Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh

MỞ ĐẦU Ở Việt Nam ngành chăn nuôi trâu, bò luôn giữ vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài cung cấp thịt, sữa là 2 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phục vụ cho nhu cầu đời sống của người tiêu dùng, còn cung cấp sức kéo, phân bón cho trồng trọt. Bên cạnh đó, chăn nuôi trâu, bò cũng là nguồn cung cấp các sản phẩm phụ như: da, lông, phủ tạng ... cho ngành nông nghiệp chế biến. Theo thông báo của Cục thống kê (2015) [173] tính tới thời điểm 01/10/2015, đàn trâu cả nước có 2,5 triệu con, tăng 0,1% so với cùng thời điểm năm trước; đàn bò có 5,4 triệu con, tăng 2,5%, riêng đàn bò sữa đạt 275,3 nghìn con, tăng 21%. Song song với sự phát triển của ngành chăn nuôi trâu, bò thì công tác phòng chống dịch bệnh được đặc biệt coi trọng, trước tiên phải nói đến bệnh tụ huyết trùng. Đây là một trong những bệnh truyền nhiễm thường được đánh giá là nguy hiểm đối với trâu, bò hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới. Bệnh gây ốm và chết nhiều trâu, bò làm ảnh hưởng đến sản xuất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Báo cáo tại Hội nghị phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2014 [1] và hội nghị tổng kết năm 2015 và triển khai nhiệm vụ năm 2016 [2] của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết, trong năm 2014 có 26 tỉnh thành có bệnh tụ huyết trùng với 7.682 trâu, bò mắc bệnh, năm 2015 cũng có 26 tỉnh thành báo cáo có bệnh với 7.278 trâu, bò mắc. Chính vì vậy bệnh này luôn được xác định là đối tượng nghiên cứu của ngành Thú y trong những năm qua và những năm tiếp theo. Một số tỉnh miền núi phía Bắc, trong đó có Hà Giang, Cao Bằng, có diện tích tự nhiên rộng chủ yếu là rừng núi, đây là điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôi gia súc, đặc biệt là chăn nuôi trâu, bò. Hiện nay, tổng đàn trâu, bò tỉnh Hà Giang trên 265.000 con và tỉnh Cao Bằng trên 228.000 con. Trâu, bò là nguồn sức kéo quan trọng và nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi. Nhưng do có những đặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội và tập quán chăn nuôi, việc áp dụng kỹ thuật và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi còn hạn chế, đây chính là những nhân tố tạo nên sự tồn tại và phát sinh nhiều ổ dịch tụ huyết trùng, gây thiệt hại trong chăn nuôi. Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3]; năm 2008 tỉnh Hà Giang có 276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu, bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng. Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, sản xuất, sử dụng để tiêm phòng cho đàn gia súc, nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương, do đó mục tiêu khống chế, thanh toán bệnh tụ huyết trùng ở từng tỉnh và trong cả nước vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Ở tỉnh Hà Giang và Cao Bằng hàng năm công tác tiêm phòng được triển khai 2 lần/năm, nhưng do một số địa phương chưa quan tâm nhiều đến công tác tiêm phòng, tuyên truyền vận động chưa tốt, một số người dân chưa thực sự hưởng ứng việc tiêm phòng, số trâu, bò tiêm đủ 2 mũi không đạt nên tỷ lệ tiêm phòng thấp, vì vậy dịch bệnh tụ huyết trùng vẫn thường xuyên xảy ra. Việc phân lập xác định vi khuẩn Pasteurella để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh là cần thiết. Vì vậy việc lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phù hợp cho địa phương có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả công tác kiểm soát, khống chế bệnh. Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh”. * Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng đối với vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng. - Giám định đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa. - Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch, hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùng đang sử dụng cho trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và đề xuất giải pháp, lựa chọn vắc xin phòng bệnh hiệu quả.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH

CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ

HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG

VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, năm 2017

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida 4

1.1.1 Phân loại vi khuẩn 4

1.1.3 Đặc tính sinh hóa 7

1.1.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P multocida 7

1.2 Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P multocida gây ra 18

1.2.1 Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 18

1.2.2 Cơ chế sinh bệnh 18

1.2.3 Đặc điểm dịch tễ học 19

1.2.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 23

1.2.5 Chẩn đoán bệnh 25

1.2.6 Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng 32

1.3 Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng 35

1.3.1 Trên thế giới 35

1.3.2 Ở Việt Nam 39

1.4 Một số kết luận qua phân tích tổng quan 41

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 43

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 43

2.1.2 Nguyên vật liệu 43

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 45

2.2 Nội dung nghiên cứu 45

2.2.1 Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng 45

2.2.2 Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 46

2.2.3 Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà

Giang, Cao Bằng 46

2.3 Phương pháp nghiên cứu 47

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 47

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 50

2.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn P multocida 51

2.3.4 Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P multocida 52

2.3.5 Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR 52

2.3.6 Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng 53

2.3.7 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P multocida phân lập được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng (Carter et al,1995) .54

2.3.8 Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) 54

2.3.9 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin 55

2.3.10 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA (Indirect Haemaglunation Tets) 56

2.3.11 Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau khi tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng (Bain et al, 1982) .57

2.3.12 Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương thế Long, 1996) 59

2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu 59

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao bằng từ năm 2011 - 2015 60

3.1.1 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà Giang và Cao Bằng 60

3.1.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng 62

3.1.3 Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng 64

3.1.4 Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng 67

3.1.5 Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng 68

3.2 Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố độc lực của

các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 71 3.2.1 Phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ tại 2 tỉnh

Hà Giang và Cao Bằng 71

3.2.2 Phân lập vi khuẩn P multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết

trùng tại Hà Giang và Cao Bằng 73

3.2.3 Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P mutocida phân lập được 74 3.2.4 Xác định serotype các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được bằng phản

ứng PCR 77

3.2.5 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 79

3.2.6 Xác định LD50 của vi khuẩn P multocida 84 3.2.7 Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập

được với một số loại kháng sinh và hóa dược 863.3 Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin P52 dạngkeo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang,Cao Bằng 893.3.1 Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin trongvùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương 893.3.2 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùngchủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp 95

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 127

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

AGPT : Agar Gel Precipitin Test (Phản ứng kết tủa trên thạch)

DNA : Deoxyribonucleic acid

BHI : Brain Heart Infusion (Môi trường thạch BHI)

CFU : Colony forming units (Đơn vị khuẩn lạc)

CSY : Casein-sucrose-yeast (Môi trường thạch CSY)

CBPT7 : Chủng P multocida phân lập tại Cao Bằng

cs : Cộng sự

DNT : Dermonecrotic toxin (Độc tố gây hoại tử)

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phương pháp ELISA)FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Liên Hiệp Quốc)GMT : Geometic Mean Titer (Hiệu giá trung bình)

HE : Hemtoxylin Eosin (Phương pháp nhuộm HE)

HS : Haemorrhagic septicaemia (Nhiễm trùng huyết, xuất huyết)

HGXB5 : Chủng P multocida phân lập tại Hà Giang

PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân gen)

PMPT : Passive Mouse Protection Test (Phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột)

RR : Relative Risk (nguy cơ tương đối RR)

SDS : Sodium dodicyl sulphate

TEM : Transport enrichment medium (Môi trường vận chuyển)

TSI : Triple Sugar Iron (Môi trường 3 đường)

THT : Tụ huyết trùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter 14

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại serotype P multocida 16

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype B của vi khuẩn

P multocida 52

Bảng 2.2 Thành phần các chất trong phản ứng PCR 53Bảng 2.3 Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh

(NCCLS – 2014) 55Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò trước khi

tiêm phòng vắc xin 58Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò sau khi tiêm

phòng vắc xin 59Bảng 3.1 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng 60Bảng 3.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài

trâu, bò 62Bảng 3.3 Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ 64Bảng 3.4 Hệ số năm dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng 67Bảng 3.5 Hệ số tháng dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang

và Cao Bằng 69

Bảng 3.6 Phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe 71 Bảng 3.7 Phân lập vi khuẩn P multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi

mắc bệnh tụ huyết trùng 73Bảng 3.8 Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn

P mutocida phân lập được 75

Bảng 3.9 Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn 76

Bảng 3.10 Xác định serotype các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được

Bảng 3.13 LD50 của vi khuẩn P multocida 85

Bảng 3.14 Kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của 87

Bảng 3.15 Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng trong huyết

thanh của trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin 89Bảng 3.16 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò chưa tiêm vắc xin phòng bệnh

tụ huyết trùng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 91Bảng 3.17 Điều tra tình hình tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò tại

Hà Giang và Cao Bằng 93Bảng 3.18 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời

điểm 1 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng 96Bảng 3.19 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời

điểm 3 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng 100Bảng 3.20 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời

điểm 6 tháng sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng 102Bảng 3.21 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đối với từng loại vắc

xin tại các thời điểm 1, 3, và 6 tháng sau tiêm phòng 104Bảng 3.22.Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò sau khi tiêm

vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu 107Bảng 3.23 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đối với vắc xin tụ

huyết trùng nhũ dầu tại thời điểm 9 và 12 tháng sau tiêm phòng 108Bảng 3.24 Kiểm tra hiệu lực của vắc xin đối với trâu, bò sau khi tiêm 1 tháng

bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 110Bảng 3.25 Kiểm tra hiệu lực của vắc xin đối với trâu, bò sau khi tiêm 3 tháng

bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 112Bảng 3.26 Kiểm tra hiệu lực của vắc xin đối với trâu, bò sau khi tiêm 6 tháng

bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 114Bảng 3.27 Kiểm tra hiệu lực của vắc xin tụ nhũ dầu đối với trâu, bò sau khi tiêm 9

và 12 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 116Bảng 3.28 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu

chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và 6 tháng 118Bảng 3.29 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu

chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 9 và 12 tháng 119

Bảng 3.30 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùng keo phèn

chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1,3 và 6 thángbằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng 121

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn P.multocida (Viện Thú y Quốc gia)

51Hình 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò

tại tỉnh Cao Bằng 63Hình 3.2 Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò

tại tỉnh Hà Giang 63Hình 3.3 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông –

Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Hà Giang 66Hình 3.4 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông –

Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Cao Bằng 66Hình 3.5 Diễn biến tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà

Giang và Cao Bằng 70Hình 3.6 Thử phản ứng lên men đường 76 Hình 3.7 Phản ứng sinh Indol 77

