Ứng dụng phương pháp hplc pda để định lượng β amyrin trong cao lá mỏ quạ (dischiadia major vahl ) được chiết xuất bằng phương pháp bọt khí có hỗ trợ của siêu âm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG VĂN PHÚC ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-PDA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG β – AMYRIN TRONG CAO LÁ MỎ QUẠ (Dischidia major Vahl.) ĐƯỢC CHIẾT XUẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỌT KHÍ CĨ HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG VĂN PHÚC ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-PDA ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG β – AMYRIN TRONG CAO LÁ MỎ QUẠ (Dischidia major Vahl.) ĐƯỢC CHIẾT XUẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỌT KHÍ CĨ HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN TẤN KHÔI TS PHAN VĂN HỒ NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam kết cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Hồng Văn Phúc TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: β – amyrin hợp chất bầu Mỏ quạ (Dischidia major (Vahl) Merr., Apocynaceae) với tác dụng dược lý kháng viêm Nhưng với nghiên cứu trước việc chiết xuất tinh chế β – amyrin từ bầu Mỏ quạ (lá bầu D major)sử dụng phương pháp gây hại cho mơi trường Và chưa có cơng trình định lượng β – amyrin bầu D major phương pháp HPLC - PDA Do đó, ứng dụng phương pháp HPLC – PDA để định lượng β – amyrin cao bầu D major chiết xuất phương pháp bọt khí có hỗ trợ siêu âm cần thiết Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Lá bầu Mỏ quạ (Dischidia major (Vahl) Merr., Apocynaceae) Phương pháp nghiên cứu: Quy trình định lượng β – amyrin phương pháp HPLC – PDA bầu D major khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thẩm định theo ICH 2005 AOAC 2012 Quy trình chiết bọt khí với hỗ trợ siêu âm khảo sát trình loại tạp phân cực, khảo sát nồng độ ethanol siêu âm khảo sát chất diện hoạt để hiệu suất chiết β – amyrin cao Kết quả: Lá bầu D major siêu âm với ethanol 96 % tiếng Dịch siêu âm quay hịa tan lại với methanol lọc qua màng lọc 0,45 µm để định lượng HPLC – PDA Quy trình định lượng β – amyrin cao bầu D major thẩm định đạt tiêu chuẩn quy trình định lượng theo ICH 2005 AOAC 2012 với hàm lượng trung bình β – amyrin cao bầu D major 1,22 % Lá bầu D major loại tạp phân cực cách ngâm với nước nóng 70 oC tiếng thực lần Bã sau loại tạp phân cực siêu âm với ethanol 10 % Dịch siêu âm sục bọt khí với điều kiện: cột kính (50 cm x 10 cm x 10 cm) trang bị máy tạo bọt 61 kim, kim có đường kính 150 μm, vận tốc khí 158 l/phút, ổn định nhiệt độ dung dịch chiết từ 12 oC đến 14 oC, bổ sung 0,04 mM CTAB, thu hồi lớp bọt dày, bền Quá trình chiết thu hiệu suất 100,42 % với RSD% (n=6) 1,70 % Khi áp dụng để chiết β – amyrin từ dược liệu phương pháp chiết bọt khí có hỗ trợ siêu âm thu hiệu suất 76,21 %, cao thu có hàm lượng β – amyrin 25,56 % Kết luận: Quy trình định lượng β – amyrin cao bầu D major phương pháp HPLC đạt tiêu chuẩn quy trình định lượng theo ICH 2005 AOAC 2012 Đã sử dụng thành công phương pháp chiết bọt khí với kết hợp siêu âm để chiết β – amyrin từ bầu D major Từ khóa: β – amyrin, Dischidia major, HPLC – PDA, chiết bọt khí, siêu âm ABSTRACT APPLICATION OF HPLC - PDA METHOD TO QUANTIFY β – AMYRIN IN LEAF FROM DISCHIDIA MAJOR VAHL EXTRACT BY ULTRASOUND – ASSISTED EXTRACTION COUPLED WITH GAS BUBBLE FLOTATION Background – Objectives: β – amyrin is the main compound in the leaves of Dischidia major (Vahl) Merr., Apocynaceae with the main pharmacological action being anti-inflammatory But with previous studies, the extraction and purification of β – amyrin from the leaves of D major used methods that are harmful to the environment And there has not been any work to quantify β – amyrin in the leaves of D major by HPLC - PDA method Therefore, it is necessary to apply the HPLC - PDA method to quantify β – amyrin in the extracts of D major leaves extracted ultrasound – assisted extraction coupled with gas bubble flotation method Method: Quantitative process of β – amyrin by HPLC – PDA method in D major leaves will be investigated for sample preparation process and verified according to ICH 2005 and AOAC 2012 The process of extracting air bubbles with the help of ultrasound will be investigated the process of removing polar impurities, investigating the concentration of ethanol and investigating the surfactant so that the extraction efficiency of β – amyrin is the highest Results: Leaves of D major will be sonicated with 96 % ethanol for hour The ultrasonic solution was evaporated and re-dissolved with methanol, then filtered through a 0.45 µm filter for quantification by HPLC-PDA The quantification process of β – amyrin in D major leaves was evaluated and met the standards of a quantitative procedure according to ICH 2005 and AOAC 2012 with the average content of β – amyrin in D major leaves being 1.22 % D major leaves were removed by soaking in hot water of 70 oC for hour and performed times The residue after removing polar impurities will be sonicated with 10% ethanol for hour The ultrasonic solution will be aerated