Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men trong bánh men lá và bước đầu ứng dụng trong chế biến rượu

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ PHƯƠNG NGA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TRONG BÁNH MEN LÁ VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN RƯỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm HUẾ - 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ PHƯƠNG NGA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TRONG BÁNH MEN LÁ VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN RƯỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐỨC CHUNG HUẾ - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Đức Chung.Tôi xin cam đoan số liệu kết nêu luận văn hoàn toàn trung thực từ kết nghiên cứu có chưa cơng bố cơng trình khác Các thơng tin trích dẫn ghi rõ địa chỉ, nguồn gốc Người cam đoan Trần Thị Phương Nga ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu hồn thành luận văn, nhận ủng hộ, giúp đỡ quý thầy cô bạn bè, đồng nghiệp gia đình Trước tiên tơi xin bày tỏ lời cảm ơn âu sắc kính trọng đến thầy giáo hướng dẫn TS Nguyễn Đức Chung tận tình giảng dạy, định hướng giúp đỡ tơi trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Huế; tập thể quý thầy, giáo khoa Cơ khí Cơng nghệ tận tình giảng dạy, giúp đỡ suốt thời gian học tập làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, quý thầy cô giáo, sinh viên nghiên cứu khoa học khoa Cơ khí - Cơng nghệ, trường Đại học Nơng Lâm Huế quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực đề tài luận văn Cuối xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người ln bên để động viên, khích lệ, tạo điều kiện, ủng hộ suốt thời gian học tập, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày…tháng…năm 2019 Học viên thực Trần Thị Phương Nga iii TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm phân lập, tuyển chọn số chủng nấm men có hoạt lực cao sử dụng nguyện liệu bánh men huyện Đá Bang, tỉnh Quảng Trị bước đầu ứng dụng vào sản xuất rượu, đánh giá chất lượng rượu thành phẩm sau bổ cung chủng nấm men phân lập tuyển chọn trình lên men Các phương pháp sử dụng trình nghiên cứu: phương pháp phân lập nấm men; phương pháp vi sinh (nuôi cấy 02 môi trường khảo sát khả lên men dịng nấm men đo chiều cao cột khí sinh ống Dur Ham 02 môi trường; Định danh chủng nấm men có hoạt lực cao phương pháp CTAB –PCI; phương pháp xác định hóa sinh (xác định hàm lượng đường khử, đường tổng phương pháp Bertrand; xác định hàm lượng acid dung dịch kiềm chuẩn NaOH; xác định độ cồn cồn kế; xác định độ pH máy đo pH Thermo Scientific Orion Star), phương pháp đánh giá cảm quan, phương pháp xử lý số liệu Nghiên cứu cho thấy kết phân lập 14 dòng tế bào tuyển chọn 12 dịng tế bào có khả lên men, khảo sát 07 dịng nấm men có hoạt lực cao mang định danh đặt tên cho chủng Cystobasidium calyptogenae NML01, NML02 (Pichia guilliermondii), Dirkmeia churashimaensis NML03, Candida metapsilosis NML04, Sacchromyces cerevisiace NML01 (2), Sacchromyces cerevisiace NML05 Sacchromyces cerevisiace NML17 Sử dụng 02 dòng tế bào NML02 (Pichia guilliermondii), NML04 (Candida metapsilosis) bổ sung vào trình sản xuất rượu Nghiên cứu thời gian lên men công