Định lượng flavonoid của lá quan âm biển (vitex rotundifolia l f , verbenaceae) bằng phương pháp ce pda

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN (VITEX ROTUNDIFOLIA L f., VERBENACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược, ĐH Y Dược TP Hờ Chí Minh Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Thị Xuân Diệu Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN (VITEX ROTUNDIFOLIA L f., VERBENACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ………… ) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Nguyễn Thị Xuân Diệu Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iii Mở đầu Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan về thực vật học 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Vị trí bảng phân loại thực vật 1.1.3 Mô tả thực vật 1.1.4 Bộ phận dùng 1.2 Tổng quan về thành phần hóa học 1.3 Tổng quan về tác dụng dược lý 1.3.1 Kháng viêm 1.3.2 Ức chế tiết prolactin 1.3.3 Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt 1.3.4 Chống dị ứng hen suyễn 1.3.5 Ức chế tế bào ung thư 10 1.4 Công dụng y học cổ truyền 10 1.5 Tổng quan về cấu trúc hóa học số tính chất lý hóa casticin, isoorientin cynarosid 11 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 13 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng phương pháp CE 13 2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp UPLC 16 Chương Kết nghiên cứu 22 3.1 Độ tinh khiết chất đối chiếu 22 3.2 Khảo sát điều kiện phân tích cao quan âm biển bằng phương pháp CE 23 3.2.1 Lựa chọn kỹ thuật điện di 23 3.2.2 Lựa chọn bước sóng phát 24 3.2.3 Khảo sát hệ đệm 24 3.2.4 Khảo sát sự ảnh hưởng pH và tỉ lệ methanol thêm vào 25 3.2.5 Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ dung dịch đệm 27 i 3.2.6 Thay methanol bằng acetonitril và khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ dung dịch đệm 28 3.2.7 Khảo sát sự ảnh hưởng điện 29 3.2.8 Khảo sát sự ảnh hưởng nhiệt độ 30 3.2.9 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 30 3.2.10 Phân tích mẫu thử và mẫu đối chiếu ở điều kiện khảo sát 31 3.3 Khảo sát điều kiện UPLC 32 3.3.1 Khảo sát chương trình rửa giải UPLC 32 3.3.2 Khảo sát bước sóng phát 33 3.3.3 Khảo sát tốc độ dòng 34 3.3.4 Khảo sát nhiệt độ cột 35 3.4 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 36 3.4.1 Khảo sát dung môi chiết 36 3.4.2 Khảo sát thời gian chiết 36 3.4.3 Khảo sát số lần chiết 37 3.5 Đánh giá quy trình định lượng đờng thời isoorientin, cynarosid casticin Quan âm biển 38 3.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống 38 3.5.2 Khảo sát tính tuyến tính (khoảng xác định) 39 3.5.3 Khảo sát độ đặc hiệu 41 3.5.4 Khảo sát độ lặp lại 42 3.5.5 Khảo sát độ 43 3.5.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 44 3.6 Định lượng so sánh các flavonoid lá quan âm biển thu hái ở Phú Yên và Nha Trang 46 Chương Bàn luận 47 Kết luận 48 Tài liệu tham khảo a ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT IFN-γ Interferon gamma IL Interleukin LPS Lipopolysaccharide MeOH methanol MRSA Methicillin-resistant S aureus PMS Premenstrual Syndrome - hội chứng tiền kinh nguyệt UV ultraviolet - tử ngoại ISO isoorientin CYN cynarosid CAS casticin iii MỞ ĐẦU Chi Vitex thuộc họ Verbenaceae bao gồm gần 250 loài phân bổ phổ biến cả khu vực khí hậu nhiệt đới lẫn ôn đới Trong đó, nhiều loài được người sử dụng làm thuốc từ lâu đời và được y học đại nghiên cứu, chứng minh có tác động dược lý giá trị Đáng ý là loài Vitex agnus-castus mọc chủ yếu ở vùng biển Địa Trung Hải Loài này được biết đến với