Hình 3.8 Phản ứng PCR xác định serotype của các chủng vi khuẩn P.

multocida phân lập được 79

Hình 3.9 Thử độc lực trên chuột 81

Hình 3.10 Dung quang khuẩn lạc chủng vi khuẩn P multocida phân lập

được 83Hình 3.11 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P multocida

phân lập được 88Hình 3.12 Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc

xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Cao Bằng 103Hình 3.13 Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc

xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Hà Giang 103Hình 3.14 Tỷ lệ trâu, bò được bảo hộ sau tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin

keo phèn chủng P52 122

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam ngành chăn nuôi trâu, bò luôn giữ vai trò quan trọng trong sảnxuất nông nghiệp Ngoài cung cấp thịt, sữa là 2 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡngcao phục vụ cho nhu cầu đời sống của người tiêu dùng, còn cung cấp sức kéo, phânbón cho trồng trọt Bên cạnh đó, chăn nuôi trâu, bò cũng là nguồn cung cấp các sảnphẩm phụ như: da, lông, phủ tạng cho ngành nông nghiệp chế biến Theo thôngbáo của Cục thống kê (2015) [173] tính tới thời điểm 01/10/2015, đàn trâu cả nước

có 2,5 triệu con, tăng 0,1% so với cùng thời điểm năm trước; đàn bò có 5,4 triệucon, tăng 2,5%, riêng đàn bò sữa đạt 275,3 nghìn con, tăng 21% Song song với sựphát triển của ngành chăn nuôi trâu, bò thì công tác phòng chống dịch bệnh đượcđặc biệt coi trọng, trước tiên phải nói đến bệnh tụ huyết trùng Đây là một trongnhững bệnh truyền nhiễm thường được đánh giá là nguy hiểm đối với trâu, bò hiệnnay ở Việt Nam và trên thế giới Bệnh gây ốm và chết nhiều trâu, bò làm ảnh hưởngđến sản xuất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi Báo cáo tại Hộinghị phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2014 [1] và hội nghịtổng kết năm 2015 và triển khai nhiệm vụ năm 2016 [2] của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển nông thôn cho biết, trong năm 2014 có 26 tỉnh thành có bệnh tụ huyếttrùng với 7.682 trâu, bò mắc bệnh, năm 2015 cũng có 26 tỉnh thành báo cáo có bệnhvới 7.278 trâu, bò mắc Chính vì vậy bệnh này luôn được xác định là đối tượngnghiên cứu của ngành Thú y trong những năm qua và những năm tiếp theo

Một số tỉnh miền núi phía Bắc, trong đó có Hà Giang, Cao Bằng, có diện tích

tự nhiên rộng chủ yếu là rừng núi, đây là điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôigia súc, đặc biệt là chăn nuôi trâu, bò Hiện nay, tổng đàn trâu, bò tỉnh Hà Giangtrên 265.000 con và tỉnh Cao Bằng trên 228.000 con Trâu, bò là nguồn sức kéoquan trọng và nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi Nhưng do có nhữngđặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội và tập quán chăn nuôi, việc áp dụng kỹ thuật

và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi còn hạn chế, đây chính là những nhân tốtạo nên sự tồn tại và phát sinh nhiều ổ dịch tụ huyết trùng, gây thiệt hại trong chănnuôi Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kếtquả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3]; năm 2008 tỉnh Hà Giang có

276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu,

bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng

Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùngtrâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, sản xuất, sử dụng để tiêm phòng cho đàn

gia súc, nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương, do đó mục tiêukhống chế, thanh toán bệnh tụ huyết trùng ở từng tỉnh và trong cả nước vẫn còngặp nhiều khó khăn Ở tỉnh Hà Giang và Cao Bằng hàng năm công tác tiêm phòngđược triển khai 2 lần/năm, nhưng do một số địa phương chưa quan tâm nhiều đếncông tác tiêm phòng, tuyên truyền vận động chưa tốt, một số người dân chưa thực

sự hưởng ứng việc tiêm phòng, số trâu, bò tiêm đủ 2 mũi không đạt nên tỷ lệ tiêmphòng thấp, vì vậy dịch bệnh tụ huyết trùng vẫn thường xuyên xảy ra Việc phân

lập xác định vi khuẩn Pasteurella để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra

quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xinphù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh là cần thiết Vì vậyviệc lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phù hợp cho địaphương có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả công tác kiểm soát, khống chế bệnh Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài

“Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella

multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh”.

* Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng đối

với vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao

Bằng

- Giám định đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella

multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa.

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch, hiệu lực của vắc xin tụ huyết trùngđang sử dụng cho trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và đề xuất giải pháp, lựa chọnvắc xin phòng bệnh hiệu quả

* Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, serotype kháng nguyên, yếu tố

độc lực, và sự lưu hành của vi khuẩn P multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò

tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng

- Bổ sung tư liệu khoa học về hiệu lực bảo hộ của vắc xin khi thử thách với

chủng vi khuẩn P multocida cường độc phân lập được; làm tiền đề cho việc lựa chọn vắc xin thương mại phù hợp, cũng như tuyển chọn chủng vi khuẩn P multocida thích

hợp, ổn định kháng nguyên cho việc phát triển vắc xin nội địa để phòng bệnh tụ huyếttrùng tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam

* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở

cho việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại hai tỉnh Hà Giang,Cao Bằng

- Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụhuyết trùng tại thực địa là cơ sở thực tiễn để các nhà khoa học tiếp tục nghiêncứu thay đổi công nghệ chế tạo vắc xin theo hướng tăng cường sự an toàn, đồngthời kéo dài thời gian bảo hộ, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh, góp phần nâng cao hơnnữa hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu, bò

- Kết quả đề xuất lựa chọn vắc xin phòng bệnh thích hợp tại địa phương giúpcho cơ quan thú y và người chăn nuôi tại Hà Giang, Cao Bằng nói riêng và các tỉnhmiền núi phía Bắc nói chung rà soát, điều chỉnh kế hoạch sử dụng vắc xin thíchhợp, đạt tỷ lệ miễn dịch bảo hộ cao ở trâu, bò sau khi tiêm phòng

* Những đóng góp mới của đề tài

- Việc sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ trâu bò

mắc bệnh để xác định độ dài đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắc xin phòng bệnh

đã cho thấy sự tương đồng giữa chủng vi khuẩn sản xuất vắc xin thương mại vớichủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng tại thực địa Đây là đóng góp mới có ýnghĩa khoa học và thực tiễn trong việc lựa chọn vắc xin đồng bộ về tính khángnguyên với chủng vi khuẩn lưu hành tại địa phương để tiêm phòng cho trâu, bò

- Sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng

trâu bò phân lập được để đánh giá hiệu lực của vắc xin phòng bệnh tụ huyếttrùng sản xuất trong nước là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc chọngiống chuẩn đáp ứng yêu cầu sản xuất vắc xin phòng bệnh phù hợp ở các tỉnhmiền núi phía Bắc Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida

1.1.1 Phân loại vi khuẩn

Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn P multocida thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae,

giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida.

1.1.2 Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Pasteurella multocida (P multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực

khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thểđứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không

có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thínghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuậnlợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơncho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86]

P multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen.

Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P multocida có thể thấy khi nhuộm bằng

xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phânlập từ con vật mới chết Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tínhchất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45] Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹthuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa chothấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực

Vi khuẩn P multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường

nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta chothêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau Peter và cs(1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc

tố và không sinh độc tố của P multocida Môi trường này gồm có 17 thành phần,

trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide,pantothenate, thiamine Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môitrường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không

sinh độc tố như lúc đầu Warner S (1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM(Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng Môitrường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các

loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm khác, cũng như các loại nấm Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P.

multocida từ gia súc mắc bệnh Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất

cho sự sinh trưởng của P multocida là môi trường dextrose-starch agar và

casein-sucrose-yeast (CSY) Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sửdụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã

loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P multocida Vi khuẩn P multocida phát

triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môitrường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton,hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129]

Vi khuẩn P multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy

đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI Trong môi

trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P multocida mọc tốt,

làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ởpha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael et al, 2002) [112] Theo Seleim

(2005) [150], để vi khuẩn P multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần

thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ,nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường Trong đó leucin tác dụng kích thíchtăng trưởng Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trìnhtrao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155] Hussain và

cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P multocida trên các nguồn

cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn

carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin.

Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thíchhợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào TrọngĐạt, 1994) [8] Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đãlàm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm QuangThái, 2004) [43] Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi

trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P multocida trong hệ thống lên

men kín từng mẻ vắc xin

P multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc Theo Namioka và Murata (1961)

[121], trên môi trường thạch huyết thanh P multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:

+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và

Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triểnmạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạchthường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng.Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm đểchẩn đoán

Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn,

có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kínhvới độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xungquanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng Khuẩn lạc dạng S có dungquang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M

không có đặc điểm nói trên Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P multocida có

liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhấtđịnh có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94]

Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnhquang của khuẩn lạc khác nhau:

+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kimloại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màuvàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phátquang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent) Khuẩn lạc nhỏ tròn trong.

Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của

vi khuẩn P mutocida Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P multocida

có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156] Rimler (1992) [141] cho

rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P multocida tập trung ở hai dạng chính Khuẩn lạc

dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh Dung quang củakhuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn Vi khuẩn có dung quang sắc cầuvồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấptính Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thườnggặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương

1.1.3 Đặc tính sinh hóa

P multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose,

galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose Dương tínhvới phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase Phản ứng urease âm tính, không mọctrên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6])

Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P multocida dương tính với phản

ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose,galactose, fructose và mannitol

Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P.

multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase,

catalase, sinh Indol Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose,không lên men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứngurease và citrate, vi khuẩn không di động

1.1.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P multocida

1.1.4.1 Yếu tố độc lực

* Kháng nguyên

Kháng nguyên P multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng

nguyên cũng luôn thay đổi Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân

bố kháng nguyên P multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin Cho đến

nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P multocida có 3 loại là:

Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP(outer membrane protein)

- Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không

gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R Kháng nguyên K bao bọc xung quanhthân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếpxúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O Thành phần và cấu trúc kháng nguyên Kkhá phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ.Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide Kháng nguyênprotein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh Kháng nguyên protein

đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tốmiễn dịch quan trọng

Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém.Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo

hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc Thành phần polysaccharide chínhtrong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner et al, 1992) [143] Ngượclại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồmarabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và

cs, 2000) [67]

- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P multocida có kháng nguyên thân là phức

hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịchphenol và siêu âm Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch.Namioka và Murata (1964) [122] là những người đầu tiên phát triển kỹ thuậtđịnh type kháng nguyên thân Sau khi bộc lộ kháng nguyên thân bằng xử lý tế bào

vi khuẩn với acide HCl và cho ngưng kết với kháng huyết thanh thỏ Sử dụng kỹthuật này các tác giả đã xác định được 11 kháng nguyên thân Price và Smith (1966)[134] dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 - 16 Sau khi nhuộm đỏ thiazine, xử lý nhiệt vàenzyme, tác giả xác định được 6 trong 16 kháng nguyên O là protein Tiếp đếnHeddleston và cs (1972) [95], đã sử dụng phản ứng kết tủa trên thạch để định loạikháng nguyên thân Để thực hiện phản ứng này, tác giả đem tế bào vi khuẩn xử lý ởnhiệt độ 100 °C/1 giờ, sau đó thu lấy huyễn dịch, kháng huyết thanh được chuẩn bịqua gà, bằng phương pháp này đã phát hiện có 16 kháng nguyên thân

Johnson và cs (1989) [102], phát hiện được một kháng nguyên O là protein

với hơn 40 chuỗi polypeptit trong một chủng P multocida gây bệnh Khi mở rộng

nghiên cứu 14 chủng gây bệnh trên các loài vật từ những vùng khác nhau, cũng chokết quả tương tự Tuy nhiên qua phân tích, tác giả cho rằng không có một protein

nào đặc trưng cho những chủng P multocida phân lập từ bệnh tụ huyết trùng, mà chỉ

có một chuỗi polypeptit chính (27kDa) được coi là chung cho những chủng phân lập.Các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên

O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O Những chủng

vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O.Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng, kháng nguyên O đóng vai trò quan trọngtrong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng,1994) [39]

- Protein màng ngoài (Outer membrane proteins – OPM): kháng nguyên

màng ngoài gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầuhết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó) Một trong nhữngprotein độc tính quan trọng của protein màng ngoài này là protein gắn huyết cầu

tố (hemoglobin-binding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên mànghemoglobin Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giảitrình tự (Seleim, 2005) [150]

Ba loại protein màng ngoài đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi

được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III Sự khác biệt nàyđược phân loại dựa trên cấu trúc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (W) của khángnguyên này, khối lượng phân tử dao động trong khoảng giữa 28 kDa và 40kDa

Protein H của P multocida có các đặc điểm tương tự protein xuyên màng của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, giống các peptidoglycane, kháng trypsine,

kháng dung dịch SDS (sodium dodicyl sulphate) Hơn nữa protein H phức hợp vớilipopolysaccharide khi gây đáp ứng miễn dịch Mặc dầu không thể phát hiện ra mốiquan hệ giữa độc tính của các chủng với protein màng ngoài, song OMP type I cóđộc tính cao với lợn và gây ra viêm teo mũi truyền nhiễm ngược lại OMP type II vàIII ít độc tính hơn Protein OmpA và OmpH cho thấy sự không đồng nhất đáng kể,

ít nhất là giữa các chủng P multocida ở gia cầm, một số các biến thể khác nhau có

liên quan tới các loại kháng nguyên cụ thể B, D, F (Davies et al, 2003) [81] Mộtkháng nguyên bề mặt khác đã được xác định là một protein kết hợp 39-kDa (Cp39)

xuất hiện trong các chủng P multocida ở gia cầm, chủng P-1059 (serotype A: 3) và

X-73 (serotype A: 1) (Sthitmatee et al, 2008) [157] OmpH và Pasteurellalipoprotein E (PlpE) là các kháng nguyên trên bề mặt có sức đề kháng cao có liên

quan đến P multocida serotype A: 1, A: 3, và A: 4 thu thập từ những cá thể bò bị

xuất huyết nặng (Wu et al, 2007 [171]; Okay et al, 2012 [130])

Kháng nguyên của P multocida rất phức tạp, xét về quan hệ hoá học, các kháng nguyên protein và lipopolysaccharid của P multocida có vai trò chính trong

quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên làpolysaccharid đóng vai trò hỗ trợ

* Giáp mô của vi khuẩn P multocida

Giáp mô là lớp vỏ nhày bao bọc ngoài tế bào, được sinh ra ở điều kiện nhấtđịnh trong quá trình sinh trưởng Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sựthực bào và các tác động có hại của môi trường Giáp mô cũng là nơi dự trữ chấtdinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời là yếu tố độc lực của vi khuẩn, vi khuẩn có giáp

mô thường có độc lực cao Carter (1955) [70] cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 37 oCtrong môi trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn phát triển giáp mô đầy đủ,sau đó mất dần đi Điều này chứng tỏ giáp mô chỉ tồn tại ở những vi khuẩn mớiphân lập từ gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong thời gian ngắn Vi khuẩn phânlập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và có độc lực,khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vikhuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực (Carter, 1967) [72] Nhưng nếu cấynhững vi khuẩn đã mất giáp mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền quađộng vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực

Đặc tính kháng nguyên giáp mô của P multocida xác định theo type huyết thanh A,

B, D, E và F (Wilson et al, 1992) [168] Giáp mô của chủng type A được cấu tạo bởi axithyaluronic và polysaccharide Axit hyaluronic không bị thực bào phát hiện do nó không có

tính miễn dịch, nhưng khi tinh chế kháng nguyên K của P multocida serotype A có một

protein (300kDa) có thể ức chế đại thực bào của bò (Seleim, 1993) [149]

Theo Seleim (2005) [150], khi tiến hành loại bỏ axit hyaluronic của giáp môthì không những vi khuẩn giảm khả năng bám dính với tế bào vật chủ mà còn dễdàng bị thực bào phát hiện Tác giả cho rằng, giáp mô là thành phần rất quan trọng

trong việc xác định nhóm huyết thanh (serotype) của P multocida.

* Độc lực của vi khuẩn

Độc lực của P multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế kỷ 20, Baldrey đã

nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có

độc tính của lipopolysaccharide Các nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P.

multocida trên thế giới cho thấy độc lực của vi khuẩn này không ổn định, nó thay

đổi tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh, cấy chuyển nhiều lầntrong môi trường nhân tạo độc lực của nó cũng yếu đi

Nghiên cứu của Ramdani và cs (1990) [137] cho thấy, một trong những chủng

P multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404 thuộc

serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/chuột sau 18 giờ chuột

đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết

Diallo và cs (1995) [87] nghiên cứu độc lực của 9 chủng P.multocida phân lập

được thuộc serotype A tại Australia, trong 9 chủng này có 3 chủng không chứa plasmidnhưng rất độc với chuột, tiêm liều 100 CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trongvòng từ 10-24 giờ, trong khi đó có 3 chủng phân lập có chứa 1 plasmid và 3 chủng

có chứa 2 plasmid lại không có khả năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn

Chung và cs (2001) [79] cũng tiến hành đánh giá độc lực của vi khuẩn P multocida

chủng X-73, PBA 930 và PBA 954 thuộc serotype A trên chuột và gà Độc lực củachủng X-73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia, đối với chuột thì độc lực của chủngPBA 930 là thấp nhất

Borrathybay và cs (2003) [66] đã nghiên cứu sự liên quan giữa vỏ và độc lực của

vi khuẩn P multocida type A dưới kính hiển vi điện tử bằng kỹ thuật đánh dấu thấy: vi khuẩn P multocida chủng PM-18 và X-73, độ dày trung bình của vỏ lần lượt là 91,4 và

50,4nm, hai chủng này có độc lực cao Hai chủng PM-1 và PM-3, độ dày trung bìnhcủa vỏ chỉ là 21,0 và 29,8 nm nên có độc lực thấp hơn Tuy nhiên cũng có ngoại lệ nhưchủng P-1059, độ dày trung bình của vỏ lên tới 101,2 nm nhưng chỉ có độc lực trungbình Độ dày trung bình của vỏ vi khuẩn tùy thuộc vào số lượng protein kháng nguyên39kDa, số lượng protein này càng nhiều thì vỏ vi khuẩn càng dày

Khả năng xâm nhập và nhân lên trong cơ thể vật chủ được tăng cường bởi sựhiện diện của kháng nguyên và polysaccharide đó là một trong những yếu tố độc lựcquan trọng nhất đối với loài này (Wilkie et al, 2012) [169]

Hoàng Đăng Huyến (2004) [23] nghiên cứu độc lực của vi khuẩn bằngphương pháp kiểm tra dung quang của khuẩn lạc và thử độc lực trên chuột, thấy100% số chủng thử nghiệm đều giết chết chuột trong vòng 5-10 giờ, kiểm tra dungquang khuẩn lạc thấy có ánh xanh lơ, điều đó khẳng định độc lực của các chủng vikhuẩn phân lập được là rất cao Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3] khi thử độc lực

của các chủng P multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Hà Giang, Cao

Bằng thấy các chủng đều có độc lực cao gây chết chuột từ 80 – 100% trong vòng 48giờ sau khi công cường độc Cù Hữu Phú và cs (2014) [36] kiểm tra độc lực của 10

chủng P multocida, thấy cả 10 chủng đều có độc lực mạnh, có khả năng gây chết

chuột trong vòng 16 – 32 giờ sau tiêm Hoàng Văn Khoản và cs (2015) [24] kiểm

tra dung quang khuẩn lạc của giống vi khuẩn P multocida sản xuất vắc xin chủng

N41, thấy khuẩn lạc có dung quang đặc trưng, màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm phầnlớn diện tích bề mặt khuẩn lạc, phần diện tích khuẩn lạc còn lại có màu vàng da camchứng tỏ vi khuẩn có độc lực cao

Độc lực của P multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng

vi khuẩn và loài vật kí sinh Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P multocida các tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do P multocida gây ra người ta tìm

thấy dấu hiệu tác động của độc tố

* Độc tố của vi khuẩn P multocida

Độc tố của P multocida là chất phân bào mạnh, có khả năng hoạt hóa men

phospholipase C beta Độc tố này cũng thúc đẩy hoạt động của RhoA và tác động tớicác protein nhóm G như: G alpha (q), G alpha (12/13) (Orth et al, 2005) [131]

Theo Blocker và cs (2006) [64], độc tố P multocida còn có khả năng tái tạo

polymeractin, làm thay đổi hình thái tế bào dendrite (Dendritic cells), làm cản trở sựxâm nhập của tế bào này vào các hạch lympho trong quá trình đáp ứng miễn dịch đối

với bệnh tụ huyết trùng Tuy nhiên độc tố của P multocida không ảnh hưởng tới sự ẩm

bào của các đại thực bào (macropinocylosis)

Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một

số chủng P multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của

những độc tố này tương đối giống nhau Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có

độc tố bản chất là protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chấtprotein của serotype E.