thức phối trộn (CT1: 0,6g/1000 g; CT2: 0,7/1000 g; CT3: 0,8/1000g; CT4: 0,9/1000g; CT5: 10/1000g; CT6: 11/1000g; CT7: 12 g/1000 g) Kết nghiên cứu cho thấy thời gian lên men ẩm (ủ) thích hợp ngày cho hàm lượng đường tổng giảm nhanh hàm lượng đường khử tăng nhanh đột biến công thức Xác định điều kiện thích hợp để lên men rượu Thời gian ủ ngày, nhiệt độ lên men 25 oC, tỷ lệ phối trộn bánh men/nguyên liệu 0,8g/1000g, thời gian lên men lỏng ngày cho sản phẩm rượu có độ rượu cao Sau xác định tỷ lệ phối trộn bánh men/ nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian lên thích hợp tiến hành bổ sung 01 chủng nấm men NML04 vào trình lên men rượu với tỷ lệ 0,2g/1000g cho độ rượu cao 46,8v/v, cho kết đánh giá cảm quan cao nhất; sau tiến hành bổ sung kết hợp 02 chủng NML04 NML02 vào trình lên men, xác định tỷ lệ bổ sung 02 chủng 0,2g: 0,2g /1000 g nguyên liệu cho độ rượu cao 46,4v/v, cho kết đánh giá cảm quan cao Rượu thành phẩm sau bổ sung 02 chủng nấm men cho độ rượu cao, thời gian lên men ngắn đạt hiệu kinh tế, không phát có mặt methanol phù hợp với tiêu chuẩn TCVN 7043:2013, nhiên lại có diện andehyt furfural iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu 3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan bánh men 1.1.1 Khái quát bánh men 1.1.2 Khái quát bánh men thuốc Bắc 1.2 Tổng quan nấm men 1.2.1 Hình thái, kích thước nấm men 1.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men 1.2.3 Thành phần hóa học tế bào nấm men 1.2.4 Dinh dưỡng nấm men 10 1.2.5 Phân loại nấm men 10 1.2.6 Vai trò nấm men 11 1.2.7 Ứng dụng nấm men 12 1.3 Tổng quan rượu 13 v 1.3.1 Giới thiệu rượu 13 1.3.2 Một số sản phẩm rượu: 15 1.3.3 Quy trình sản xuất rượu truyền thống 18 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men rượu 19 1.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 19 1.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường 19 1.4.3 Ảnh hưởng nồng độ dịch đường 19 1.4.4 Ảnh hưởng oxy hịa tan - độ hiếu khí 20 1.4.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ tới trình lên men 20 1.5 Cơ sở lý thuyết trình lên men rượu 21 1.6 Quy trình sản xuất rượu men 21 1.7 Quá trình chưng cất 23 1.8 Tình hình tiêu thụ rượu giới nước 23 1.9 Các cơng trình ngiên cứu nước men 25 1.9.1 Nghiên cứu nước 25 1.9.2 Nghiên cứu nước 26 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ sử dụng 28 2.3.1 Hóa chất 28 2.3.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng 28 2.4 Nội dung nghiên cứu 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 30 2.5.2 Phương pháp phân lập nấm men 30 2.5.3 Khảo sát khả lên men dòng nấm men phân lập môi trường khác 31 2.5.4 Định danh dịng nấm men có hoạt lực cao 31 vi 2.5.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 34 2.6 Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu 37 2.6.1 Phương pháp hóa lý 37 2.6.2 Phương pháp hóa sinh 38 2.6.3 Phương pháp cảm quan 39 2.6.4 Phương pháp xử lý số liệu 39 Chương 3: KẾT QUẢN NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập nấm men từ bánh men 40 3.1.1 Đặc điểm chủng nấm men nuôi tăng sinh môi trường Hansen lỏng 46 3.2 Khảo sát khả lên men chủng nấm men môi trường 49 3.2.1 Kết khảo sát khả lên men chủng nấm men NML01, NML02, NML03, NML04 