tên gọi “chaste tree” nghĩa là “cây sạch”, xuất phát từ việc được các thầy tu từ thời Trung Cổ sử dụng với mục đích giảm ham muốn tình dục Loài này và được nghiên cứu, bào chế thành các thành phẩm thuốc từ thập niên cuối kỷ 20 điều trị nhiều bệnh mụn trứng cá, rối loạn tiêu hóa, rối loạn kinh nguyệt, đặc biệt là hội chứng tiền kinh nguyệt (premenstrual syndrome - PMS) tại Châu Âu, Bắc Mỹ.1 Ở Việt Nam, Quan âm biển (Vitex rotundifolia L.f.), được dân gian sử dụng để trị nhức đầu, quáng gà và số bệnh ngoài da mẩn ngứa, mụn nhọt, phát ban được các nhà khoa học chứng minh có tác dụng điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt hiệu quả tương tự Vitex agnus-castus.2 Đây là tín hiệu đáng mừng loài này mọc khá phổ biến ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh duyên hải Miền Trung Với nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có, được quan tâm nghiên cứu phát triển thành chế phẩm thuốc ng̀n ngun liệu đóng góp khơng nhỏ cho y học đại nói riêng và nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe cho nhân dân nói chung Gần đây, các phương pháp phân tích đại CE, UPLC thể nhiều ưu điểm vượt trội việc kiểm nghiệm dược liệu thời gian phân tích ngắn, tiêu tốn ít dung môi và mẫu,… Phương pháp CE thích hợp để định lượng các thành phần hoạt chất có khả phân ly (flavonoid, alkaloid,…) đó UPLC áp dụng cho hầu hết các nhóm hoạt chất Tuy nhiên, chưa tìm thấy nhiều tài liệu cơng bố việc dùng các phương pháp đại này để định lượng thành phần hoạt chất chi Vitex nói chung và dược liệu Quan âm biển nói riêng Flavonoid thành phần hoạt chất chính Quan âm biển Đây là thành phần đóng góp đáng kể vào các tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng ung thư, điều hòa nội tiết tố… cho dược liệu này.3 Do đó, đề tài đặt vấn đề xây dựng quy trình định lượng các flavonoid chính lá Quan âm biển (Vitex rotundifolia L f., Verbenaceae) với mong muốn tìm kiếm phương pháp mới việc kiểm nghiệm dược liệu này Đề tài được thực với mục tiêu cụ thể sau: - Thăm dò và chuẩn hóa điều kiện phân tích định lượng flavonoid lá Quan âm biển bằng phương pháp phân tích đại CE, UPLC - Khảo sát điều kiện thích hợp để xây dựng quy trình chiết xuất định lượng flavonoid lá Quan âm biển - Định lượng so sánh mẫu Quan âm biển thu hái ở hai tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Tên khoa học: Vitex rotundifolia L.f Tên đồng nghĩa: Vitex trifolia var simplicifolia Cham, Vitex trifolia var ovata (Thunb.) Makina, Vitex trifolia var unifoliata Schauer, Vitex ovata Thunb Tên thường gọi: Quan âm biển, Màn kinh tử, Từ bi biển, Mạn kinh lá đơn, Mạn kinh lá nhỏ, Bình linh xoan.4 1.1.2 Vị trí bảng phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại Takhatajan và Phạm Hoàng Hộ, vị trí loài Vitex rotundifolia L.f được xếp sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Hoa môi (Lamiidae) Bộ Hoa môi (Lamiales) Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Chi Vitex Lồi Vitex rotundifolia L.f.5 1.1.3 Mơ tả thực vật Dạng sống: Cây gỗ nhỏ, cao từ 10-40 cm, mọc sà bên bờ biển tạo nên thảm dày, có tới 10 m tính từ gốc Thân non tiết diện vuông, màu xanh mốc, thân già tiết diện tròn, bề mặt nứt nẻ, màu vàng nâu hay nâu, có mùi thơm Lá: Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập, có mùi thơm, kích thước 2-6,5 x 1-4,5 cm, hình dạng biến thiến, thường dạng trứng ngược hình thìa với đỉnh tù, đáy thn, mặt xanh đậm có lơng tơ mặt dưới Cuống lá ngắn gần khơng có Hoa: Hoa có màu tím xanh, lưỡng tính, chùm xim mọc ở ngọn cành dài 3-10 cm Đài hoa