- Nội độc tố (Lipopolysaccharide): Lipopolysaccharide là yếu tố độc lực chính

và nó còn đóng một vai trò chủ yếu trong việc gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò

Nội độc tố được sinh ra bởi các chủng P multocida, kể cả chủng có độc lực và

không có độc lực, Heddleston và cs (1972) [95] đã chứng minh nội độc tố được gắn

kết lỏng lẻo và có thể rửa trôi khỏi tế bào vi khuẩn P multocida bằng dung dịch nước muối có formalin và khi được làm lạnh Nội độc tố của P multocida có thể

chiết xuất được bằng acid trichloroacetic theo qui trình của Boivin Khi tiến hànhnghiên cứu lipopolysaccharide của các chủng có nguồn gốc từ các ký chủ khác nhau

cho thấy chúng khá giống với nội độc tố của Enterobacteriacae.

Lipopolysaccharide là thành phần quan trọng giúp xác định kháng nguyên thân, khitiến hành điện di cho thấy lipopolysaccharide có khối lượng phân tử rất thấp Bằng

phương pháp này cũng cho thấy lipopolysaccharide của P multocida ngắn hơn của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và S typhimurium (Horadagoda et al,

2001) [96] Lipopolysaccharide được xác định có khả năng kích thích giải phóngTNF-a từ đại thực bào phế nang phổi bò và nhiều yếu tố gây hoại tử khác,interleukine đã được giải phóng và cắt ngang bởi chất gây gián phân hoạt hóa củanội độc tố, dẫn đến rối loạn hoạt động của tế bào (Lax and Thomas, 2002) [109] Các

chủng P multocida thuộc type D gây viêm teo mũi sau khi tiến hành điện di phát hiện

thấy có ít nhất 6 loại lipopolysaccharide đồng nhất với protein màng ngoài

Vi khuẩn P multocida được nuôi cấy trên môi trường thạch tới 72 giờ sẽ sinh nhiều độc tố hơn Nội độc tố của vi khuẩn P multocida chỉ xuất hiện trong huyết thanh

của những con vật bị bệnh nặng từ 3 - 5 giờ trước khi chết với những triệu chứng nhưgiảm nhiệt độ, run rẩy… (Horadagoda et al, 2001) [96]

- Ngoại độc tố (Exotoxin): Ngoại độc tố là sản phẩm của giáp mô P.

multocida, đặc biệt là của các chủng thuộc type D Yếu tố này là nhân tố gây hoại tử

niêm mạc (dermonecrotic toxin - DNT) Gen toxA qui định tổng hợp dermonecrotic toxin có chiều dài 4,381 bp, nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30 °C thì hoạt tính của gene toxA

này bị giảm nhiều và lượng độc tố DNT sinh ra cũng ít đi (Hunt et al, 2000) [98] Khitiến hành tinh chế độc tố hoại tử niêm mạc cho thấy nó là một protein khoảng112kDa - 160 kDa và có thể phát hiện được thông qua phá vỡ tế bào bằng siêu âm

và tách ra từ dịch nuôi cấy (Seleim, 2005) [150]

Viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn chủ yếu do tác động của DNT trên tế bàoxương mũi, gây viêm teo mũi ở lợn (Lax and Grigoriadis, 2001 [ 108], Rubies et

al, 2002 [144])

* Serotype của vi khuẩn P multocida

Năm 1943 Little và Lyon [110] đã tìm cách phân loại serotype vi khuẩn P.

multocida nhưng không thành công Roberts (1947) [142] đã dựa trên phản ứng

chéo bảo hộ trên chuột để phân loại Tác giả dùng kháng huyết thanh chuẩn bị trên

thỏ để bảo vệ chuột khi công cường độc bằng các chủng P multocida khác nhau,

trên cơ sở chuột được bảo hộ, chia vi khuẩn này thành 4 type là I, II, III và IV, đây

là hệ thống phân loại đầu tiên được công nhận Kể từ đó tất cả các chủng gây bạihuyết, xuất huyết độc lực cao được xếp vào Roberts type I, các chủng phân lập được từtrâu, bò thuộc type I Điều này giúp ích khá nhiều cho việc phát hiện các chủng độclực cao

Tiếp đó, Carter sử dụng phản ứng kết tủa (Carter, 1952) [68] và phản ứngngưng kết hồng cầu gián tiếp (Carter, 1955) [70], xác định được 4 serotype (được

ký hiệu là A, B, C, D) Phản ứng ngưng kết hồng cầu này được thực hiện trên tế bàohồng cầu người nhóm O, thành phần tách từ màng tế bào này được chuẩn bị bằng

cách đun tế bào sống P multocida ở 56 °C/30 phút, loại bỏ tế bào bằng ly tâm sau

đó thu lấy dịch nổi phía trên Dựa trên phản ứng này, tác giả đã phân loại P.

multocida thành 4 loại kháng nguyên vỏ là A, B, C và D Các chủng gây bại huyết,

xuất huyết theo cách phân loại của Carter chủ yếu thuộc type B

Bảng 1.1 Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter

Type theo Roberts I, II, III I IV

-Khi nghiên cứu vi khuẩn phân lập từ vụ dịch bại huyết, xuất huyết trâu, bò trongcác ổ dịch ở châu Phi, Carter (1961) [71] thấy rằng, chúng không thuộc bất kỳ mộttype nào đã phân loại, mặc dù chúng có nhiều mối tương quan với type B Tác giả đã

đề xuất thành lập một nhóm mới đặt tên là type E Sau này, đến năm 1963 Carter thấyrằng type C không đủ các điều kiện cho hình thành một nhóm, vì vậy type C đã bịloại bỏ Rimier và Rhoades (1987) [140] sử dụng phương pháp ngưng kết hồng cầugián tiếp của Carter và phát hiện một type mới được phân lập từ gà tây đặt tên là type

F Cho đến nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định kháng nguyên

vỏ của P multocida

Hiện nay hệ thống phân loại được chấp nhận rộng rãi nhất là sự kết hợp hệthống phân loại kháng nguyên vỏ của Carter và kháng nguyên thân của Heddleston.Theo hệ thống phân loại này các chủng gây bại huyết, xuất huyết cho trâu, bò ởChâu Á và Châu Phi lần lượt là serotypes B:2 và E:2 Có 2 chủng thuộc type Bkhông gây bại huyết, xuất huyết là các chủng B:3,4 có nguồn gốc từ Australia (cácchủng này được phân lập từ vết thương của bò), nhưng sau đó thấy rằng các chủng này

có liên quan tới dịch tụ huyết trùng bò ở Bắc Mỹ và hươu, nai ở Anh

Hệ thống phân loại kết hợp của Namioka - Carter cũng được sử dụng Theo cáchphân loại này chỉ có hai type (6 và 11) thuộc những chủng kháng nguyên vỏ type B vàtype E, chỉ có một type duy nhất là type kháng nguyên thân 6 thường gây bệnh 6:B ởchâu Á và 6:E ở châu Phi Cũng theo hệ thống phân loại này thì ở Australian chỉ cóchủng 11:B

Cả hai hệ thống phân loại của Carter - Heddleston và Namioka - Carter đềuđược sử dụng trong các nghiên cứu Song để tránh nhầm lẫn thì theo hệ thống phânloại Carter - Heddleston kháng nguyên vỏ (A, B, D, E, F) sẽ viết trước khángnguyên thân (1 - 16) còn theo hệ thống phân loại Namioka - Carter thì khángnguyên thân (1 - 11) sẽ viết trước kháng nguyên vỏ (A, B, D, E, F) De Alwis(1999) [86], để thuận tiện thì các nhà nghiên cứu thường dùng hệ thống phân loạicủa Carter - Heddleston

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại serotype P multocida

Tác giả Phản ứng dùng Phân loại

* Phân loại theo giáp mô:

Type A, B, C, DType E

Bỏ type CType A, B, C, DType F

* Phân loại theo kháng

AGPTAGPT

Type 1 - 11Type 1 - 16Type 1 - 16Type 1 - 16

Nguồn: De Alwis (1999) [86] 1.1.4.2 Yếu tố không phải độc tố

* Sức đề kháng của vi khuẩn P multocida

Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2009) [19], vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêudiệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường Vi khuẩn bịdiệt khi đun ở 58 oC trong 20 phút, 80 oC trong 10 phút, 100 oC chết ngay Ánh nắngmặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày Trong tổ chức củađộng vật bệnh bị thối nát, vi khuẩn sống được 1 – 3 tháng

Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lựctrong vòng 5 – 9 ngày Trong tuỷ xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngàysau khi con vật chết Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuỷ xương.Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút Vi khuẩnsống khá lâu và sinh sản trong đất ẩm, thiếu ánh sáng có nhiều muối nitrat vàchất hữu cơ Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàngtháng có khi hàng năm

* Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn P multocida

Các nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P multocida đã

được một số tác giả công bố Jeffrey và cs (1994) [100] đã nghiên cứu tình trạng giatăng kháng kháng sinh tại các nước châu Âu (1988 - 1992) cho thấy, tổng số 880 chủng

vi khuẩn P multocida hầu như đều kháng với ampicilin, tetracyline, erythromycin, và sulfamethazine Wassenaar và Silley (2008) [166] cho biết, vi khuẩn P multocida

kháng lại các loại thuốc streptomycin, tetracycline, oxacillin và trimethoprim

Azmat và cs (2013) [59] kiểm tra sự nhạy cảm kháng sinh của Pasteurella

multocida bằng phương pháp đĩa khuếch tán thấy vi khuẩn này kháng lại các kháng

sinh augmentin, amoxicillin và aztreonam Rabia Durrani và cs (2013) [136], kiểm

tra khả năng kháng thuốc của vi khuẩn P multocida thu thập từ các thành phố khác

nhau ở Pakistan thấy vi khuẩn kháng lại ciprofloxacin, neomycin, ofloxacin vànorfloxacin