with the condition: the glass column (50 cm x 10 cm x 10 cm) is equipped with a 61 – needle foam generator, each needle has a diameter of 150 μm, the gas velocity is 158 l/min , stabilize the extraction solution temperature from 12 oC to 14 oC, add 0.04 mM CTAB, recover thick, durable foam The extraction obtained an yield of 100.42 % with an RSD% (n = 6) of 1.70 % When applied to extract β – amyrin from medicinal herbs by the ultrasonic-assisted air bubble extraction method, the yield was 76.21 %, and the β – amyrin content was 25.56% Conclude: The process of quantifying β – amyrin in D major leaves by HPLC method met the standards of a quantitative procedure according to ICH 2005 and AOAC 2012 Successfully used the ultrasound – assisted extraction coupled with gas bubble flotation method to extract β - amyrin from the leaves of D major Keywords: β - amyrin, Dischidia major, HPLC - PDA, air bubble extraction, ultrasound viii MỤC LỤC MỤC LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG BIỂU xi DANH MỤC HÌNH ẢNH xii DANH MỤC SƠ ĐỒ xiii MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan Dischidia major (Vahl) Merr., Apocynaceae 2.2 Tổng quan β – amyrin 2.3 Tổng quan phương pháp chiết bọt khí có hỗ trợ siêu âm 14 2.4 Tổng quan định lượng β – amyrin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 17 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.2 Nguyên vật liệu 18 3.3 Trang thiết bị – dụng cụ 19 3.4 Nơi thực đề tài luận văn 19 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 4.1 Xây dựng quy trình định lượng β – amyrin 33 4.2 Chiết xuất cao β – amyrin từ bầu D major bằng phương pháp bọt khí với hỗ trợ siêu âm 45 ix BÀN LUẬN 54 5.1 Quy trình định lượng β – amyrin bầu D major phương pháp HPLC 54 5.2 Chiết xuất cao β – amyrin từ bầu D major bằng phương pháp bọt khí với hỗ trợ siêu âm 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 6.1 Kết luận 64 6.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên AOAC Association of Official Analytical Chemists AS Asymmetry CE Capillary electrophoresis CTAB Cetrimonium bromide CZE Capillary zone electrophoresis D major Dischidia major (Vahl) Merr., Apocynaceae DAD Diod array detector GC Gas chromatography HPLC High performance liquid chromatography HPTLC High performance thin layer chromatography ICH International Conference on Harmonization IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Nomenclature MEKC MeOH MQ MS PDA POA RS SDS SE SFE SKLM UAE UV-Vis Nghĩa tiếng Việt Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức Hệ số bất đối Điện di mao quản Cetrimonium bromid Điện di mao quản vùng Đầu dị dãy diod Sắc ký khí Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Hội nghị hài hịa quốc tế Danh pháp Hóa học theo Liên minh Quốc tế Hóa học túy Hóa học ứng dụng Micellar electrokinetic capillary Điện di mao quản micell điện chromatography động Methanol Methanol Mỏ quạ Mỏ quạ Mass spectrometry Khối phổ Photo diode array Dãy diod quang Pyrazinoic acid Acid pyrazinoic Resolution Độ phân giải Sodium dodecyl sulfat Sodium dodecyl sulfat Solubility extraction Chiết dung môi Supercritical fluid extraction Chiết lỏng siêu tới hạn Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng Ultrasound assisted extraction Chiết với hỗ trợ siêu âm Ultraviolet-visible Tử ngoại – khả kiến Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh LẦN • Pre Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 136 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • F Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 137 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 138 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • RM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 139 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh LẦN • Pre Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 140 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • F Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 141 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • RM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 142 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh LẦN • Pre Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 143 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • F Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 144 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • RM Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 145 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.3 Sắc ký đồ áp dụng phân lập tinh chế β – amyrin • Pre 96 % Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 146 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • F/MeOH Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 147 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • F/DE Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 148 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Sắc ký đò khảo sát bước sóng định lượng • 204 nm Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 149 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh • 207 nm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 150