hình chén, đài gần đều, kích thước khoảng 0,4-0,5 cm, nhiều lông mịn ở ngoài, bên nhẵn, tiền khai van Tràng hoa không đều, dính thành ống hẹp bên dưới dài khoảng 0,8 cm, phía chia làm mơi 2/3, có màu tím hay tím hoa cà; mặt và ngoài ống tràng có nhiều lông mịn, tiền khai điểm Bộ nhị gồm có nhị, kiểu hai trội, hai nhị trước dài hai nhị sau, có kích thước khoảng 0,8-1,2 cm, chỉ nhị màu trắng hay tím nhạt, có nhiều lông ở gốc chỉ nhị Bao phấn màu tím, hình bầu dục, b̀ng, nứt dọc, đính Hạt phấn hình bầu dục có rãnh dọc Bầu hình cầu gờm nỗn có vách giả chia làm ơ, nỗn, đính nỗn trung trụ Quả: Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,5-0,65 cm; cịn non có màu xanh cây, chín màu vàng hay đỏ, quả khơ màu nâu sẫm Đài đồng trưởng bao lấy 1/3 - 2/3 phía dưới quả, màu trắng xám, khó vỡ Bên quả chia làm ô, ô hạt Quả có mùi đặc trưng, vị nóng Hạt: Hạt màu trắng xám, thường 1-2 phát triển.6, 1.1.4 Bộ phận dùng Thường là quả, thu hái vào mùa thu chín rửa sạch và loại bỏ cuống, phơi hay sấy khô, dùng tươi qua Lá và hạt, rễ được sử dụng bằng cách xông hay sắc lấy nước uống.8 1.2 TỞNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC Trong năm gần đây, Vitex rotundifolia L.f được nghiên cứu và phân lập chủ yếu nhóm hợp chất chính: flavonoid, terpenoid, irrioid lignan Ngồi cịn có ecdysteroid, glucosid, phenolic acid…9, 10 Flavonoid Vitex rotundifolia L.f chủ yếu thuộc nhóm euflavonoid, thường là polymethoxyflavonoid mà tiêu biểu là các flavonol với vòng B có nhóm như: casticin, artemin, quercetagenin Trong đó, casticin là flavonoid có hàm lượng cao cây, đặc biệt là ở lá và quả Dược điển Trung Quốc 2005 quy định casticin là chất chuẩn Vitex rotundifolia L.f với hàm lượng không nhỏ 0,3% Casticin (vitexicarpin) ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm khả tác động kiểu estrogen,2 điều hòa miễn dịch11 hay ức chế các tế bào ung thư bằng chế cảm ứng quá trình apoptosis.12 Ngồi flavonol, cịn có các flavon luteolin và các dẫn xuất glycosid nó: luteolin 6-C-βglucopyranosid (isoorientin), luteolin 7-O-β-glucuronid, luteolin 7-O-βglucopyranosid (cynarosid), luteolin 3-O- β-glucuronid apigenin 6-C-β-glucosid (isovitexin).13 Terpenoid Vitex rotundifolia L.f chủ yếu là các diterpen có cấu trúc khung labdan-diterpen chiếm hàm lượng cao thành phần hóa học quả và lá Vitex rotundifolia L.f 14 Tính đến nay, có khoảng gần 30 diterpen được phân lập đó đặc biệt rotundifuran và trisnor-γ-lacton có khả kháng ung thư nhờ tác động cảm ứng quá trình apoptosis.15 Irioid Vitex rotundifolia nói riêng chi Vitex nói chung thường là các monoterpen cấu trúc đơn giản, có trường hợp bị mở vòng lacton 1-oxoeucommiol tạo liên kết -O-glycosid với α-D-glucose agnusid.16 Lignan có chủ yếu rễ Vitex rotundifolia với cấu trúc chính là arylnaphtalenlignan Trong đó, vitrofolan C D được nghiên cứu và chứng minh có khả kháng khuẩn cao, đặc biệt là có hiệu quả với MRSA.17 R1 R2 Casticin OMe OH Artemin OMe OMe Quercetagenin OH OH Penduletin OH H R1 O MeO R2 OMe MeO OH O OH OH OH OMe O MeO H O HO R MeO OH OH O O R1 3’,5-dihydroxy-4’,6,7-trimethoxyflavanon Luteolin H Quercetin OH OH OH OH OH HO HO HO O O O O O OH OH OH OH OH O OH OH O OH Luteolin 7-O-β-glucopyranosid (cynarosid) Luteolin 6-C-β-glucopyranosid (isoorientin) OH OH O HO O O O OH OH OH OH O Luteolin 7-O-β-glucuconid Hình 0.1 Cấu trúc hóa học flavonoid Vitex rotundifolia L.f Thời gian (phút) Nước acid formic 0,2% Acetonitril acid formic 0,2% 91,3 8,7 27 90,8 9,2 28 66,5 33,5 38 66,5 33,5 39 10 90 44 10 90 - Tốc độ dòng: 0,15 