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trương Văn Dung và cs (2000) [5] cho biết,

hiện tượng kháng thuốc (kháng kháng sinh) của vi khuẩn P multocida là không

giống nhau ở một vài địa phương phía Bắc Cần phải có kế hoạch nghiên cứu vấn

đề này để xây dựng phác đồ điều trị thích hợp cho từng địa phương Nguyễn

Đình Trọng (2002) [52] kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của 31 chủng P.

multocida phân lập tại Bắc Kạn, có 83,87% các chủng vi khuẩn kháng lại với

penicilline, streptomycine 32,26%, ampicilline 19,35%, chlortetracycline 12,9%

và 9,67% với furazolidone Kết quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs(2010) [3] cho biết, vi khuẩn đã kháng lại colistin (25%), neomycine (21,4%),spectinomycine và trimethoprim (17,8%), ampicilline (14,2%), gentamycine(7,1%) Trương Quang Hải và cs (2012) [11] xác định khả năng mẫn cảm với

kháng sinh của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được ở lợn mắc bệnh

viêm phổi cho biết, vi khuẩn kháng lại với một số loại kháng sinh như neomycin(70,0%), penicillin G (65,0%) và tetracyclin (60,0%)

Mặc dù kháng kháng sinh không được coi là một yếu tố độc lực, song khả

năng kháng kháng sinh của P multocida là một nguyên nhân làm tăng quá trình gây

bệnh Khi chưa tìm ra phương pháp hiệu quả chống khả năng kháng thuốc, ta cầnphải tăng nồng độ thuốc hoặc phối hợp nhiều thuốc mới có khả năng làm giảm tỷ lệ

kháng thuốc của vi khuẩn P multocida.

1.2 Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P multocida gây ra

1.2.1 Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Bệnh do vi khuẩn P multocida gây ra thường ở 2 thể chủ yếu là nhiễm trùng

huyết, xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia - HS) và viêm phổi ở bò (BovinePneumonia) Thể viêm phổi ở bò thường gặp tại các nước châu Âu và khu vực Bắc

Mỹ do vi khuẩn P multocida type A gây ra (Frank, 1989) [91] Ở một số nước châu

Á như Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanka bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết ở lợn quan

hệ với serotyp B:2 (Gamage et al, 1995) [93] Chính từ nghiên cứu này, các tác giả

cho rằng, vi khuẩn P multocida serotyp B:2 không chỉ gây bệnh tụ huyết trùng thể

bại huyết ở trâu, bò mà còn là tác nhân gây bệnh cho lợn, bệnh có thể lây truyền từtrâu, bò sang lợn mẫn cảm và ngược lại Benkirane và De Alwis (2002) [62] cho

biết chủng B:2 và E:2 là 2 chủng phổ biến nhất của vi khuẩn P multocida và có liên

quan đến bệnh ở trâu, bò tại nhiều nước châu Á và châu Phi

1.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [28], bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò pháttriển như sau: Bệnh phát sinh ở các vùng nóng ẩm, vào mùa mưa, vi khuẩn có sẵntrong đất, được nước mưa đưa lên mặt đất, dính vào rơm, cỏ và trôi vào các hồ, ao,mương, máng Trâu, bò ăn phải rơm cỏ và uống nước có nhiễm khuẩn sẽ mắc bệnh.Sau khi vào đường tiêu hóa, vi khuẩn qua niêm mạc nhờ các vết xây xát nhỏ dorơm cỏ, xâm nhập vào máu, tiến đến hệ thống lâm ba ruột và hạch sau hầu, thườnghạch sau hầu sưng rất to Từ đó vi khuẩn đi vào hệ thống hạch lâm ba trước vai, trướcđùi làm cho những hạch này sưng và thủy thũng Bởi vậy ta thường thấy trâu, bò bịbệnh tụ huyết trùng có biểu hiện đặc trưng: Sưng hầu mà nhân dân gọi là “bệnh trâuhai lưỡi”

Bình thường một số trâu bò khỏe cũng mang vi khuẩn tụ huyết trùng trong hệthống hô hấp và tiêu hóa Nhưng vi khuẩn không gây bệnh và gia súc có sức đềkháng cao, giữa vi khuẩn và gia súc có sự cân bằng sinh học Khi gặp các yếu tốngoại cảnh bất lợi: Thiếu thức ăn, làm việc nặng, thời tiết thay đổi đột ngột, trâu, bò

bị giảm sức đề kháng, thế cân bằng sinh học bị phá vỡ và vi khuẩn trở nên cườngđộc, gây bệnh cho trâu, bò Một nghiên cứu ở Ấn Độ cho thấy trong điều kiện chănnuôi kém phát triển, đàn trâu, bò được chăn thả tự do trên các đồng cỏ tự nhiên, tạođiều kiện thuận lợi cho dịch bệnh bùng phát (Gajendragad et al, 2012) [92]

1.2.3 Đặc điểm dịch tễ học

1.2.3.1 Nguồn bệnh và phương thức lây lan

Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò, lợn, gia cầm bị bệnh và mang trùng

Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, ở điều kiện nhất định, vi khuẩn P multocida

thường tồn tại ở đường hô hấp trên của vật chủ Khi sức đề kháng của cơ thể giảm,

vi khuẩn tăng độc lực và tác động gây bệnh Tại các ổ dịch cũ, phần lớn những giasúc sống sót sau dịch thường trở thành những con vật mang trùng và thường xuyênbài tiết mầm bệnh ra ngoài ngoại cảnh, những gia súc cảm thụ mới là những trâu, bòmới sinh sau vụ dịch hay gia súc mới nhập đàn chưa có miễn dịch (De Alwis, 1999)

[86] Jalal và cs (2010) [99] nghiên cứu vi khuẩn P multocida phân lập từ trâu, bò

khỏe ở Iran cho thấy, tỷ lệ xuất hiện cao kháng nguyên type B ở gia súc không bịnhiễm bệnh, những trâu, bò này có thể trở thành vật truyền nhiễm tiềm ẩn Annas và

cs (2014) [58] cho biết, sau vụ dịch vi khuẩn sinh sôi trong amidan những cá thể trâusống sót và trở thành vật truyền nhiễm, căn bệnh này có thể lây qua đường hô hấp.Tác giả cũng làm thí nghiệm nhốt các con bê khỏe mạnh cùng với 1 con bê bị nhiễm

P multocida B: 2, những con bê sống sót đã trở thành vật lây nhiễm bệnh Vi khuẩn Pasteurella đã được phát hiện trong đường hô hấp, cơ quan tiêu hóa và đường tiết

niệu của bê, cho thấy vai trò của các cơ quan, bộ phận này trong việc phát tán bệnh.Những nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, ổ dịch đầu tiên trong vùng xảy ra từtrâu, bò của địa phương bị bệnh, do việc giết mổ làm dịch lây lan rộng Dịch thườngxảy ra và lan rộng theo các triền sông do nước bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh (Bùi QuýHuy,1998) [22] Trâu, bò khỏe mạnh mang vi khuẩn ở niêm mạc mũi và hạch hầukhoảng 9 – 12%, khi gặp các điều kiện không thuận lợi, sức đề kháng giảm, bệnh sẽphát sinh giết hại trâu, bò (Phạm Sỹ Lăng và Lê Thị Tài, 2006) [27]

Phan Thanh Phượng (1994) [39] cho biết, trong giai đoạn đầu của bệnh, khicon vật còn đi lại được, vi khuẩn từ nước dãi, phân, nước tiểu được bài ra xungquanh Ổ dịch rộng hay hẹp tùy theo điều kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịchcủa đàn Bệnh có thể trực tiếp lây lan từ súc vật bệnh sang súc vật khỏe thông quatiếp xúc, dùng chung dụng cụ chăn nuôi, nguồn thức ăn, nước uống, nhốt cùngchuồng, chăn cùng bãi chăn thả (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2008) [28] TheoGajendragad và cs ( 2012) [92] dịch bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra giữa nhữngđàn gia súc được chăn thả trên các cánh đồng tự nhiên, cùng uống chung 1 nguồnnước và được nhốt cùng nhau

1.2.3.2 Mùa vụ phát bệnh

Mùa phát bệnh tụ huyết trùng ở các nước Châu Á tập trung vào các tháng vàmùa khác nhau trong năm Lane E P và cs (1992) [107] khi nghiên cứu sự bùng phátdịch tụ huyết trùng tại Zimbabwe đã đưa ra kết luận, bệnh nổ ra suốt mùa mưa trongnhững tháng mùa hè Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiện vào cuối mùa khô, đầumùa mưa (Natalia et al, 1993) [123] Sự ảnh hưởng của mùa vụ tới bệnh cũng đượcxác nhận tại Pakistan (Sheikh et al, 1996) [154] Gajendragad và cs (2012) [92] chobiết, tại Ấn Độ dịch tụ huyết trùng thường xảy ra từ tháng 6 đến tháng 9 (mùa mưa),

vi khuẩn gây ra căn bệnh này là P multocida không thể tồn tại ở môi trường bên

ngoài cơ thể động vật, nếu như không có điều kiện thích hợp Môi trường ẩm ướt đãgiúp kéo dài sự sống ở môi trường bên ngoài cho vi khuẩn, từ đó tạo điều kiện đểdịch bệnh bùng phát Do đó, dịch bệnh dễ xảy ra vào mùa mưa hơn Joyjit và cs(2013) [103] cũng cho biết, dịch bệnh có thể xảy ra bất cứ lúc nào trong năm, nhưngthời điểm thuận lợi nhất để dịch bệnh bùng phát là vào mùa mưa

Ở nước ta bệnh xuất hiện ở khắp nơi, có khi chỉ là những ổ dịch nhỏ, lác đác.Nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm bệnh lây lan thành dịch, bởi nhiệt độ

ẩm của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của mầm bệnh Bùi QuýHuy (1998) [22] cho biết ở miền Bắc bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vàocác tháng mưa nhiều từ tháng 7 đến tháng 9, ở miền Nam, bệnh xảy ra mạnh sau khimưa và nắng từ tháng 4 đến tháng 10 Các tỉnh miền Tây Nam Bộ do khí hậu nóng

ẩm và nhiều đồng lầy nên bệnh xảy ra quanh năm Các tỉnh phía Bắc bệnh thường

có vào mùa mưa, lũ lụt từ tháng 6 đến tháng 12 Hiện nay bệnh hay gặp ở các tỉnhmiền núi như Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Giang, gây nhiềuthiệt hại (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2009) [19]

