KHẢO sát HOẠT TÍNH CHỐNG OXY hóa của rễ cây ĐINH LĂNG (polyscias fruticosa (l ) harms) TRỒNG tại AN GIANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN ĐẶNG KIM THOA ThS ĐỖ VĂN MÃI MSSV: 12D720401167 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN ĐẶNG KIM THOA ThS ĐỖ VĂN MÃI MSSV: 12D720401167 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017 LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khố luận này, thời gian nghiên cứu môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô, em nhận nhiều quan tâm, hướng dẫn thầy cô, bạn bè gia đình Với lịng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn em muốn gửi đến thầy PGS.TS Trần Công Luận, Ths Đỗ Văn Mãi, hai Thầy tận tình hướng dẫn, dìu dắt, chỉnh sửa giúp đỡ em nhiều q trình làm hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em thời gian em thực khoá luận Em xin gửi đến tồn thể thầy Khoa Dược- Điều dưỡng, trường đại học Tây Đô lời cám ơn sâu sắc, suốt năm giảng đường thầy cô không ngừng truyền đạt kiến thức, kỹ có để em trưởng thành Ngồi ra, không kể đến người bạn em, cám ơn bạn bên cạnh em, em vượt qua khó khăn làm cho khoảng thời gian làm khóa luận em trở nên ý nghĩa khó quên Và cuối cùng, em muốn dành lời cám ơn chân thành cho gia đình, gia đình nguồn động lực để em cố gắng học tập, ln bên cạnh em lúc em gặp khó khăn, ln tạo điều kiện để em hồn thành chương trình đại học Xin chân thành cám ơn người Cần Thơ, ngày 01 tháng năm 2017 Sinh viên Đặng Kim Thoa i LỜI CAM KẾT Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Sinh viên Đặng Kim Thoa ii Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Khóa học: 2012 – 2017 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG TÓM TẮT Mở đầu đặt vấn đề Trong y học cổ truyền, Đinh lăng từ lâu sử dụng phổ biến với công dụng bật bổ dưỡng Ngày nay, Đinh lăng cịn chứng minh với nhiều cơng dụng như: Kháng viêm, chống trầm cảm, lợi tiểu, ức chế enzym Ở Việt Nam, Đinh lăng trồng phổ biến, nguồn cung cấp nguyên liệu để tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe người Đề tài góp phần khảo sát hoạt tính chống oxy hóa sơ thành phần hóa học rễ Đinh lăng Đối tượng phương pháp nghiên cứu Dược liệu Đinh lăng thu hái huyện Tri Tôn, An Giang vào tháng 11/2016 Sau mơ tả hình thái khảo sát vi phẫu dược liệu, rễ Đinh lăng phơi khô xay thành bột Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng chiết ngấm kiệt với cồn 96 %, thu cao cồn (cao tồn phần) Cao cồn hịa với lượng nước tối thiểu sau lắc phân bố với diethyl ether, ethyl acettat, n - butanol, cô thu hồi dung môi thu cao phân đoạn tương ứng Tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn thử nghiệm sử dụng DPPH, chọn phân đoạn cho HTCO cao đem phân tích sơ thành phần hóa học phân lập SKC cổ điển nhằm tạo phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, phục vụ cho nghiên cứu sau Kết bàn luận Từ 9,3 kg bột rễ Đinh lăng, sau chiết lắc phân bố thu được: 300 g cao Et2O, 30 cao EA, 405 g cao n-BuOH, 800 g cao nước Tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn cho kết cao EA có hoạt tính chống oxy hóa cao (HTCO = 67,82 %, IC50 = 758,55 µg/ml) Phân tích sơ thành phần hóa học thấy cao EA có chứa: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử Bước đầu phân lập 10 g cao EA SKC cổ điển thu được: phân đoạn từ I → V (có thành phần đơn giản hơn) với khối lượng là: 1,5311 g, 1,2835 g, 0,5612 g, 0,5824 g, 0,1889 g Kết luận Cao EA có hoạt tính chống oxy hóa cao cao với IC50 = 758,55 µg/ml, thành phần hóa học gồm: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử iii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 2.1 CÂY ĐINH LĂNG 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật họ Nhân sâm .2 2.1.3 Đặc điểm thực vật chi Polyscias .3 2.1.4 Đặc điểm thực vật Đinh lăng 2.1.5 Thành phần hóa học 2.1.6 Tác dụng dược lý công dụng 15 2.1.7 Một số thuốc có Đinh lăng 17 2.1.8 Một số chế phẩm từ Đinh Lăng 20 2.2 GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 21 2.2.1 Khái niệm gốc tự 21 2.2.2 Tác động gốc tự liên quan đến bệnh tật người 21 2.2.3 Chất chống oxy hóa 22 2.2.4 Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro 22 2.