trùng từ những năm đầu của thế k XX Theo thời gian, nhiều công trình nghiên cứu về đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida đã được công bố. ác tác giả thống nhất về một số đặc tính sinh hoá cơ bản của vi khuẩn tụ huyết trùng như sau: Dương tính trong các phản ứng Indole, khử Nitrat, Catalase, Oxidase. Phân giải lên men các loại đường Glucose, Galactose, Saccarose, Mannose và Levulose. Không lên men đường Lactose, Maltose, Ducitol và Rafinose Rosenbusch và Merchant (1939) 79 nghiên cứu 113 chủng tụ huyết trùng về các phản ứng phân giải Arabinose, Xylose và Ducitol, chia vi khuẩn thành 3 nhóm. Nhóm 1: Gồm các vi khuẩn phân giải Arabinose và Ducitol, không phân giải Xylose. Những chủng này phân lập từ gia cầm. Nhóm 2: Gồm những chủng phân giải Xylose, không phân giải Arabinose và Ducitol. Những chủng này phân lập từ động vật có vú. Nhóm 3: Gồm những chủng lên men phân giải Arabinose, Ducitol và Xylose. Tác giả còn thấy khi nuôi cấy lâu trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn mất khả năng phân giải Arabinose và Xylose. Tất cả các chủng được nghiên cứu ở trên đều sinh Indol, không di động, không dung huyết và không phân hủy urea. Tác giả nhận thấy, những chủng phân lập từ gia cầm đều thuộc nhóm 1, những chủng phân lập từ động vật có vú đều thuộc nhóm 2. Ở Việt Nam cũng có khá nhiều tác giả nghiên cứu đặc tính sinh vật, hoá học của Pasteurella multocida như Nguyễn Xuân Bình (1996)1 và Hoàng Ðạo Phấn (1996)24. 1.3.4. Kháng nguyên của vi khuẩn Kháng nguyên Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng nguyên Pasteurella multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Khi nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida Ligniere (1900)62 đã khẳng định các chủng Pasteurella multocida phân lập từ các loài vật mắc bệnh khác nhau có đặc tính huyết thanh không đồng nhất. Cho đến nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P.multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, Kháng nguyên thân O, kháng nguyên ngoại tế bào OMP (outer memmbrane protein). Kháng nguyên vỏ (K): Chỉ có ở Pasteurella multocida tạo khuẩn lạc dạng S, Không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, che cho kháng nguyên O khỏi bị các phage tác động, đồng thời ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng nguyên O bị che lấp, người ta phải phá hu kháng nguyên K hoặc dùng phương pháp nuôi cấy không cho vi khuẩn hình thành giáp mô. Kháng nguyên K thu được qua chiết xuất từ canh khuẩn non, phát hiện được dễ dàng qua phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price G. H. và Smith (1966)73 chúng gồm có 3 loại là α, β, γ. Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccaride. Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên K, đặc biệt là thành phần protein của kháng nguyên K đóng vai trò tích cực trong quá trình hình thành miễn dịch. Kháng nguyên thân (O): Vi khuẩn Pasteurella multocida có kháng nguyên thân là phức hợp protein lipid polysaccaride chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch. Price G. H. và Smith (1966)73 dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16 kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 16. Sau khi nhuộm đỏ Thiazine, xử lý nhiệt và enzyme, tác giả xác định được 6 trong 16 kháng nguyên O là protein. Heddleston và cs (1966)57 cho biết kháng nguyên lipopolysaccarid (LPS) của Pasteurella multocida gắn với protein một cách lỏng lẻo. Qua ly tâm ở tốc độ cao, những chủng vi khuẩn phân lập được ở gia cầm đã xác định được một kháng nguyên gồm cả lipopolysaccarid và protein. Theo một số tác giả, các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O. Những chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O. Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng: Kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng, 199429). Kháng nguyên ngoại tế bào (Outer membrane proteins OPM) Thành phần của kháng nguyên protein ngoài màng tế bào rất phức tạp có tới hơn 40 loại protein đã được xác định. Mối quan hệ giữa các band protein khi tiến hành điện di và các serotype đã được nghiên cứu song không tìm thấy bất kỳ một loại protein duy nhất nào đặc trưng cho tất cả các chủng gây tụ huyết trùng. Kháng nguyên ngoại tế bào gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó). Một trong những protein độc tính quan trọng của protein ngoại tế bào này là protein gắn huyết cầu tố (hemoglobinbinding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên màng hemoglobin. Ðoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải trình tự (Seleim, 200580). Ba loại protein ngoại tế bào đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III. Sự khác biệt này được phân loại dựa trên cấu trúc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (W) của kháng nguyên này, khối lượng phân tử dao động trong khoảng giữa 28 kDa và 40kDa. Protein H của Pasteurella multocida có các đặc điểm tương tự protein xuyên màng của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, giống các peptidoglycane, kháng trypsine, kháng dung dịch SDS (sodium dodicyl sulphate). Hơn nữa protein H phức hợp với lipopolysaccharide khi gây đáp ứng miễn dịch. Mặc dầu không thể phát hiện ra mối quan hệ giữa độc tính của các chủng với protein ngoại tế bào, song OMP type I có độc tính cao với lợn và gây ra viêm teo mũi truyền nhiễm. ngược lại OMP type II và III ít độc tính hơn. Seleim (2005)80 cho biết các chủng Pasteurella multocida có khá tương đồng và ít có sự khác nhau về cấu trúc các protein ngoại bào. Tóm lại, kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp, còn nhiều vấn đề chưa được sáng tỏ, đặc biệt là kháng nguyên thân O. Xét về quan hệ hoá học, các kháng nguyên protein và lipopolysaccarid của Pasteurella multocida có vai trò chính trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc còn kháng nguyên polysaccarid đóng vai trò hỗ trợ. 1.3.5. Độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida Ðộc tố của canh trùng Pasteurella multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế k 20, Baldrey đã nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có độc tính của lipopolysaccharide. Ðộc lực của Pasteurella multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn và loài vật kí sinh. Giáp mô của Pasteurella multocida là yếu tố độc lực quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập và phát triển trong cơ thể vật chủ. Ða phần những chủng Pasteurella multocida có giáp mô thì độc lực cao, những chủng Pasteurella multocida không có giáp mô thì độc lực yếu hoặc không có độc lực. Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp vi khuẩn này không có giáp mô nhưng vẫn có độc lực cao và một số chủng có giáp mô lại độc lực thấp. Khi nuôi cấy Pasteurella multocida trong môi trường nhân tạo qua 24h thì giáp mô của vi khuẩn phát triển đầy đủ, sau đó mất dần đi. Một số tác giả còn cho rằng ở nhiều chủng Pasteurella multocida độc lực có thể phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng. Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida các tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do Pasteurella multocida gây ra người ta tìm thấy dấu hiệu hoạt động của độc tố. Nội độc tố được sinh ra bởi các loài Pasteurella multocida, kể cả chủng có độc lực và không có độc lực, Heddleston và cs (1972) 58 đã chứng minh nội độc tố được gắn kết lỏng lẻo và có thể rửa trôi khỏi tế bào vi khuẩn Pasteurella multocida bằng dung dịch nước muối có formalin và được làm lạnh. Nội độc tố của Pasteurella multocida có thể chiết xuất được bằng acid trichloroacetic theo qui trình của Boivin. Phùng Duy Hồng Hà (1990)7 thử nghiệm độc lực của 3 chủng Pasteurella multocida phân lập được tại các tỉnh phía nam là TG, V, HL trên chuột, gà và vịt, kết quả cho thấy các chủng có dung quang màu vàng da cam có độc lực rất cao. Nghiên cứu Ramdani và cs (1990)75 cho thấy một trong những chủng Pasteurella multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404 thuộc serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩncon thì sau 18 giờ chuột đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết. Vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc serotype D còn tạo ra dermanecrotic toxin (DNT) là độc tố gây hoại tử biểu bì, độc tố này không bền với nhiệt. Trọng lượng phân tử của dermanecrotic toxin khoảng 112 160 kDa và có thể tách chiết trong canh trùng nuôi cấy, gen toxA quy định tổng hợp dermanecrotic toxin có chiều dài 4,381 bp. Nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30°C thì hoạt tính của gene toxA này bị giảm nhiều và lượng độc tố DNT sinh ra cũng ít đi (Hunt và cs, 200060). Vi khuẩn Pasteurella multocida được nuôi cấy trên môi trường thạch tới 72 giờ sẽ sinh nhiều độc tố hơn. Nội độc tố của vi khuẩn Pasteurella multocida chỉ xuất hiện trong huyết thanh của những con vật bị bệnh nặng từ 3 5 giờ trước khi chết với những triệu chứng như giảm nhiệt độ, run rẩy… (Horadagoda và cs, 200159). Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một số chủng Pasteurella multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của những độc tố này tương đối giống nhau. Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có độc tố bản chất từ protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất protein của serotype E. 1.3.6. Sức đề kháng Pasteurella dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường. Vi khuẩn bị diệt khi đun ở 580C trong 20 phút, 800C trong 10 phút, 1000C trong vài giây. Trong các mô bào của cơ thể, ở nhiệt độ 800C vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng 15 20 ngày, ánh sáng mặt trời diệt vi khuẩn trong 12 giờ. Trong xác xúc vật, vi khuẩn sống được từ 1 3 tháng. Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng từ 5 9 ngày. Trong tuy xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngày sau khi con vật chết. Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuy xương. Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic 5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 35 phút. Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong đất có nhiều nitrat và thiếu ánh sáng. Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm. Vi khuẩn trong da đun sấy khô từ từ có thể giữ độc lực 15 25 ngày, trong tổ chức thối nát vi khuẩn sống tương đối lâu hơn, từ 1 3 tháng nếu nhiệt độ dưới 200C. 1.4. Ðặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò Bệnh do Pasteurella multocida gây ra thường ở 2 thể chủ yếu: Nhiễm trùng huyết, bại huyết, xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumoniae Pasteurellosis). Thể nhiễm trùng huyết, xuất huyết được thấy ở trâu bò các nước Châu Á và Châu Phi do Pasteurella multocida Type B:2 và Type E:2 gây ra (Bain và cs, 1982) 38. Thể viêm phổi bò được thấy ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ do Pasteurella multocida Type A gây ra. Cho đến nay đã xác định được 2 serotype gây bệnh chính cho trâu, bò là E:2 và B:2. Các nước Châu Á được ghi nhận chỉ có serotype B:2, các nước thuộc Châu Phi chỉ có serotype E:2. Nhưng một số nước khác như Ai Cập, Sudan đã được xác nhận có cả 2 serotype (Carter, 1967 46) 1.4.1. Cơ chế sinh bệnh Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008)16 bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò phát triển như sau: Bệnh tụ huyết trùng phát sinh ở các vùng nóng ẩm. Vào mùa mưa, vi khuẩn có sẵn trong đất, được nước mưa đưa lên mặt đất, dính vào rơm, cỏ và trôi vào các hồ, ao, mương, máng. Trâu bò ăn phải rơm cỏ và uống nước có nhiễm khuẩn sẽ mắc bệnh. Bình thường một số trâu bò khỏe cũng mang vi khuẩn tụ huyết trùng trong hệ thống hô hấp và tiêu hóa. Nhưng vi khuẩn không gây bệnh và súc vật có sức đề kháng cao, giữa vi khuẩn và súc vật có sự cân bằng sinh học. Khi gặp các yếu tố ngoại cảnh bất lợi: Thiếu thức ăn, làm việc nặng, thời tiết thay đổi đột ngột, trâu bò bị giảm sức đề kháng, thế cân bằng sinh học bị phá vỡ và vi khuẩn trở nên cường độc, gây bệnh cho trâu bò. Sau khi vào đường tiêu hóa, vi khuẩn qua niêm mạc nhờ các vết xây xát nhỏ do rơm cỏ, xâm nhập vào máu, tiến đến hệ thống lâm ba ruột và hạch sau hầu. Thường hạch sau hầu sưng rất to. Từ đó vi khuẩn đi vào hệ thống hạch lâm ba trước vai, trước đùi làm cho những hạch này sưng và thủy thũng. Bởi vậy ta thường thấy trâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng có biểu hiện đặc trưng: Sưng hầu mà nhân dân gọi là “bệnh trâu hai lưỡi”. Sự tồn tại của vi khuẩn ở đường hô hấp và tiêu hóa của gia súc khỏe, khi gia súc bị yếu vi khuẩn sẽ trỗi dậy và gây bệnh. 1.4.2. iểu hiện đặc trưng của trâu bò bị bệnh tụ huyết trùng + Triệu chứng lâm sàng Theo Phạm Sỹ Lăng và Phan Ðịch Lân (2002)15 Trâu bò mắc bệnh ở 3 thể: Thể ác tính (quá cấp tính), cấp tính (thường gặp) và thể mãn tính. Thể ác tính (quá cấp tính): Thể này thường ít gặp. Trâu bò phát bệnh rất nhanh: Con vật đột nhiên lên cơn sốt cao (41 420C ) và trở nên hung giữ, điên loạn, đập đầu vào tường, có thể chết trong 24 giờ. Ở một số ổ dịch, một số bê nghé 3 18 tháng có triệu chứng thần kinh, dãy giụa, rồi ngã xuống đất chết; Có khi con vật đang ăn cỏ lồng lên, điên loạn, run rẩy, ngã xuống và lịm đi. Ở xã Tư Ðình (Gia Lâm Hà Nội) đã thấy bò sữa trong dân bị chết đột ngột do bệnh tụ huyết trùng thể ác tính. Thể cấp tính: Thể này xảy ra phổ biến ở trâu bò, thời gian nung bệnh ngắn từ 1 3 ngày, con vật không nhai lại, mệt lả, bứt dứt, sốt cao đột ngột 40 420C. Các niêm mạc mắt, mũi đỏ sẫm rồi tái xám. Nước mắt, nước mũi chảy liên tục. Các hạch lâm ba đều sưng, đặc biệt là dịch lâm ba dưới hầu sưng rất to, làm cho con vật lè lưỡi ra, thở khó khăn, người ta thường gọi là “Bệnh lưỡi đòng” hay bệnh trâu bò hai lưỡi. Hạch lâm ba trước vai, trước đùi sưng, thủy thũng làm cho con vật đi lại khó khăn. Vật bệnh thể hiện hội chứng hô hấp, thở mạnh và khó khăn do viêm màng phổi, tràn dịch màng phổi, có tụ huyết và viêm phổi cấp. Một số trâu bò bị bệnh thể đường ruột lúc đầu phân táo bón sau đó đi ỉa chảy dữ dội, phân có lẫn máu và niêm mạc ruột. Bụng con vật chướng to viêm phúc mạc và có tương dịch trong xoang bụng. Lúc sắp chết, con vật nằm liệt, đái ra máu, thở rất khó khăn, có nhiều chấm xuất huyết đỏ sẫm ở các niêm mạc. Bệnh tiến triển từ 3 5 ngày. Ty lệ chết 90 100%. Nếu bệnh chuyển sang nhiễm trùng máu thì con vật sẽ chết trong thời gian 24 36 giờ. Thể mãn tính: Con vật giai đoạn đầu mắc bệnh thể cấp tính, nếu không chết bệnh sẽ chuyển thành mãn tính, vật bệnh thể hiện viêm ruột mãn tính: lúc ỉa chảy, lúc táo bón, viêm khớp làm cho con vật đi lại khó khăn, viêm phế quản và viêm phổi mãn tính. Bệnh tiến triển trong vài tuần. Con vật có thể khỏi bệnh, các triệu chứng nhẹ dần, nhưng thường con vật rạc và chết do kiệt sức. + Bệnh tích Theo Phạm Sỹ Lăng và Phan Ðịch Lân (2002)15 bệnh tụ huyết trùng trâu bò có những biểu hiện bệnh tích như sau: Tụ huyết và xuất huyết ở các niêm mạc mắt, mồm, mũi. Tổ chức dưới da đều có tụ huyết đỏ sẫm và lấm tấm xuất huyết từng mảng. Thịt màu tím hồng, thấm nhiều nước. Hệ thống hạch lâm ba sưng to, thủy thũng và xuất huyết, rõ nhất là hạch lâm ba sau hầu, vai và trước đùi. Tim sưng to, trong bao tim, màng phổi, xoang ngực và xoang bụng đều có tương dịch. Nếu con vật bị bệnh thể đường ruột thì thấy: chùm hạch ruột sưng to có xuất huyết, niêm mạc ruột tụ huyết, xuất huyết nặng và niêm mạc ruột bị tróc ra. Theo một số tác giả khác thì bệnh tích của bệnh tụ huyết trùng trâu bò có những biểu hiện cụ thể như sau: Bệnh tích chung: Tụ huyết, xuất huyết ở các tổ chức liên kết dưới da. Bắp thịt và niêm mạc lấm tấm xuất huyết, màu hồng tím. Bệnh tích ở ngực: Thủy thũng trong lồng ngực có nước vàng. Màng phổi lấm tấm xuất huyết, viêm phổi, viêm ngoại tâm mạc có nước, viêm tim có chấm xuất huyết. Bệnh tích ở hạch lâm ba: Thủy thũng vùng xung quanh, cắt hạch có nước màu vàng, thủy thũng lan tràn có khi đến ½ cơ thể. Bệnh tích ở bụng: Viêm phúc mạc có nước vàng, thủy thũng, xuất huyết ở các phủ tạng. 1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh Theo thuật ngữ của Louis Pasteur dùng từ năm 1885 thì “vắc xin” dùng để chỉ một chế phẩm sinh học được chế từ vi sinh vật, để gây miễn dịch phòng bệnh truyền nhiễm. Ngày nay không chỉ có vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm mà còn có vắc xin phòng ký sinh trùng, vì vậy thuật ngữ vắc xin được hiểu rộng hơn, đó là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh gọi là kháng nguyên khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra trạng thái miễn dịch giúp cơ thể chống lại mầm bệnh tức kháng nguyên. Theo Van Oirchot (1993)82, tiêu chí để chọn một vắc xin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây: Không được gây phản ứng toàn thân. Có thể gây phản ứn