Bùi Xuân Đồng (2000) [9] khi nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở HảiPhòng cho biết bệnh bắt đầu vào tháng 4, đỉnh cao là tháng 6, 7 Cao Văn Hồng(2001) [21] cho biết, mùa dịch tụ huyết trùng ở Đắc Lắk từ tháng 5 đến tháng 9, đây

là những tháng mưa nhiều Hoàng Đăng Huyến (2004) [23] bệnh tụ huyết trùng xảy

ra ở Bắc Giang từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm, thời gian này đang là mùa mưa

1.2.3.3 Loài vật và tuổi mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú hoang dại và chimđều mẫn cảm với bệnh Nhiều tác giả đã khẳng định, nơi nào có bệnh tụ huyết trùngtrâu, bò thì ở đó người ta cũng phát hiện bệnh này ở động vật hoang dã Theo DeAlwis (1984) [84] loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu

và bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò, từ kết quả nghiên cứu các ổ dịch tụ huyếttrùng trâu, bò ở Sri Lanka tác giả đã khẳng định điều đó Robertson (1999) [54] chobiết, ở châu Á, bệnh xảy ra ở trâu mạnh hơn ở bò, tỷ lệ trâu mắc bệnh có thể gấp 3

lần bò Farooq và cs (2007) [89], khảo sát về bệnh tụ huyết trùng gần đây ở Pakistan

đã cho thấy sự nghiêm trọng của bệnh tụ huyết trùng ở trâu, tỉ lệ số trâu nhiễmkhuẩn lên đến 49% Trâu dễ mắc bệnh và xảy ra thường xuyên hơn ở những nước

có điều kiện chăn nuôi kém phát triển, giám sát dịch bệnh không được tốt (Farooq

et al, 2011) [90] Joyjit và cs (2013) [103] nghiên cứu về một đợt dịch bùng phát ởtrâu, bò tại Ấn Độ thấy, trong số 154 trâu, bò bị bệnh có 132 trâu (85,71%) và 22 bò(14,28%) Trong đó số 52 trâu, bò chết, có 86,53% là trâu và 13,46% là bò Chung

và cs (2015) [80] cho biết trâu là vật chủ nhạy cảm nhất với bệnh tụ huyết trùng

Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết của các loài vật do bệnh tụ huyết trùng phụ thuộcvào rất nhiều yếu tố như mức độ cảm nhiễm của từng cá thể, mức độ bùng nổ củacác vụ dịch trước đó, mức độ miễn dịch toàn đàn, đặc biệt phụ thuộc vào lứa tuổimắc bệnh De Alwis (1984) [84] cho biết, mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnhhơn động vật già Nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ chết của trâu, bò trong mỗi ổ dịch là

84 và 91% tập trung vào lứa tuổi 6 tháng đến 18 tháng Ahrar và cs (2011) [55] nghiêncứu tại Pakistan thấy, tỷ lệ trâu, bò chết nhiều nhất là 8 – 9 tháng tuổi (47,05%), tiếp theo

là trâu bò trên 9 tháng tuổi (29,41%) và từ 6 - 7 tháng tuổi (23,53%) Căn bệnh lâylan trong 10 ngày, đỉnh điểm là ngày thứ 8, khi mà tỉ lệ tử vong lên đến 37% TheoKarimkhani và cs (2011) [105], hầu hết các cá thể mắc bệnh đều có độ tuổi từ 1 đến

2 tuổi, số cá thể đực nhiều hơn số cá thể cái

1.2.3.4 Hiện tượng mang trùng vi khuẩn P multocida ở trâu, bò

Nhiều tác giả nghiên cứu về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng đưa ra nhận xét, có sựliên quan giữa bệnh tụ huyết trùng và tỷ lệ trâu, bò khỏe mang trùng Saharee và cs(1993) [148] khi tiến hành nghiên cứu trên đàn bò Malaysia, thấy tỷ lệ phân lập

hạch sau hầu là 13% Wijewardana và cs (1993) [167] đã kiểm tra 103 hạch Amidan

của trâu, bò từ lò mổ trong vùng có dịch của địa phương và đã phân lập được 49chủngP multocida De Alwis (1999) [86] cho rằng, hết những động vật trưởng

thành có vi khuẩn P multocida ký sinh trong hạch Amidan, theo thời gian nhân lên

rồi di chuyển đến mũi, hầu và tồn tại trong đường hô hấp Những động vật mangtrùng thể ẩn này được coi như là nguồn gây bệnh tiềm ẩn Muhammad Imran và cs

(2007) [117] nghiên cứu tỷ lệ mang trùng P multocida ở trâu, bò nuôi tại tỉnh

Faisalabad, Pakistan thấy, 100 mẫu dịch ngoáy mũi thu được từ trâu sau khi tiếnhành nuôi cấy chỉ có 3 mẫu dương tính (2 mẫu của trâu trên 1 năm tuổi và 1 mẫucủa trâu dưới 1 năm tuổi) Kaan ÖNAT (2010) [104] thu thập mẫu dịch mũi từ 47

bò giống Holstein khỏe mạnh về mặt lâm sàng và không có tiền sử sử dụng thuốc

kháng sinh trước khi lấy mẫu Có 5 mẫu được xác định là M haemolytica và 27 mẫu được xác định là P multocida, trong đó 17 mẫu được lấy từ bò dưới 1 tuổi có

P multocida, 29 mẫu lấy từ bò 2 tuổi trở lên, có 10 mẫu có P multocida và 5 mẫu

có M haemolytica

Tỷ lệ mang trùng ở mũi và hầu liên quan tới các đợt bùng phát bệnh De Alwis

và cs (1986) [85], đã so sánh mối tương quan giữa tỷ lệ mang trùng trong dịchngoáy mũi và sự phân bố hàm lượng kháng thể, trên 3 đàn gia súc trong một vàitháng sau khi bùng phát dịch tụ huyết trùng Tỷ lệ mang trùng biến động theo thờigian và tỷ lệ gia súc dương tính thấp nhất là trong dịch ngoáy mũi từ 12% tới 40%.Theo Saharee và Salim (1991) [147], vi khuẩn bài xuất ra môi trường qua dịch tiếtniêm mạc mũi và là nguyên nhân gây ra các ổ dịch khi gặp stress Tại tỉnh Khouzestan– Iran, Muhammad và cs (2006) [116], phát hiện thấy 4,05% trâu bò khoẻ mangtrùng, ở hiệu giá 1/16 thì có tới 27,12% mẫu huyết thanh của trâu, bò khoẻ ngưng

kết với kháng nguyên P multocida, tác giả còn chứng minh tỷ lệ mang trùng theo

tính biệt là không khác biệt nhiều Sự biến động hàm lượng kháng thể tự nhiên

kháng P multocida giảm dần theo tuổi.

Ở Việt Nam cũng nhiều tác giả nghiên cứu về hiện tượng mang trùng ởtrâu, bò khỏe Nguyễn Thiên Thu (1996) [53] cho biết, tỷ lệ trâu, bò khỏe mangtrùng ở các tỉnh miền Trung và Tây nguyên là 4,47% Cao Văn Hồng (2001)

[21], khi điều tra ở Đắc Lắk cho biết tỷ lệ trâu, bò, lợn khỏe mang P multocida ở

đường hô hấp là 14,79% và 11,61%, sau 6 tháng có dịch tỷ lệ này tăng lên 21%

Nguyễn Đình Trọng (2002) [52] phát hiện thấy P multocida ở 57,52% trâu, bò

khoẻ tại các ổ dịch lâu năm của huyện Chợ Mới, tỉnh Bắc Kạn Hoàng ĐăngHuyến (2004) [23] cho biết, trong tổng số 480 mẫu dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏethu thập được tại tỉnh Bắc Giang, có 108 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ 22,5% Tácgiả cũng kết luận có khả năng đây là nguyên nhân gây nên các ổ dịch tụ huyếttrùng trâu, bò tại chỗ Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3] đã thu thập 387 mẫudịch ngoáy mũi trâu, bò, lợn khỏe trong 2 năm (2008-2009) tại một số nông hộ

trên địa bàn các tỉnh Hà Giang và Cao Bằng, kết quả thu được cho thấy P.

multocida phân lập được từ trâu (chiếm từ 11,1 đến 14,2%), bò (9,6 đến 13,6%),

46 đến 80 giờ, thể bệnh cấp tính thường kéo dài 2 đến 3 ngày, thể quá cấp tính là 4đến 12 giờ Theo Lê Văn Năm và cs (1999) [33], thời kỳ ủ bệnh kéo dài 1 đến 14ngày, bệnh thường ở hai dạng, nhiễm trùng huyết và bội nhiễm Hoàng Đăng Huyến(2004) [23] theo dõi 120 trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại một số xã của huyệnHiệp Hòa - Bắc Giang thấy những con mắc bệnh thể quá cấp tính đều chết trongvòng 24 giờ, ở thể cấp tính thời gian diễn biến của bệnh từ 2 đến 5 ngày, không thấy

có thể mạn tính Theo Trung tâm nghiên cứu UNESCO phổ biến kiến thức văn hóagiáo dục cộng đồng (2005) [41], diễn biến bệnh 3 – 5 ngày, tỷ lệ chết 90 – 100%

Bò bệnh bị nhiễm trùng máu chết rất nhanh trong 1 – 1,5 ngày, nếu bệnh ác tính bò sốtcao 41 oC - 42 oC, hung dữ điên cuồng, đập đầu vào tường, chết nhanh trong vòng 24giờ Tất cả trâu, bò bị bệnh đều thấy có có các dấu hiệu lâm sàng như: bỏ ăn, mệt mỏi

và bồn chồn, 90,74% đàn trâu, bò thở nghe có âm ran Các dấu hiệu lâm sàng khácbao gồm tiết nhiều nước bọt, khó thở, tiết nước mũi nhầy 100% những cá thể đãchết vì nhiễm tụ huyết trùng đều khó thở, tiết nước mũi nhầy, chán ăn, bồn chồn,tiết nhiều nước bọt (Ahrar et al, 2011) [55] Joyjit và cs (2013) [103] cho biết các cáthể bị bệnh có triệu chứng như sốt, giảm sản lượng sữa đột ngột, đau bụng, tiêuchảy nặng, nhiễm trùng đường ruột, nhịp thở nhanh và có màng nhầy tiết ra trước

khi chết Một số cá thể còn bị phù ở đầu, cổ, ức, bị suy hô hấp dẫn đến chết trongvòng 2 - 4 ngày.