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP 25 2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng 25 2.3.2 Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng .26 2.3.3 Một số phương pháp phân lập hợp chất hữu 29 CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 3.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31 3.2.1 Dung mơi, hóa chất 31 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ 31 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.3.1 Khảo sát đặc điểm thực vật học 32 3.3.2 Thử tinh khiết 32 3.3.3 Nghiên cứu hóa học 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 4.1 THỰC VẬT HỌC 39 4.1.1 Đặc điểm hình thái 39 iv 4.1.2 Đặc điểm vi phẫu rễ 43 4.1.3 Đặc điểm bột rễ Đinh lăng 45 4.2 THỬ TINH KHIẾT 46 4.2.1 Độ ẩm 46 4.2.2 Xác định độ tro 46 4.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC .47 4.3.1 Chiết xuất điều chế cao phân đoạn 47 4.3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn 48 4.3.3 Phân tích sơ thành phần hóa học cao ethyl acetat 53 4.3.4 Phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat 54 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 KẾT LUẬN 57 5.2 KIẾN NGHỊ .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Phản ứng thử nghiệm DPPH 36 Bảng 4.1 Kết thử tinh khiết bột rễ Đinh lăng 47 Bảng 4.2 Kết xác định độ ẩm cao phân đoạn 48 Bảng 4.3 Kết khảo sát HTCO cao, nồng độ 1000 µg /ml 50 Bảng 4.4 Kết đo OD cao EA nồng độ 50 Bảng 4.5 Kết đo OD Vitamin C nồng độ 51 Bảng 4.6 Kết xác định giá trị IC50 cao EA vitamin C 52 Bảng 4.7 Kết phân tích sơ thành phần hóa học cao ethyl acetat 53 Bảng 4.8 Kết SKC cao EA (10 g) 56 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ Hình 2.1 Sơ đồ vị trí phân loại Polyscias fruticosa (L.) Harms Hình 2.2 Cơng thức chung saponin triterpenoid Đinh lăng Hình 2.3 Một số chế phẩm từ Đinh lăng 20 Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 23 Hình 2.5 Phản ứng phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA 23 Hình 2.6 Phản ứng FRAP 25 Hình 3.1 Sơ đồ điều chế loại cao kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 34 Hình 4.1 Cây Đinh lăng 39 Hình 4.2 Lá Đinh lăng 40 Hình 4.3 Hoa Đinh lăng 41 Hình 4.4 Quả Đinh lăng 42 Hình 4.5 Rễ Đinh lăng 42 Hình 4.6 Vi phẫu rễ Đinh lăng 44 Hình 4.7 Bột rễ Đinh lăng 45 Hình 4.8 Soi bột rễ Đinh Lăng 46 Hình 4.9 Sơ đồ chiết tách phân đoạn từ rễ Đinh lăng 48 Hình 4.10 Sắc kí đồ phân đoạn khảo sát HTCO 49 Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn tương quan HTCO nồng độ cao EA 51 Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn tương quan HTCO nồng độ vitamin C .52 Hình 4.13 Biểu đồ so sánh khả chống oxy hóa cao EA với vitamin C 53 Hình 4.14 Sắc kí đồ thăm dị hệ dung mơi cho cao EA .55 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT EA Et2O n –BuOH : : : Ethyl acetat Diethyl ether n – butanol n-Hex : n – hexan MeOH : Methanol SKLM SKC CHCl3 : : : Sắc kí lớp mỏng Sắc kí cột Clorofrom IC50 HTCO : : Khả đánh bắt 50 % gốc tự Hoạt tính chống oxy hóa OD TP : : Mật độ quang Toàn phần PE TT DĐVN IV : : : Pertroleum ether Thuốc thử Dược điển Việt Nam IV viii H3C CH3 OH CH3 H COO CH3 O HO O HO O CH3 HO OH O O H3C CH3 OH H CH3 HO OH OH OH Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-Dglucopyranosyl] oleanolic Trong năm gần đây, có nhiều hợp