ml/phút; - Nhiệt độ cột: 40oC; - Thể tích tiêm: 0,7 µl; 3.4 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHUẨN BỊ MẪU 3.4.1 Khảo sát dung môi chiết Kết quả được trình bày ở hình 3.20, bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát dung môi chiết STB Acetonitril Methanol 100% Methanol 90% Methanol 80% (µV x giây) Isoorientin 34378 782671 801752 800912 Cynarosid 31790 87234 97224 97281 Casticin 200347 199706 199375 175194 900000 800000 700000 600000 500000 Isoorientin 400000 Cynarosid 300000 Casticin 200000 100000 Acetonitril Methanol 100% Methanol 90% Methanol 80% Hình 3.20 Biểu đồ minh họa hiệu chiết dung môi khảo sát Nhận xét: Dung môi methanol 90% cho hiệu quả chiết cao nhất nên chọn làm dung môi chiết 3.4.2 Khảo sát thời gian chiết 36 Kết quả được trình bày ở hình 3.21, bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian chiết STB (µV x giây) 15 phút 30 phút 45 phút Isoorientin 135268 140023 140018 Cynarosid 15054 19092 19108 Casticin 24692 32969 32968 160000 140000 120000 100000 Isoorientin 80000 Cynarosid 60000 Casticin 40000 20000 15 phút 30 phút 45 phút Hình 3.21 Biểu đồ khảo sát thời gian chiết Nhận xét: So sánh hiệu suất chiết hai thời điểm 30 phút 45 phút nhận thấy sự khác khơng có ý nghĩa Do đó, chọn thời gian chiết mẫu 30 phút 3.4.3 Khảo sát số lần chiết Kết quả được trình bày hình 3.22, bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết khảo sát số lần chiết Lần Lần STB (µV x giây) (50 mg/15 ml) 50 mg/ml (50 mg/5 ml) 50 mg/ml Isoorientin 140023 2100345 (97,76%) 9632 48160 (2,24%) Cynarosid 19092 286380 (98,94%) 612 3060 (2,24%) Casticin 32969 494535 (99,53%) 461 2305 (0,47%) 37 2500000 2000000 1500000 Isoorientin Cynarosid Casticin 1000000 500000 Lần Lần Hình 3.22 Biểu đồ kết khảo sát số lần chiết Nhận xét: Sau lần chiết, hiệu suất chiết đạt 97% Vì vậy, chọn sớ lần chiết lần Quy trình chiết Cân xác khoảng 50 mg bột Quan âm biển cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, thêm 15 ml methanol 90%, siêu âm (mức lượng sóng siêu âm 100% thiết kế máy) ở nhiệt độ 60 C ± C vịng 30 phút, sau lọc lấy dịch, rửa bã dược liệu bằng ml methanol 90%, gộp chung vào dịch lọc, đến cắn Hịa cắn bằng methanol 90% cho vào bình định mức ml, thêm dung mơi cho đủ thể tích bình, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm trước phân tích bằng UPLC theo điều kiện chọn 3.5 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ISOORIENTIN, CYNAROSID VA CASTICIN TRONG LÁ QUAN ÂM BIỂN 3.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống Kết quả tóm tắt được trình bày ở hình 3.23 bảng 3.6 38 Hình 3.23 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 3.6 Tóm tắt kết khảo sát tính tương thích hệ thống Isoorientin Cynarosid Casticin tR (phút) S (µV x giây) k’ N α Rs As TB 9,81 422653,83 17,51 7226 - - 1,00 SD 0,09 1298,71 0,16 56,98 - - 0,01 RSD% 0,88 0,31 0,93 0,79 - - 1,17 TB 22,52 55530,83 41,50 9101,50 1,16 3,57 1,05 SD 0,16 1137,68 0,29 168,27 0,01 0,05 0,06 RSD% 0,69 2,04 0,71 1,85 0,45 1,45 5,45 TB 37,28 101688,67 69,33 193467,67 1,11 14,20 1,02 SD 0,01 617,08 0,03 3663,43 0,00 0,07 0,01 RSD% 0,03 0,61 0,04 1,89 0,00 0,52 0,82 Nhận xét: RSD thơng số diện tích pic S, thời gian lưu tR, số đĩa lý thuyết N đều < 2,0%, thông số khác đều đạt: - Hệ số dung lượng (k’ ≥ 1) - Hệ số bất đối (0,8 ≤ As ≤ 1,5) - Độ phân giải (Rs > 1,5) - Độ chọn lọc (1,05≤ ≤ 2,0) Như vậy, hệ thớng có hiệu phù hợp 3.5.2 Khảo sát tính tuyến tính (khoảng xác định) Kết quả được trình bày bảng 3.7, bảng 3.8 39 Bảng 3.7 Mối tương quan nồng độ diện tích pic chất đối chiếu Isoorientin Cynarosid Casticin C (µg/ml) STB (µV x giây) C (µg/ml) STB (µV x giây) C (µg/ml) STB (µV x giây) 100 1371900 100 626369 100 1436275 50 704422 20 124447 20 287157 25 363350 10 62148 10 144909 10 147680 30363 74422 29435 12513 28985 14883 7257 0,4 5453 Bảng 3.8 Kết xử lý thống kê phương trình hồi quy tuyến tính chất đối chiếu Kết quả xử lý thống kê Isoorientin Cynarosid Casticin 0,9997 1,0000 1,0000 Hệ số B 9185 -229 818 Giá trị t hệ số B 1,65 -0,59 1,40 Hệ số B0 13705 6264 14354 Giá trị t hệ số B0 115,83 674,05 1030,03 13417,07 454343,18 1060954,42 Giá trị F0,05 7,71 7,71 7,71 Giá trị t0,05 2,78 2,78 2,78 yˆ = 13705x yˆ = 6264x yˆ = 14354x - 100 - 100 0,4 - 100 R2 Giá trị F Phương trình hời quy Khoảng xác định (µg/ml) Phương trình hời quy isoorientin: Xét tính thích hợp phương trình hời quy Có F = 13417,07 > F0,05 = 7,71 nên phương trình hời quy tương thích; Xét hệ số B0: Có t = 115,83 > t0,05 = 2,78 nên hệ số B0 có ý nghĩa; Xét hệ số B: Có t = 1,65 < t0,05 = 2,78 nên hệ số B không có ý nghĩa; Do đó phương trình hời quy isoorientin: yˆ = 13705x; R2 = 0,9997 Vậy có sự tương quan tuyến tính nờng độ isoorientin và diện tích pic Phương trình hời quy cynarosid: Xét tính thích hợp phương trình hời quy Có F = 454343,18 > F0,05 = 7,71 nên phương trình hời quy tương thích; 40 Xét hệ số B0: Có t = 674,05 > t0,05 = 2,78 nên hệ số B0 có ý nghĩa; Xét hệ số B: Có t = − 0,59 < t0,05 = 2,78 nên hệ số B khơng có ý nghĩa; Do đó phương trình hời quy cynarosid: yˆ = 6264x; R2 = 1,0000 Vậy có sự tương quan tuyến tính nờng độ cynarosid và diện tích pic Phương trình hời quy casticin: Xét tính thích hợp phương trình hời quy Có F = 1060954,42 > F0,05 = 7,71 nên phương trình hời quy tương thích; Xét hệ số B0: Có t = 1030,03 > t0,05 = 2,78 nên hệ số B0 có ý nghĩa; Xét hệ số B: Có t = 1,40 < t0,05 = 2,78 nên hệ số B không có ý nghĩa; Do đó phương trình hời quy casticin: yˆ = 14354x; R2 = 1,0000 Vậy có sự tương quan tuyến tính nồng độ casticin và diện tích pic yˆ yˆ Hình 3.24 Đường tuyến tính isoorientin chiết Hình 3.25 Đường tuyến tính cynarosid Vậy, phương trình tún tính ˆ = 6264x; y Casticin: ˆ = 14354x; y Khoảng tún tính Cynarosid: – 100 µg/ml; Casticin: 0,4 – 100 µg/ml Isoorientin: yˆ = 13705x; Isoorientin: – 100 µg/ml; 3.5.3 Khảo sát độ đặc hiệu Kết quả được trình bày ở hình 3.27 41 Hình 3.26 Đường tuyến tính casticin chiết chiết Cynarosid: yˆ = 14354x R2 = 1,0000 = 6264x R2 = 1,0000 = 13705x R2 = 0,9997 Hình 3.27 Kết khảo sát độ đặc hiệu Nhận xét: Thời gian lưu, phổ UV pic isoorientin, cynarosid, casticin dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn tương đương Mẫu trắng khơng có tín hiệu pic Chiều cao diện tích pic chất cần định lượng mẫu thử thêm chuẩn cao so với mẫu thử Các pic chất cần định lượng tách hồn tồn khơng có thành phần khác sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic (phụ lục) Như vậy, quy trình đạt đợ đặc hiệu 3.5.4 Khảo sát độ lặp lại Kết quả được trình bày ở hình 3.28, bảng 3.9 Hình 3.28 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại 42 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ lặp lại isoorientin, cynarosid casticin Isoorientin Cynarosid Casticin tR (phút) S (µV x giây) TB 9,78 426820,83 SD 0,17 8553,55 RSD% 1,70 2,00 TB 22,44 56166,00 SD 0,45 1149,07 RSD% 2,02 2,04 TB 37,32 103768,50 SD 0,04 1930,11 RSD% 0,11 2,04 Kết luận: Phương pháp có độ lặp lại với RSD chất cần định lượng 2,0% đạt yêu cầu định lượng Như vậy, nồng độ chất phân tích mẫu thử 10 mg/ml là: isoorientin 31,14 