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [28], trâu, bò thường mắc bệnh ở 3 thể: quá cấp tính, cấp tính và mạn tính, nhưng thường gặp ở thể cấp tính

- Thể quá cấp tính: trâu bò phát bệnh rất nhanh, con vật đột nhiên lên cơn sốt cao

41 oC - 42 oC và trở nên hung dữ, điên loạn, đập đầu vào tường, chết trong vòng 24h

Bê, nghé 3 – 18 tháng tuổi có triệu chứng thần kinh, giãy giụa, ngã vật xuống rồichết, có khi con vật đang ăn bỗng chạy lồng lên, điên loạn, run rẩy, ngã xuống rồilịm đi (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2009) [19]

- Thể cấp tính: thể này xảy ra phổ biến, thời gian nung bệnh ngắn từ 1 – 3ngày, con vật không nhai lại, mệt lả, bứt rứt, sốt cao đột ngột 40 – 42 oC Niêm mạcmắt, mũi đỏ sẫm rồi tái xám, nước mắt, nước mũi chảy liên tục Các hạch lâm bađều sưng, đặc biệt là hạch lâm ba dưới hầu sưng rất to, làm con vật lè lưỡi ra, thởkhó khăn, người ta thường gọi là ”bệnh lưỡi đòng” hay bệnh ”trâu, bò hai lưỡi”.Hạch lâm ba trước vai, trước đùi sưng, thủy thũng làm cho con vật đi lại khó khăn(Phạm Sỹ Lăng và cs, 2008) [28]

Theo Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tân (2007) [18], vật bệnh thể hiện hộichứng hô hấp, thở mạnh và khó khăn do viêm màng phổi, tràn dịch màng phổi, tụhuyết và viêm phổi cấp Một số trâu bò bị bệnh ở thể đường ruột, lúc đầu táo bónsau đó đi ỉa chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc ruột, bụng chướng to do viêm phúcmạc và có tương dịch trong xoang bụng Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2011)[25], lúc sắp chết con vật nằm liệt, đái ra máu, thở rất khó khăn, có nhiều chấm xuấthuyết đỏ ở các niêm mạc Bệnh tiến triển 3 - 5 ngày, tỷ lệ chết 90 – 100%, nếu bệnhchuyển sang thể nhiễm trùng máu, con vật chết trong 24 – 36 giờ Annas và cs (2014)[58] cho biết, trong hầu hết các trường hợp phát hiện lâm sàng cấp tính, đều dẫn đến

tử vong trong vòng 8 - 24 giờ sau khi bắt đầu

- Thể mạn tính: con vật mắc bệnh ở thể cấp tính, nếu không chết, bệnh sẽchuyển thành thể mạn tính, vật bệnh thể hiện viêm ruột mạn tính: lúc ỉa chảy,lúc táo bón, viêm khớp làm cho con vật đi lại khó khăn, viêm phế quản và viêmphổi mạn tính Bệnh tiến triển trong vài tuần Con vật có thể khỏi bệnh, cáctriệu chứng nhẹ dần, nhưng thường con vật gầy rạc và chết do kiệt sức (Phạm

Sỹ Lăng, 2009) [29]

1.2.4.2 Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể

Kết quả theo dõi của Hoàng Đăng Huyến (2004) [23] tại Bắc Giang cho thấy,bệnh tích chủ yếu là xuất huyết dưới da và các phủ tạng, phổi, tim, ruột, thịt tímthấm nước màu hồng Ahrar và cs (2011) [55] thấy, phần đầu, cổ và vùng hàm dướisung huyết và bị phù nề Các đốm xuất huyết hình thành khắp cơ thể và có thể nhìnthấy máu chảy ra từ khoang ngực và bụng, thận bị sưng lên và sung huyết Có cácđốm xuất huyết ở màng ngoài tim Phổi cũng có sự biến đổi, phổi bị phù nề nặng,khí phế thũng vách phổi

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [28], bệnh tích của bệnh như sau:

Tụ huyết và xuất huyết ở các niêm mạc mắt, mồm, mũi, tổ chức dưới da đều

có tụ huyết đỏ sẫm và lấm tấm xuất huyết từng mảng

Thịt màu tím hồng, thấm nhiều nước

Hệ thống hạch lâm ba sưng to, thủy thũng và xuất huyết, rõ nhất là hạch lâm

ba sau hầu, vai và trước đùi

Tim sưng to, xoang bao tim, màng phổi, xoang ngực và xoang bụng đều cótương dịch (nước vàng)

Nếu con vật bị thể đường ruột thì hạch ruột sưng to, xuất huyết, niêm mạc ruột

tụ huyết, xuất huyết nặng và niêm mạc ruột bị tróc ra

* Bệnh tích vi thể

Khi nhuộm HE (Hemtoxylin Eosin) đối với bệnh phẩm cơ tim thì thấy các sợi

cơ mô liên kết tách rời nhau, có nơi xuất hiện dày đặc hồng cầu hoặc sợi cơ thoáihoá, tại tổ chức mô liên kết có sự hiện diện của các vi khuẩn hình que

Đối với các bệnh phẩm là lách: các mô lympho bị teo, có nhiều tế bào lymphonon, có các điểm hoại tử nhỏ ở phần tuỷ đỏ, hơi phù nề và có các điểm phù mờ với vikhuẩn hình que, tăng sinh các tế bào đại thực bào (Đỗ Tuấn Cương và cs, 2004) [4]

1.2.5 Chẩn đoán bệnh

Để phòng chống có hiệu quả bệnh tụ huyết trùng, việc chẩn đoán chính xác, kịpthời là rất quan trọng Các nhà nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp chẩn đoán sau:

- Chẩn đoán phân biệt

+ Bệnh tụ huyết trùng: dựa vào các triệu chứng điển hình của bệnh như hạchhầu sưng to, có biểu hiện triệu chứng thần kinh, thè lưỡi, mắt đỏ

+ Bệnh nhiệt thán: dễ nhầm với bệnh tụ huyết trùng do con vật chết đột ngộtvới triệu chứng phù thũng Bệnh tụ huyết trùng phù thũng nặng hơn và có triệuchứng tụ huyết, xuất huyết, thịt màu hồng tím Còn bệnh nhiệt thán thấy thịt đen,máu đen đặc khó đông, xuất huyết ở các lỗ tự nhiên

+ Bệnh tiêm mao trùng: cũng gây chết đột ngột và phù thũng nhưng thủythũng có màu hồng, ở bệnh tụ huyết trùng tích nước màu vàng

- Chẩn đoán vi khuẩn học

De Alwis (1999) [86] đã đưa ra phương pháp tốt nhất để phân lập vi khuẩn

là tiêm truyền dưới da cho chuột với lượng từ 0,1 đến 0,2 ml máu hoặc tủy

xương đã được chuẩn bị nuôi cấy Nếu đúng là P multocida gây bệnh tụ huyết

trùng, chuột sẽ chết trong vòng 24 giờ, lấy máu chuột nuôi cấy sẽ cho kết quảthuần khiết Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [45], trong trường hợp bệnhphẩm lấy từ động vật đã chết lâu hoặc lấy không vô trùng thì các tạp khuẩn sẽlấn át và việc phân lập vi khuẩn tụ huyết trùng rất khó Vì vậy, nếu mẫu bệnh

phẩm bị tạp khuẩn thì việc nuôi cấy thuần khiết vi khuẩn P multocida chỉ có thể

đạt được bằng việc tiêm truyền qua chuột

Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2009) [19], bệnh phẩm có thể lấy là máu tim, gan,lách, tủy xương, phổi, dịch thủy thũng Các bước tiến hành như sau:

+ Làm tiêu bản nhuộm gram hoặc Giemsa (nếu là máu) kiểm tra vi khuẩn bằngkính hiển vi

+ Cấy bệnh phẩm vào môi trường nuôi cấy thích hợp, quan sát tính chất mọc

và xác định các phản ứng sinh hóa cần thiết

+ Tiêm động vật thí nghiệm: dùng canh trùng đã có vi khuẩn mọc sau khi nuôicấy bệnh phẩm, tiêm dưới da hoặc phúc mạc cho thỏ, trong vòng 24 – 48 giờ, nếuđúng có vi khuẩn tụ huyết trùng, bệnh sẽ phát ra và giết chết thỏ Mổ khám quan sátbệnh tích

- Chẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch bệnh lý

Ngày nay phương pháp hóa tổ chức miễn dịch (phương pháp miễn dịch bệnhlý) ngày càng được ứng dụng nhiều trong công tác chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng.Phương pháp miễn dịch bệnh lý dùng kháng thể đã được gắn với các chất huỳnhquang hoặc men để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu trong tổ chức Đỗ Tuấn Cương

và cs (2004) [4] cho biết, trong trường hợp gia súc ốm đã được dùng kháng sinh đểđiều trị, có thể sẽ không phân lập được vi trùng, mặc dù kháng nguyên đã thâmnhập vào tổ chức Với phương pháp miễn dịch bệnh lý hoàn toàn có thể chẩn đoánđược Tác giả cũng đưa ra kết luận là có thể dùng phương pháp này để xác định sựphân bố của mầm bệnh gây bệnh tụ huyết trùng sau khi chúng xâm nhập vào cơ thểđộng vật Trương Thị Hồng Hoa và cs (2005) [20] nghiên cứu tách chiết IgG từ

huyết thanh thỏ tối miễn dịch kháng các chủng vi khuẩn P multocida gây bệnh tụ

huyết trùng trâu, bò, có thể sử dụng trong các phương pháp miễn dịch bệnh lý vớimục đích nghiên cứu và chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu, bò Tô Long Thành và

cs (2006) [48] đã sử dụng kháng thể cộng hợp trong phương pháp miễn dịch bệnh lý

để chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu bò như sau:

+ Gây nhiễm cho chuột bằng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò P.

multocida chủng P52, sau khi chuột chết, lấy bệnh phẩm gan Bệnh phẩm gan chuột

được gây nhiễm với vi khuẩn P multocida được coi là đối chứng dương Gan lấy từ

chuột khỏe làm đối chứng âm

Từ bệnh phẩm là gan chuột đối chứng dương và đối chứng âm, chuẩn bị tiêu bản tổ chức học để đánh giá cộng hợp kháng thể của dê kháng IgG của thỏ được gắnvới men peroxydase

khuẩn P multocida ở các loài động vật Hai nghiên cứu đã được tiến hành trên

chuột và bò thí nghiệm, ở chuột thí nghiệm đã có sự tăng lên số lượng bạch cầutrung tính, bạch cầu ái toan, protein trong huyết tương, tiểu huyết cầu, huyết cầu tố,lượng clorua và canxi Ở bò thí nghiệm lại thu được những kết quả khác nhau, hầuhết các chỉ số đều giảm đáng kể, đặc biệt là các tế bào bạch cầu trong nhóm được