chất saponin phân lập Năm 2014, Hồ Lương Nhật Vinh phân lập 3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-Dgalactopyranosy l(1→4)]-β-D-glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-Dglucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] ester từ Đinh lăng Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu cộng lần phân lập hợp chất falcarindiol từ rễ Đinh lăng Cùng năm 2016, Trần Thị Hồng Hạnh cộng lần phân lập 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-Dglucuronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-Dgalactopyranosyl ester (từ Đinh lăng) đặt tên polyscioside I (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014 ; Nguyễn Thị Bích Thu cs, 2016 ; Trần Thị Hồng Hạnh cs, 2016) 13 CH3 CH3 OH OH H COOH O O H H3C CH3 O O HO O CH3 CH3 O OH HO HO OH O CH3 O OH OH O OH O OH OH HO O HO HO OH 3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-D-galactopyranosy l(1→4)]-β-Dglucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-Dglucopyranosyl] ester OH 17 OH Falcarindiol CH3 CH3 CH3 O CH3 OH O HO HO H HOOC O O HO O H3C O OH O CH3 OH H CH3 OH O HO HO HO HO O HO HO O O OH OH Polyscioside I 14 Viện hóa sinh biển-Viện khoa học cơng nghệ Việt Nam phân lập hợp chất flavonoid từ Đinh lăng quercitrin, afzelin kaempferol-3-O-rutonosid (Nguyễn Thị Luyến cs, 2012): OH OH O OH OH OH O O OH O O O CH3 OH O OH H3C HO OH OH O OH OH Quercitrin Afzelin OH OH O O OH O OH O OH O OH O H3C OH OH OH Kaempferol-3-O-rutinosid 2.1.6 Tác dụng dược lý công dụng Cây Đinh lăng coi nhân sâm Việt Nam có nhiều tác dụng tương tự nhân sâm: làm tăng cường sức dẻo dai nâng cao sức đề kháng thể, chống tượng mệt mỏi, bổ dưỡng, làm cho thể ăn ngon, ngủ yên, tăng khả lao động làm việc trí óc, lên cân chống độc…(Võ Văn Chi, 1997 ; 15 5632057 Đỗ Tất Lợi, 2004) Đinh lăng có tác dụng làm tăng hiệu lực điều trị cloroquin bệnh sốt rét thực nghiệm động vật Đinh lăng có tác dụng tăng co bóp tử cung, có tác dụng an thần độc, có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen Nước sắc Đinh lăng có tác dụng đối kháng trùng roi Euglena viridis, trùng tiêm mao Paramoecium caudatum số động vật nguyên sinh khác nước ngâm rơm nước ao Nước săc Đinh lăng cịn có tác dụng chống choáng phản vệ mức độ vừa, bảo vệ 60 % chuột Lang qua choáng Đinh lăng có tác dụng kháng Entamoeba histolyca, làm đơn bào co thành kén Đinh lăng nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch khơng đặc hiệu thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt hồng cầu cừu Đinh lăng có tác dụng ức chế mạnh hoạt độ men MAO não gan Dịch chiết Đinh lăng thử tác dụng ATPase màng tế bào, thấy K+, Na+, ATPase kích thích dịch chiết thân, rễ Đinh lăng cịn có tác dụng kích thích sinh dục động vật già kích thích tăng sinh lực động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài bền vững (Đỗ Huy Bích cs, 2006) Ở Ấn Độ, người ta cho có tính làm săn, dùng điều trị sốt Ở Campuchia, người ta dùng phối hợp với thuốc khác làm bột hạ nhiệt, thuốc giảm đau Lá dùng xông để mồ chữa chứng chóng mặt, dùng tươi giã nát đắp trị viêm thần kinh khớp vết thương Lá nhai nuốt với chút phèn giúp trị hóc xương cá (Võ Văn Chi, 2004) Cụ thể nghiên cứu cho thấy: - Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai thể thí nghiệm cấp tính tương tự nhân sâm (Đỗ Tất Lợi, 2004) - Các thí nghiệm chuột cho thấy Đinh lăng có tác dụng lợi tiểu, làm tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng chuột xạ siêu cao tần (Đỗ Tất Lợi, 2004 ; Đỗ Huy Bích cs., 2004) - Cây Đinh lăng có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả chịu đựng đội, vận động viên thể thao (Nguyễn Thị Thu Hương Lương Kim Bích, 2001) - Các hợp chất polyacetylen (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol phân lập từ Panax vietnamensis Polycias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida albican không kháng vi khuẩn Gram (-) (Lutomski J et al., 1992) - Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương cộng dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm stress Đinh lăng Kết cho thấy 16 cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn stress với liều 45 – 180 mg/kg thể trọng, khoảng liều có tác dụng khác tăng lực, kích thích hoạt động não nội tiết, tăng sức đề kháng thể, chống viêm xơ vữa động mạch (Nguyễn Thị Thu Hương Lương Kim Bích, 2001) - Dịch chiết cồn rễ Đinh lăng nuôi cấy mô tháng thể tác dụng tăng lực dài ngày, chống stress nóng kháng viêm thực nghiệm tương tự dịch chiết cồn rễ Đinh lăng năm tuổi trồng điều kiện tự nhiên (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) - Dịch chiết n-butanol Đinh lăng với liều 500 mg/kg có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm diệt nhuyễn thể chuột nhắt trắng (Bernard M.B et al., 1998 ) - Cao Đinh lăng liều 200 mg/kg 500 mg/kg làm giảm lượng Malondialdehyde não gan chuột nhắt trắng sau gây tăng CCl4 làm giảm nồng độ cholesterol máu so với lô không điều trị Cao Đinh lăng liều 200 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa hạcholesterol chuột nhắt cao so với liều 500 mg/kg (Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh, 2008) - Năm 2011, Varadharajan cộng chứng minh hoạt tính lợi tiểu dịch chiết dầu hỏa rễ Đinh lăng động vật thí nghiệm (Varadharajan R and Rajalingam D., 2011) - Năm 2012, viện Hóa sinh biển – Viện khoa học công nghệ Việt Nam chứng minh in vitro tác dụng ức chế enzyme α-amylase flavonoid phân lập quercitrin kaempferol-3-O-rutonosid với giá trị IC50tương ứng 4,61 µg/ml 59,4 µg/ml (Nguyễn Thị Luyến cs, 2012) - Năm 2014, kết thử in vitro cho thấy Đinh lăng có tác dụng ức chế tốt enzyme α- amylase α- glucosidase Đây enzyme đóng vai trị quan trọng trình thủy phân, hấp thu tinh bột chuyển hóa đường thể việc ức chế enzyme giúp ngăn chứng tăng đường huyết (Hồ Lương Nhật Vinh, 2014) 2.1.7 Một số thuốc có Đinh lăng Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình Lá Đinh lăng có vị nhạt, đắng, tính bình (Võ Văn Chi, 1997) Theo dân gian, rễ Đinh lăng dùng làm thuốc bổ, chữa thể suy nhược, gầy 17 yếu mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi tiểu Thân cành dùng chữa phong thấp, đau lưng Lá dùng chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú (Võ Văn Chi, 2004).Dưới số thuốc dân gian có Đinh lăng:  Thuốc bồi bổ thể, tăng cường thể lực: Rễ củ Đinh lăng thái lát, phơi khô, vàng sắc uống ngày, nghiền thành bọt mịn để uống ngày 20 – 30 g (Quách Tuấn Vinh, 2006)  Chữa Phong thấp, thấp khớp: Rễ Đinh lăng 12 g; Cối xay, Hà thủ ô, Huyết rồng, cỏ Rễ xước, Thiên niên kiện tất g; vỏ Quýt, Quế chi g (riêng vị Quế chi bỏ vào sau nhấc ấm thuốc xuống) Đổ 600 ml nước sắc 250 ml Chia làm hai lần uống ngày Uống thuốc cịn nóng (Võ Hà, 2008) - Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 0.50 g thêm 100 ml nước, đun sôi 15 phút, chia – lần uống ngày  Thông tia sữa, căng vú sữa: Rễ Đinh lăng 30 – 40 g Thêm 500 ml nước sắc cịn 250 ml Uống nóng Uống ln – ngày, vú hết nhức, sữa chảy bình thường (Đỗ Tất Lợi, 2004)  Chữa vết thương: Giã nát Đinh lăng đắp lên ( Đỗ Tất Lợi, 2004)  Lợi sữa: Lá Đinh lăng tươi 50 – 100g, bong bóng lợn cái, băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30 – 40g, thêm 500 ml nước, sắc 250 ml, uống nóng, ngày uống – lần, uống – ngày (Võ Văn Chi, 1997)  Lá Đinh lăng phơi khơ đem lót gối trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật (Đỗ Tất Lợi, 2004)  Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30 g, vỏ Chanh 10 g, vỏ Quýt 10 g, Sài hồ (rễ, lá,cành) 20 