49 3.2.2 Khảo sát khả lên men dòng nấm men NML01(2), NML02(2) NML05(2) NML06(2), NML07(2), NML08(2), NML09(2), NML02(2), NML3, NML15, NML17 MT1 51 3.2.3 Khảo sát khả lên men dòng nấm men NML01(2), NML02(2) NML05(2) NML06(2), NML07(2), NML08(2), NML09(2), NML02(2), NML3, NML15, NML17 MT2 53 3.3 Kết định danh số chủng nấm men phân lập 55 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sản xuất rượu men 70 3.4.1 Khảo sát hàm lượng đường thời gian lên men ẩm 70 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bánh men/ nguyên liệu đến khả sản xuất rượu 73 3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men 77 3.4.4 Ảnh hưởng thời gian đến trình lên men 82 3.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 đến khả sản xuất rượu 87 3.4.6 Kết phân tích hàm lượng methanol, aldehyde, furfurol 93 3.4.7 Kết đánh giá cảm quan 95 3.5 Đề xuất quy trình sản xuất rượu men quy mơ phịng thí nghiệm 96 3.5.1 Sơ đồ quy trình chế biến rượu men quy mơ phịng thí nghiệm 96 vii 3.5.2 Thuyết minh quy trình 97 3.6 Tiến hành thử nghiệm mẫu lớn kg gạo 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101 Kết luận 101 Kiến nghị 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of Variance A niger : Aspergillus niger A awamori : Aspergillus awamori A flavus : Aspergillus flavus A usami : Aspergillus flavus ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine diphosphat S cerevisive : Saccharomyces cerevisive M circinilloides : Mucor circinilloides TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam CT : Công thức %v/v : Phần trăm thể tích AOAC : Association of Official Analytical Chemists - Hiệp hội nhà hóa phân tích thống APC : Mức tiêu thụ rượu đầu người DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng EMP : Embden - Meyerhof – Parnas PTN : Phịng thí nghiệm TCN : Trước công nguyên TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế Giới CoA : Coenzyme A CTAB : Cetryl trimethylammonium bromide DTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid 170 Kết xác định hàm lượng đường tổng, đường khử, aicd tổng acid amin giai đoạn lên men lỏng tỷ lệ bánh men khác Tỷ lệ bánh men (g) Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng đường khử (%) Hàm lượng acid tổng (%) Hàm lượng Acid amin (%) CT1 4,88A 0,13a 0,36G 0,198a CT2 4,76B 0,1b 0,46F 0,175a CT3 4,24C 0,06c 0,53E 0,144b CT4 3,95D 0,05cd 0,63D 0,134b CT5 3,65E 0,04de 0,66C 0,125bc CT6 3,46F 0,04de 0,72B 0,115c CT7 3,18G 0,03e 0,84A 0,105c − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) Kết xác định nồng đọ rượu tỷ lệ bánh men khác Tỷ lệ bánh men (g) Độ rượu (v/v) CT1 41,8d CT2 43,1bc CT3 44,6a CT4 43,7b CT5 42,9bc CT6 42,8c CT7 40,2e Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) 171 Kết xác định hàm lượng đường tổng, đường khử, aicd tổng acid amin, độ rượu nhiệt độ lên men khác với thời gian lên men 15 ngày Nhiệt độ (oC) Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng đường khử (%) Hàm lượng acid tổng (%) Hàm lượng acid amin (g/l) Độ rượu (%v/v) ĐC 3,268B 0,044ab 0,476D 0,174c 42,20B 25 3,663A 0,052a 0,537C 0,140d 44,17A 30 3,107C 0,041ab 0,656B 0,251b 43,33AB 35 2,099D 0,034b 0,746A 0,276a 40,60C − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) Kết