µg/ml, cynarosid 8,97 µg/ml, casticin 7,23 µg/ml hàm lượng isoorientin, cynarosid, casticin 50 mg dược liệu lần lượt 155,72 µg; 44,83 µg; 36,15 µg 3.5.5 Khảo sát độ Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 Theo Ludwig Huber*, nồng độ chất phân tích dưới 100 µg/ml, tỷ lệ phục hời cho phép khoảng 90 – 107%, RSD% cho phép ≤ 5,3% Như vậy, quy trình định lượng đạt yêu cầu độ *Ludwig Huber (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second edition, pp 144, 146 43 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ S T T Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) Kết quả 123,48 99,10 128,48 103,12 127,11 102,01 TB: 101,41 SD: 2,07 RSD%: 2,04 152,64 98,03 156,20 100,32 156,73 100,66 186,75 99,92 182,66 97,73 190,13 101,73 35,21 98,08 37,31 103,94 34,51 96,13 43,98 98,17 43,75 97,65 47,48 105,99 53,95 100,27 52,67 97,91 54,77 101,81 28,18 97,51 29,26 101,25 29,00 100,35 35,41 97,82 36,01 99,49 35,43 97,88 43,49 100,20 42,64 98,25 42,79 98,60 100% 100% 100% 120% Casticin 80% 120% Cynarosid 80% 120% Isoorientin 80% 124,6 155,7 186,9 35,9 44,8 53,8 28,9 36,2 43,4 3.5.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả được trình bày ở bảng 3.11 44 TB: 99,67 SD: 1,43 RSD%: 1,43 TB: 99,79 SD: 2,00 RSD%: 2,00 TB: 99,38 SD: 4,06 RSD%: 4,09 TB: 100,60 SD: 4,67 RSD%: 4,64 TB: 100,00 SD: 1,97 RSD%: 1,97 TB: 99,71 SD: 1,95 RSD%: 1,96 TB: 98,39 SD: 0,95 RSD%: 0,96 TB: 99,02 SD: 1,04 RSD%: 1,05 Bảng 3.11 Giới hạn định lượng giới hạn phát chất đối chiếu Isoorientin Cynarosid Casticin LOQ (µg/ml) LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) LOD (µg/ml) 4,05 1,33 0,62 0,21 0,41 0,13 Quy trình định tính, định lượng đồng thời isoorientin, cynarosid casticin Quan âm biển Chuẩn bị mẫu: Cân xác khoảng 50 mg bột Quan âm biển cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, thêm 15 ml methanol 90%, siêu âm (mức lượng sóng siêu âm 100% thiết kế máy) ở nhiệt độ 60C ± 2C vòng 30 phút, sau đó lọc lấy dịch, rửa bã dược liệu bằng ml methanol 90%, gộp chung vào dịch lọc, cô đến cắn Hịa cắn bằng methanol 90% cho vào bình định mức ml, thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm trước phân tích bằng UPLC Điều kiện phân tích UPLC - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu Waters model UPLC Acquity H-Class D12QSM851A; - Đầu dò PDA B12UPD859A; - Bước sóng phát hiện: 349 nm; - Cột sc ký: Acquity UPLCđ BEH C18 (130; 1,7 àm; 2,1 mm x 50 mm); - Chương trình rửa giải Thời gian (phút) Nước acid formic 0,2% Acetonitril acid formic 0,2% 91,3 8,7 27 90,8 9,2 28 66,5 33,5 38 66,5 33,5 39 10 90 44 10 90 - Tốc độ dòng: 0,15 ml/phút; - Nhiệt độ cột: 40 oC; - Thể tích tiêm: 0,7 µl; Hàm lượng chất isoorientin, cynarosid casticin được tính theo cơng thức 45 X = St k  Cc   p  100 Sc m(1 − h) Trong đó: X: hàm lượng isoorientin, cynarosid casticin dược liệu (%) Sc: diện tích pic thu được mẫu chuẩn (µV x giây) St: diện tích pic thu được mẫu thử (µV x giây) Cc: nờng độ mẫu chuẩn (mg/ml) k: độ pha loãng mẫu đo m: khối lượng dược liệu (mg) h: độ ẩm dược liệu (%) p: độ tinh khiết chất đối chiếu (%) 3.6 ĐỊNH LƯỢNG SO SÁNH CÁC FLAVONOID TRONG LÁ QUAN ÂM BIỂN THU HÁI Ở PHÚ YÊN VÀ NHA TRANG Hàm lượng các flavonoid chính lá Quan âm biển thu hái ở Nha Trang và Phú Yên được trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12 Hàm lượng flavonoid mẫu thu hái Nha Trang Phú Yên Flavonoid Nha Trang Phú Yên Isoorientin 0,35% 0,30% Cynarosid 0,10% 0,12% Casticin 0,08% 0,05% 46 CHƯƠNG BÀN LUẬN Ba thành phần được chọn định lượng đề tài flavonoid