g, Tre tươi 20 g, Cam thảo dây Cam thảo đất 30 g, Rau má tươi 30 g Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống lần ngày (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Chữa đau tử cung: Cành Đinh lăng rửa vàng, sắc uống thay chè (Đỗ Huy Bích cs, 18 2006)  Chữa mẫn ngứa dị ứng: Lá đinh lăng 80 g, vàng, sắc uống Dùng – tháng (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Chữa thiếu máu: Rễ Đinh lăng, Hà thủ ô, Thục địa, Hoàng tinh, vị 100 g, Tam thất 20 g Tán bột, sắc uống ngày 100 g (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Chữa viêm gan mạn tính: Rễ Đinh lăng 12 g, Nhân trần 20 g, Ý dĩ 16 g; Chi tử, Hoài sơn, Biển đậu, rễ Cỏ tranh, Xa tiền tử, Ngũ gia bì, vị 12 g; Uất kim, Nghệ, Ngưu tất, vị g Sắc uống, ngày thang (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Chữa liệt dương: Rễ Đinh lăng, Hoài sơn, Ý dĩ, Hồng tinh, Hà thủ ơ, Kỷ tử, Long nhãn, cám Nếp, vi 12 g; Trâu cổ, cao long ban, vị g; Sa nhân g Sắc uống, ngày thang (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Chữa sốt rét: Rễ Đinh lăng, Sài hồ, vị 20 g; Rau má 16 g; Tre, Cam thảo nam, vị 12 g; Bán hạ vàng g, Gừng g, sắc uống (Đỗ Huy Bích cs, 2006)  Phịng tác dụng thuốc chữa lao: Lá Đinh lăng vàng 20 – 25 g, hãm nước uống hàng ngày (Quách Tuấn Vinh, 2005)  Chữa ho suyễn lâu năm: Rễ đinh lăng, Bách bộ, Đậu săn, rễ Dâu, Nghệ vàng, rau tần dày lá, vị g, củ Xương bồ g, Gừng khô g Đổ 600 ml sắc 250 ml Chia làm hai lần uống ngày Uống lúc thuốc cịn nóng (Võ Hà, 2008) 19 2.1.8 Một số chế phẩm từ Đinh Lăng Trên thị trường nay, có chế phẩm từ Đinh lăng sau: Trà Đinh lăng Rượu Đinh lăng Hịa Bình Cơng ty TNHH Lava (www.goidinhlangthienduong.com) (www.quagac.com) Viên nang Vanina Cebraton Học viện quân y Traphaco ( www.giamcanlishou.com) (www.baomoi.com) Hình 2.1 Một số chế phẩm từ Đinh lăng 20 2.2 GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 2.2.1 Khái niệm gốc tự Các gốc tự hay nói xác chất hoạt động chứa oxy nitơ (ROS RNS), dẫn xuất dạng khử oxy nitơ phân tử Chúng chia thành hai nhóm lớn gốc tự dẫn xuất gốc tự Gốc tự phân tử nguyên tử có điện tử độc thân, điện tử làm cho gốc tự có khả oxy hóa cao Các dẫn xuất khơng phải gốc tự oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd tiền chất gốc tự Các gốc tự khơng bền với thời gian nên phải nhận điện tử từ phân tử khác để đạt cấu trúc bền vững Quá trình tạo thành dây chuyền phản ứng với phân tử chung quanh nó, gây tổn thương làm thay đổi giá trị sinh học đại phân tử sinh học ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989 ; Favier A., 2003 ; Viện dược liệu, 2006) Trong thể người động vật, thường xun có hình thành gốc tự do, phát sinh trình chuyển hóa sản phẩm phản ứng khử độc số chất yếu tố ngoại lai hệ thống lưới nội bào Ngồi chúng sinh số tác nhân bên tia tử ngoại, nhiễm độc lân hữu cơ, hay bệnh lý gây stress chấn thương, bỏng… Khi có gia tăng hình thành gốc tự do, làm cân hệ thống oxy hóa, kết làm tổn thương cấu trúc phân tử tế bào lipid, ADN, protein… dẫn đến thay đổi chức hoạt động tế bào (Viện dược liệu, 2006) 2.2.2 Tác động gốc tự liên quan đến bệnh tật người Gốc tự sinh mức vượt qua hệ thống enzym bảo vệ thể (enzym superoxid dismutase - SOD, catalase, peroxidase…) không tránh khỏi việc gốc công vào tất chất thể Những thành phần tế bào ADN, protein, phospholipid, carbohydrat… dễ bị gốc tự công, nguyên nhân nhiều bệnh nguy hiểm Gốc tự công vào phospholipid màng tế bào gây trình peroxy hóa lipid Hậu dẫn đến tính lỏng, tính thấm màng tế bào thay đổi Q trình peroxy hóa quanh bao myelin sợi tế bào thần kinh dẫn tới dấu hiệu bệnh thần kinh (bệnh não suy Alzheimer) Nếu peroxy hóa chất xảy bề mặt phế nang gây dấu hiệu rối loạn chức phổi Quá trình peroxy hóa lipid xảy mãnh liệt