điều trị P multocida Giảm số lượng bạch cầu là rất phổ biến ở động vật bị nhiễm

khuẩn cấp tính do những lỗ nhỏ trong tủy xương chứa bạch cầu

- Chẩn đoán huyết thanh học

Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học để xác định serotype của P.

multocida, dựa vào việc xác định kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân của vi

khuẩn Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [45], để khảng định chắc chắn vi

khuẩn P multocida cần xác định serotype phân lập được bằng phản ứng ngưng kết

nhanh trên phiến kính, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu cừu để xác định typekháng nguyên giáp mô và phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch để xác địnhkháng nguyên thân

+ Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính: Đây là phương pháp chẩnđoán thường quy phòng thí nghiệm, dựa vào kỹ thuật của Namioka và Murata(1961) [121] để định type kháng nguyên vỏ

+ Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA: Đây là phương phápđược dùng phổ biến trong chẩn đoán dựa trên kỹ thuật của Carter (1955) [69] đểđịnh type kháng nguyên vỏ

+ Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGPT: Theo phương pháp củaHeddleston và cs (1972) [95] để định type kháng nguyên thân

+ Các phương pháp định type huyết thanh khác:

Phương pháp điện di miễn dịch đối kháng (Counter - Immmuoelectrophoresis):(Carter and Chengapa, 1991) [76].

Phản ứng đồng ngưng kết (Coaglutination test): Để phân biệt giữa type B vàType E gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò (Rimler, 1992) [141]

+ Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Phươngpháp ELISA đang được các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng để chẩn đoán bệnh

tụ huyết trùng vì hiệu quả của phản ứng này Dawkins và cs (1990) [82] khẳngđịnh, phản ứng ELISA đối với bệnh tụ huyết trùng cho kết quả nhanh, chính xác và

là phản ứng chẩn đoán để xác định vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng, nhưng không

thể định type cho P multocida Kỹ thuật ELISA đã áp dụng thành công để kiểm tra miễn dịch và giám định kháng nguyên của vi khuẩn P multocida serotype B:2

(Natalia et al, 1993 [123], Chandrasekaran et al, 1994 [78]) ELISA cũng được báocáo là có độ nhậy gấp 3 đến 5 lần so với phương pháp ngưng kết gián tiếp hồng cầu(Pati et al, 1996 [132], Verma and Jaiswal, 1997 [163]) Theo Trần Xuân Hạnh và

Tô Thị Phấn (2006) [13], kỹ thuật ELISE với kháng nguyên P multocida serotype

B:2 có thể dùng để phát hiện hoặc đo sự hiện diện của kháng thể thu được tự nhiên,

kỹ thuật có độ nhạy cao, kinh tế và tiện lợi cho việc kiểm tra với số lượng lớn mẫuhuyết thanh Qureshi và Saxena (2014) [135] kiểm tra kháng thể của 100 cá thể bòsau tiêm vắc xin tụ huyết trùng phèn kết tủa bằng phản ứng ngưng kết microtiter(MAT), Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và phương pháp (ELISA) Kếtquả cho thấy hiệu giá đo bằng phương pháp ELISA luôn cao hơn so với MAT vàIHA trong suốt quá trình thí nghiệm

- Chẩn đoán phi huyết thanh học (Nonserological test)

Một vài kỹ thuật chẩn đoán phi huyết thanh học đã được phát triển để nhậnbiết nhanh các chủng Những kỹ thuật này bao gồm Acriflavine Flocculation testđược miêu tả bởi Carter và Subronto (1973) [73] để nhận biết các chủng type D, kỹthuật Hyaluronidase decapsulation test để nhận biết các chủng type A (Carter andRundell, 1975) [74]), kỹ thuật tạo men Hyaluronidase để nhận biết nhanh các chủngthuộc type B (Carter and Chengappa, 1981) [75]

- Kỹ thuật sinh học phân tử (Molecular Byology techniques)

Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đã trở nên phổ biến trong việc phát

hiện và định type vi khuẩn Trong chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, phương

pháp PCR đã được nhiều nhà nghiên cứu ứng dụng (De Alwis, 1999) [86] Kết quảnghiên cứu của Natalia (1996) [124], kiểm tra 100 mẫu hạch amidan từ bò ở lò mổcủa Indonesia bằng kỹ thuật PCR, kết quả phù hợp với các kết quả đạt được từ việcnuôi cấy vi khuẩn Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) [14] cho biết, việc sửdụng các các cặp mồi đặc hiệu để định type vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng, chothấy ưu điểm của phương pháp này khi so sánh với các phương pháp truyền thốngkhác Đặc biệt đối với bệnh tụ huyết trùng với đặc điểm chết nhanh và bệnh tíchkhông điển hình thì việc xác định nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh là vấn đềquyết định trong công tác phòng chống bệnh Kết quả thu được trong nghiên cứucủa tác giả cho thấy, có sự phù hợp giữa định type bằng huyết thanh học và xác định

bằng PCR Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) [51] định type giáp mô của P multocida

bằng PCR cho kết quả đồng nhất so với định type bằng các phương pháp truyềnthống Bên cạnh đó, kỹ thuật này còn thể hiện sự vượt trội về nhiều ưu điểm như:

Dễ áp dụng, độ nhạy cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn

và cho kết quả trong một thời gian ngắn Kỹ thuật PCR có ý nghĩa rất lớn trongnghiên cứu cũng như trong công tác chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết, xuấthuyết trên trâu, bò và lợn ở Việt Nam

+ Ứng dụng kỹ thuật PCR để định type các chủng vi khuẩn P multocida

Kỹ thuật PCR đã được OIE chuẩn hóa thành quy trình chung, áp dụng ở các

phòng thí nghiệm để định type giáp mô của P multocida (OIE, 2004) [128].

Townsend và cs (1998) [161] đã phát triển cặp mồi KTSP61 – KTT72 đặc hiệu cho

P multocida serotype B:2/B:5 hoặc B:2,5 và sử dụng cặp mồi này để giám định vi

khuẩn tụ huyết trùng gây bệnh Gần đây, từ vùng gen tổng hợp kháng nguyên vỏnhày type B, một cặp mồi khác ký hiệu CAP-B đã được thiết kế (Townsend et al,

2001) [162] Cặp mồi CAP-B được sử dụng để khuếch đại DNA của vi khuẩn P.

multocida có kháng nguyên vỏ nhầy thuộc serogroup B Tất cả các cặp mồi này

được thông báo là đặc hiệu với P multocida serogroup B Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) [51], định type giáp mô A, B, D của P multocida dựa trên phương pháp

PCR với các cặp mồi KMT1T7, KMT1SP6; CAPA-F, CAPB–R; CAPB-F, CAPB–R; CAPD-F, CAPD–R có kích cỡ sản phẩm tương ứng là 460pb; 1044pb; 760pb và657pb Kết quả thu được cho thấy 100% các chủng phân lập từ gia cầm đều thuộctype A, type A cũng được phát hiện ở phổi hoặc đường hô hấp trên của lợn khỏemạnh Các chủng type D, đôi khi là type A thường gây bệnh viêm teo mũi ở lợn,

còn các chủng thuộc type B2 gây bệnh thể bại huyết, xuất huyết Trần Xuân Hạnh

và Tô Thị Phấn (2007) [14] sử dụng phương pháp định type truyền thống, kết hợpvới kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi PM, CAP-A, CAP-D và CAP-B để giám

định P multocida Kết quả với 30 chủng được giám định thấy, type A (5/30 chủng),

type B (24/30 chủng), type D (1/30 chủng), tác giả cũng đã dùng kỹ thuật PCR với cặpmồi HSB để định type 24 chủng thuộc nhóm B, thấy tất cả đều thuộc type huyết thanh

B:2; B:2,5; B:5 Jalal và cs (2010) [99] định type kháng nguyên các chủng P.

multocida phân lập ở Iran, đã xác định được type A, B, D, trong đó type A

(26,92%), type B (46,15%), type D (26,92%) Không có kháng nguyên nào thuộctype E hoặc F, tất cả 3 type (A, B và D) được tìm thấy trên cơ thể trâu và bò CùHữu phú và cs (2013) [35] sử dụng phản ứng PCR để xác định các type giáp mô A, B,

D của các chủng P multocida phân lập được từ lợn mắc bệnh viêm phổi Với 35 chủng

nghiên cứu có 30/35 chủng thuộc serotype A, 5/35 chủng thuộc serotype D, không cóchủng nào thuộc serotype B Lê văn Dương (2013) [7] xác định serotype của 42 chủng

vi khuẩn P multocida phân lập được từ lợn mắc bệnh viêm phổi ở Bắc Giang bằng

phản ứng PCR thấy có 31 chủng thuộc serotype A, 11 chủng thuộc serotype D, không

có chủng nào thuộc serotype B

Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử

dụng chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do P multocida trên

gia súc, gia cầm

Trong những năm gần đây, một số nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCRvới cặp mồi REP1R và REP2 để phân biệt các chủng vi khuẩn gây bệnh (REP-PCR)(Woods et al, 1993 [Error: Reference source not found], Townsend et al, 1997

[160]) Kỹ thuật REP-PCR (Repetitive extragenic palindrome) được dùng để phân

biệt các chủng cùng serotype, thông qua đó có thể hiểu được đặc điểm dịch tễ vànguồn gốc của các chủng gây bệnh Sự phân bố các đoạn DNA trên gel thu đượcbằng kỹ thuật REP-PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau của các

chủng P multocida cùng hoặc khác nhóm huyết thanh (Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn, 2003) [12] Các chủng P multocida phân lập từ lợn hoặc trâu bò có kết quả

PCR dương tính với cặp mồi CAP-B và HS đều cho sản phẩm REP-PCR giống

nhau REP-PCR giống nhau đã thu được khi tiến hành với các chủng P.

multocida serotype B:2; B:2,5 hoặc B:5 có nguồn gốc khác nhau từ lợn hoặc trâu

bò và giống như sản phẩm REP-PCR khi chạy với chủng P52 hoặc FgHc (Trần