quan trọng có hàm lượng lớn Quan âm biển (trong đó casticin được cho thành phần có hoạt tính sinh học chính, isoorientin flavonoid có hàm lượng lớn nhất, chiếm 36.8–45.9% flavonoid tồn phần13) Đề tài định lượng đờng thời các flavonoid có độ phân cực không giống (casticin polymethoxy aglycon, isoorientin cynarosid hai glycosid), hai chúng lại đồng phân (cynarosid O-glycosid isoorientin Cglycosid) Do đó, dù chế độ rửa giải đẳng môi thường được ưu tiên lựa chọn trường hợp này tỏ không phù hợp Chương trình rửa giải tiệm tiến được chọn khả tách tốt hơn, rút ngắn được thời gian phân tích hơn, Với CE, việc định lượng gặp khó khăn độ lặp lại phương pháp khơng cao, thành phần mẫu thử phức tạp, chưa tìm được phương pháp xử lý mẫu phù hợp và điều kiện tách tối ưu Hơn nữa, so với sắc ký lỏng, CE vẫn chưa phổ biến thông dụng phịng thí nghiệm nước ta nên việc ứng dụng phương pháp thực tế kiểm nghiệm cần bước qua quãng đường dài tương lai So với HPLC, UPLC thể hiệu quả vượt trội việc phân tách pic, rút ngắn thời gian phân tích, tiết kiệm dung mơi, độ nhạy cao 47 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt số kết quả sau: - Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đờng thời ba flavonoid casticin, cynarosid isoorientin Quan âm biển bằng phương pháp UPLCPDA ➢ Đã khảo sát điều kiện UPLC (chương trình rửa giải, tốc độ dòng, nhiệt độ cột), khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử (dung mơi chiết, thời gian chiết, số lần chiết), xây dựng phương pháp định lượng; ➢ Đã đánh giá quy trình theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích ICH, kết quả đạt được yêu cầu đặt quy trình định lượng, cụ thể sau: ✓ ✓ ✓ ✓ Khoảng tuyến tính Giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát (LOD) isoorientin: – 100 µg/ml; cynarosid: – 100 µg/ml; casticin: 0,4 – 100 µg/ml; isoorientin: 4,05 µg/ml; cynarosid: 0,62 µg/ml; casticin: 0,41 µg/ml; isoorientin: 1,33 µg/ml; cynarosid: 0,21 µg/ml; casticin: 0,13 µg/ml; Quy trình có độ đặc hiệu, độ lặp lại và độ đạt yêu cầu ➢ Kết quả hàm lượng flavonoid isoorientin, cynarosid, casticin Quan âm biển thu hái ở Nha Trang lần lượt 0,35%, 0,10%, 0,08% và mẫu ở Phú Yên lần lượt là 0,3%, 0,12%, 0,05% 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Zahid, H et al, Phytopharmacological Review on Vitex agnus-castus: A Potential Medicinal Plant Chinese Herbal Medicines 2016, 8, 24-29 Hu, Y et al, Evaluation of the estrogenic activity of the constituents in the fruits of Vitex rotundifolia L for the potential treatment of premenstrual syndrome The Journal of pharmacy and pharmacology 2007, 59, 1307-12 Suchitra, M., Vitex trifolia: An ethnobotanical and pharmacological review Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2018, 11 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam TP Hồ Chí Minh, 2003; Vol Takhtajan, A., Flowering plant Springer: 2009 Munir, A A., A taxonomic revision of the genus Vitex L.(Verbenaceae) in Australia Journal of the Adelaide Botanic Garden 1987, 31-79 Chen, S et al, Flora of China 1994; Vol 17 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc và vị thuốc Việt Nam NXB Y học: TP Hồ Chí Minh, 2000 Yoshioka, T et al, Phenolic compounds and flavonoids as plant growth regulators from fruit and leaf of Vitex rotundifolia Zeitschrift für Naturforschung C 2004, 59, 509514 10 Kondo, Y et al, Studies on the Constituents of Vitex rotundifolia L fil Chemical & pharmaceutical bulletin 1986, 34, 4829-4832 11 Mesaik, M A et al, Isolation and immunomodulatory properties