quan, tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy cách nghiêm trọng dẫn đến đột biến, ung thư tổn thương phân tử ADN Sự tác động đến yếu tố gây viêm, hủy hoại phân tử polysaccharid oxy hóa làm tính nhớt acid hyalunoric (một chất làm trơn khớp), ảnh 21 hưởng tới q trình viêm dẫn tới bệnh viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ… Gốc tự liên quan chặt chẽ đến điều hòa chất tiết từ thành mạch máu (prostacyclin, nitrogen oxyd ) để định tính bám dính tiểu cầu mảng xơ vữa nguyên nhân số bệnh tim mạch (nhồi máu tim, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não ) Nói chung gốc tự liên quan đến nhiều bệnh tật thể khả chống oxy hóa thể cao xác suất mắc bệnh mức độ bệnh tật giảm Vì người ta khơng ngừng nghiên cứu, tìm kiếm chất chống oxy hóa cho thể nhằm nâng cao bảo vệ sức khỏe người (Lại Thị Ngọc Hà cs, 2009 ; Nguyễn Ngọc Hồng, 2009) 2.2.3 Chất chống oxy hóa Trong thể ln tồn cân việc tạo gốc oxy hóa chất chống oxy hóa, trạng thái cân nội môi Các chất chống oxy hóa chất giúp bảo vệ tế bào khỏi gốc tự tạo trình oxy hóa nên ngăn cản hay làm chậm q trình Ngồi ra, chất chống oxy hóa cịn sử dụng ngành dược mỹ phẩm với mục đích bảo vệ ổn định dược chất Do đó, chất chống oxy hóa định nghĩa chất khử mạnh có hoạt tính oxy hóa cao so với dược chất Các chất chống oxy hóa dược phẩm chia làm nhiều nhóm dựa chế khác bao gồm chế chống oxy hóa trực tiếp chống oxy hóa gián tiếp - Các chất chống oxy hóa gián tiếp tác nhân chelat hóa tác động lên ion kim loại Fe2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+ … Vì ion xúc tác cho trình khơi mào phản ứng oxy hóa - Các chất chống oxy hóa trực tiếp bao gồm chất khử hóa, chất oxy hóa chọn lọc chất ngắt mạch Trong thiên nhiên, chất chống oxy hóa có từ nhiều nguồn gốc khác cỏ nguồn quan tâm chủ yếu Một số chất chống oxy hóa tìm ra, chứng minh sử dụng hàng loạt như: Vitamin E, vitamin C, polyphenol, flavonoid (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J et al, 2007) 2.2.4 Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro 2.2.4.1 Thử nghiệm sử dụng DPPH DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) gốc tự dùng để thực phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu 22 Phương pháp dùng phổ biến đơn giản, nhanh chóng ổn định Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu DPPH, giảm màu xác định cách đo quang bước sóng 517 nm Các chất có khả chống oxy hóa trung hòa gốc DPPH cách cho hydrogen, làm nhạt dần màu tím DPPH ( Huang D et al, 2005 ; Wang J et al, 2007) N N O2N N NH + RH O2N NO2 + R NO2 NO2 NO2 Hình 2.4 Phản ứng trung hịa gốc DPPH Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100 OD: Mật độ quang 2.2.4.2 Thử nghiệm sử dụng TBA - đo lượng MDA MDA (Malonyl dialdehyd) sản phẩm cuối trình peroxy hóa lipid màng tế bào Sử dụng acid thiobarbituric (TBA) để xác định hàm lượng MDA tổ chức tế bào, từ đánh giá khả chống oxy hóa chất nghiên cứu thể qua việc giảm hàm lượng MDA Một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử TBA tạo phức màu hồng hấp thu cực đại bước sóng 523 nm (Nguyễn Thượng Dong cs, 2006 ; Viện dược liệu, 2006) O H2 OHC C CHO + HN S N H O -2H2 t O O HN S NH N H O O N H S Hình 2.5 Phản ứng phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(CMDA chứng – CMDA thử)/ CMDA chứng] x 100 Nồng độ MDA tính theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA 23 2.2.4.3 Thử nghiệm đánh giá khả kết hợp với ion sắt II Ion sắt đồng trạng thái tự dễ dàng xúc tác sinh gốc tự Đánh giá khả phòng ngừa sinh gốc tự chất nghiên cứu thể qua khóa ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không tồn trạng thái tự do, làm khả xúc tác Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu ion sắt II với thuốc thử Ferrozin (Viện dược liệu, 2006) EDTA sử dụng chất đối chiếu dương tính Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)]x100 2.2.4.5 Thử nghiệm đánh giá khả đánh bắt gốc superoxyd Đánh giá khả phòng vệ loại bỏ gốc tự sinh chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn tạo thành gốc superoxyd Gốc superoxyd tạo thành phản ứng xanthin xanthin oxydase định lượng phương pháp khử, sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím đo quang bước sóng 550 nm Hoạt tính chống oxy hóa mẫu thử thể qua việc làm giảm hình thành phức màu tím (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J, 2007) Enzym superoxyd dismutase (SOD) sử dụng chất đối chiếu dương tính HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100 2.2.4.6 Thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III (Phương pháp FRAP) Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power) thực Benzie Strain để đo lực khử hóa chất huyết tương, phương pháp sử dụng để thử nghiệm chất chống oxy hóa thực vật Phương pháp dựa vào khử phức ferric 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe3+ – TPTZ) thành phức chất ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe2+ – TPTZ) bền chất khử (chất chống oxy hóa) pH thấp Phức Fe2+ – TPTZ tạo thành có màu xanh dương đậm, bền vững có độ hấp thu cực đại bước sóng 593 nm ( Benzie I.F.F and Strain J.J, 1999 ; Wojdylo A et al, 2007 ; Nguyen Thi Hoai Thu et al, 2011) Tải FULL (file word 71 trang): bit.ly/32n5uM8 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net 24 N N N N N N N N N N N N N N Fe2+ +e N N N N Fe3+ N N antioxidant N N N N Hình 2.6 Phản ứng FRAP 2.2.4.7 Phương pháp đánh giá khả đánh bắt peroxyhydro H2O2 (Hydrogen peroxide scavenging activity) Hai tiểu phân O2- H2O2 sinh từ chuyển hóa thể với nồng độ vô thấp, dễ dàng bị loại bỏ không độc hại cho thể diện nồng độ cao (do stress oxy hóa) chúng tạo 1O2, OH phân tử gốc có khả phản ứng cao, dễ dàng phản ứng với chất hữu tạo peroxyd từ tạo nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào Hoạt tính chống oxy hóa mẫu thử thể qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu H2O2 đỏ phenol (màu đỏ phenol chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 diện enzym peroxydase từ cải gia (Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý, 2006) 2.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP Chiết phương pháp sử dụng dung môi để tách chất tan khỏi hỗn hợp chất Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu khỏi Nhưng kỹ thuật xoay quanh hai phương pháp chiết lỏng- lỏng chiết rắn- lỏng - Chiết lỏng – lỏng (phân bố lỏng– lỏng) với chế q trình phân bố chất tan hai chất lỏng không đồng tan với theo định luật phân bố - Chiết rắn – lỏng với chế hịa tan chất tan vào dung môi (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010) 2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng Kỹ thuật gọi chiết dung mơi Cao alcol thơ ban đầu (thí dụ bột tận trích với metanol 80 %, đuổi dung mơi thu alcol thô ban đầu) dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) chứa hầu hết hợp chất hữu từ phân cực đến khơng phân cực khó lập riêng hợp chất tinh khiết để thực khảo sát Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu dung dịch ban đầu thành phân đoạn có tính phân cực khác Ngun tắc chiết dung mơi khơng phân cực hịa tan tốt hợp chất có tính khơng phân cực, dung mơi phân cực trung bình hịa tan tốt 25 Tải FULL (file word 71 trang): bit.ly/32n5uM8 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net hợp chất có tính phân cực trung bình dung mơi phân cực mạnh hịa tan hợp chất có tính phân cực mạnh Ngun tắc chiết lỏng - lỏng phân bố chất tan vào hai pha lỏng hai pha lỏng khơng hịa tan vào Hằng số phân bố chất tan cho biết khả hòa tan chất