of a flavonoid, casticin from Vitex agnus‐castus Phytotherapy Research 2009, 23, 1516-1520 12 Chan, E W C et al, Casticin from Vitex species: a short review on its anticancer and anti-inflammatory properties Journal of Integrative Medicine 2018, 16, 147-152 13 Iwashina, T et al, Flavonoids from the leaves of Vitex rotundifolia (Verbenaceae), and their qualitative and quantitative comparison between coastal and inland populations Bull Natl Mus Nat Sci Ser B 2011, 37, 87-94 14 Bao, F et al, Terpenoids from Vitex trifolia and their anti-inflammatory activities Journal of natural medicines 2018, 72, 570-575 15 Jun W et al, Cytotoxic Terpenoids from the Fruits of Vitex trifolia Planta Med 2009, 75(4), 367-370 16 Zhao, Y.-Y et al, A new iridoid glycoside from the fruits of Vitex rotundifolia Natural product research 2017, 31, 2491-2496 17 Kawazoe, K et al, Phenylnaphthalene compounds from the subterranean part of Vitex rotundifolia and their antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus Journal of natural products 2001, 64, 588-591 18 Lee, C et al, Anti-inflammatory constituents from the fruits of Vitex rotundifolia Bioorganic & medicinal chemistry letters 2013, 23, 6010-6014 19 Choi, J.-K et al, Effects of Vitex rotundifolia on radical scavenging and nitric oxide production Orient Pharm Exp Med 2010, 10, 51-58 20 Ye, Q et al, Casticin, a flavonoid isolated from Vitex rotundifolia, inhibits prolactin release in vivo and in vitro Acta Pharmacologica Sinica 2010, 31, 1564-1568 a 21 Bae, H et al, Vitex rotundifolia L prevented airway eosinophilic inflammation and airway remodeling in an ovalbumin-induced asthma mouse model International immunology 2013, 25, 197-205 22 Lee, H et al, A new compound, 1H, 8H-pyrano [3, 4-c] pyran-1, 8-dione, suppresses airway epithelial cell inflammatory responses in a murine model of asthma International Journal of Immunopathology and Pharmacology 2009, 22, 591-603 23 Ko, W G et al, Rotundifuran, a labdane type diterpene from Vitex rotundifolia, induces apoptosis in human myeloid leukaemia cells Phytotherapy Research 2001, 15, 535-537 24 Ko, W G et al, Effects of luteolin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human myeloid leukaemia cells Phytotherapy research 2002, 16, 295-298 25 You, K M et al, Vitexicarpin, a flavonoid from the fruits of Vitex rotundifolia, inhibits mouse lymphocyte proliferation and growth of cell lines in vitro Planta Medica 1998, 64, 546-550 26 Hu, Y et al, Population genetic structure of the medicinal plant Vitex rotundifolia in China: implications for its use and conservation Journal of integrative plant biology 2008, 50, 1118-1129 27 Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng NXB Khoa học và kỹ thuật: Hà Nội, 2004; Vol b ... 1,6 9 0,0 9 5,0 9 Rs 2 6,2 4 2 5,9 5 2 6,1 1 2 5,7 8 2 5,1 7 2 6,1 9 2 5,9 1 0,4 0 1,5 4 tR 9,8 5 9,9 1 9,8 1 9,8 7 9,8 9 9,9 3 9,8 8 0,0 4 0,4 4 A 4 0,8 7 4 2,4 1 5 5,5 2 4 9,1 4 5 3,3 8 4 9,2 3 4 8,4 3 4,8 6 1 0,0 3 AF 0,3 9 0,4 1 0,4 3 0,4 9... 0,4 9 0,3 1 0,4 2 0,5 4 0,0 7 1 2,7 6 Rs 4,2 2 4,0 8 4,2 7 4,2 3 4,1 9 4,3 5 4,2 2 0,0 9 2,1 2 tR 1 3,7 6 1 3,8 5 1 3,6 7 1 3,7 9 1 3,6 4 1 3,8 2 1 3,7 6 0,0 8 0,6 1 A 6 5,2 9 6 6,7 1 6 0,1 2 5 5,5 4 6 5,0 2 6 8,7 4 6 3,5 7 5,8 2 9,1 5 AF 0,4 7... 9 9,9 2 18 2,6 6 9 7,7 3 19 0,1 3 10 1,7 3 3 5,2 1 9 8,0 8 3 7,3 1 10 3,9 4 3 4,5 1 9 6,1 3 4 3,9 8 9 8,1 7 4 3,7 5 9 7,6 5 4 7,4 8 10 5,9 9 5 3,9 5 10 0,2 7 5 2,6 7 9 7,9 1 5 4,7 7 10 1,8 1 2 8,1 8 9 7,5 1 2 9,2 6 10 1,2 5 2 9,0 0 10 0,3 5 3 5,4 1 9 7,8 2