hai pha lỏng thời điểm cân bằng, biểu diễn số phân bố K Ca K Cb Ca= Nồng độ chất tan pha (a) giai đoạn cân Cb= Nồng độ chất tan pha (b) giai đoạn cân Mục đích chiết dung mơi để sơ bộ, tinh chế hóa hợp chất Nếu chất tan X chất tương đồng với chất X có số phân bố tương đối lớn chất tạp bẩn chất khác có cấu trúc hóa học khơng tương đồng với X lại có số phân bố nhỏ áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X chất tương đồng với Nhược điểm: Do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên lần chiết sau, dung mơi bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn việc tách pha thành hai lớp Để khắc phục nhược điểm này, sử dụng cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thống dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm hòa tan vào acetonitril nước, lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl cho vào lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) làm dung dịch tách thành lớp; độ hòa tan vài hợp chất thay đổi đáng kể có diện nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 2.3.2 Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng Trong thực ngiệm, việc chiết rắn – lỏng áp dụng nhều, gồm ngấm kiệt, ngâm dầm, chiết máy chiết Soxhlet, chiết cách nấu nguyên liệu với nước gọi nước sắc Ngồi cịn có chiết với phương pháp lôi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn,… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 2.3.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Ngấm kiệt phương pháp chiết liên tục dung môi qua dược liệu theo hướng định, với tốc độ định Quá trình hịa tan xảy phương pháp ngấm kiệt khơng giống toàn khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao 26 Do trình chiết xảy theo gradient nồng độ nên trình chiết xảy triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng phương pháp ngâm dược liệu chiết kiệt Các yếu tố phụ trợ nhiệt độ, chất diện hoạt v.v… sử dụng để gia tăng q trình chiết Có phương pháp ngấm kiệt: - Ngấm kiệt thường - Ngấm kiệt kèm sấy phun - Ngấm kiệt ngược dòng Ngấm kiệt thường phương pháp sử dụng phổ biến khơng địi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột sắc ký lớp mỏng nhỏ giọt dung dịch chiết lên kiếng sạch, để bốc xem có cịn để lại vết mặt kiếng hay khơng, khơng cịn vết chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 2.3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm Ngâm phương pháp chiết gián đoạn tồn lượng dung mơi tiếp xúc đồng thời với tồn lượng dược liệu dụng cụ thích hợp Quá trình chiết xuất xảy thời điểm thiết bị chiết dịch chiết rút khỏi thiết bị lúc Quá trình ngâm lặp lại thêm hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất Dược liệu Sự khuấy trộn, yếu tố phụ trợ nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v… sử dụng để gia tăng trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Phương pháp ngâm lạnh Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu ngâm với dung mơi nhiệt độ phịng Thời gian ngâm bình thường không 12 với dược liệu mỏng manh hay dược liệu xay nhỏ để đảm bảo trình chiết hồn tất Trong thời gian này, cân nồng độ hoạt chất bên bên thành tế bào thiết lập trình thẩm thấu kết thúc Thời gian ngâm kéo dài hơn, từ đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Phương pháp ngâm nóng 27 5632057 ... (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) trồng An Giang " tiến hành với mục tiêu sau: - Khảo sát sơ hình thái Đinh lăng đặc điểm vi học rễ Đinh lăng - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rễ Đinh lăng để chọn... ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG Cán hướng... 2012 – 2017 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG TÓM TẮT Mở đầu đặt vấn đề Trong y học cổ truyền, Đinh lăng từ lâu sử dụng