xác định hàm lượng tiêu dịch lên men sản phẩm rượu theo thời gian Thời gian (ngày) Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng đường khử (%) 10,736A 2,242a 8,147B Hàm lượng acid tổng (%) Hàm lượng acid amin (g/l) Giá trị pH 0,656b 0,207F 0,084f 3,042E 5,776C 0,119c 0,232F 0,104e 3,237C 40,40C 4,952D 0,081cd 0,315E 0,104e 3,462A 42,43B 12 4,310E 0,071cd 0,417D 0,123d 3,411B 43,47AB 15 3,671F 0,053cd 0,523C 0,147c 3,182D 44.07A 18 3,230G 0,033d 0,655B 0,165b 2,981F 43,30AB 21 2,689H 0,021d 0,710A 0,184a 2,938G 42,43B − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) Độ rượu (%v/v) 172 Kết xác định hàm lượng đường tổng, acid tổng, acid amin tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 Tỷ lệ bổ sung chủng (g) Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng acid tổng (%) Hàm lượng acid amin (%) CT8 2,25a 0,806c 0,375a CT9 2,22a 0,844b 0,194b CT10 2,03b 0,876a 0,176b − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) Kết xác định nồng độ rượu tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 Tỷ lệ bổ sung chủng (g) Độ rượu (v/v) CT8 45,3B CT9 46,8A CT10 43,9C − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) Kết phân tích cảm quan mẫu bổ sung chủng nấm men NML04 Mẫu CT8 CT9 STT Độ màu sắc Mùi Vị 8 8 10 8 8 8 8 8 7 9 8 8 8 8 8 8 8 173 Mẫu STT Độ màu sắc Mùi Vị 10 10 8 8 8 7 7 8 8 8 8 9 8 8 8 CT10 Điểm đánh giá Tỷ lệ bổ sung nấm men Độ màu sắc Mùi Vị CT8 7,7ab 7,4b 7,9ab CT9 8,1a 8,3a 8,3a CT10 7,3b 7,5b 7,6b − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) 10 Kết xác định hàm lượng đường tổng, acid tổng, acid amin tỷ lệ bổ sung 02 chủng nấm men NML02 02g NML04 Tỷ lệ bổ sung chủng (g) Hàm lượng đường tổng (%) Hàm lượng acid tổng (%) Hàm lượng acid amin (%) CT11 1,66a 0,41b 0,202a CT12 1,54b 0,43b 0,171b CT13 1,43c 0,54a 0,148c − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) 174 11 Kết xác định nồng độ rượu tỷ lệ bổ sung 02 chủng nấm men NML02 02g NML04 Tỷ lệ bổ sung chủng (g) Độ rượu (v/v) CT11 45,3C CT12 46.4B CT13 45.5A − Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) 12.Kết phân tích cảm quan mẫu bổ sung 02 chủng nấm men NML02 02g NML04 Mẫu CT11 CT12 CT13 STT 10 10 10 Độ màu sắc 8 8 8 7 8 8 9 8 8 8 8 7 Mùi 7 7 8 8 9 8 8 7 7 8 Vị 8 7 7 7 8 8 9 8 9 7 8 7 175 Điểm đánh giá Tỷ lệ bổ sung nấm men Mùi Vị CT11 7,7ab 8,4b 8,3b CT12 8,2a 9,0a 9,0a CT13 7,6b 8,3b 8,5b Số liệu thu giá trị trung bình n =3 − − Độ màu sắc Các số liệu cột có số mũ khác thể khác có ý nghĩa ( 0,05) 13.Kết đánh giá cảm quan mẫu rượu lên men nhiệt độ 25oC, thời gian ngày với mẫu rượu người dân mẫu Đối chứng Độ màu sắc 8 8 8 7 6 9 8 8 9 7 10 11 9 12 13 14 8 15 16 17 18 19 20 21 8 22 23 8 Số thứ tự mùi vị 176 mẫu Thí nghiệm 24 Độ màu sắc 7 25 26 8 27 28 29 30 6 31 7 32 8 7 9 8 9 8 9 10 11 12 7 13 9 14 7 15 16 17 6 18 9 19 8 20 7 21 22 23 24 25 26 6 27 28 7 29 30 31 6 Số thứ tự mùi vị 177 mẫu Độ màu sắc Số thứ tự 32 mùi vị Mẫu Màu sắc độ Mùi Vị Đối chứng 8,13a 7,13a 6,34a Thí nghiệm 7,66a 7,75b 5,81a 14.Kết phân tích hàm lượng tạp chất (aldehyde, methanol, furfurol) có rượu khoảng thời gian chưng khác Methanol Aldehyde Furfurol (%V/V Eatnol 100o) (mg/L Ethanol 100o) (mg/L Etanol 100o) Đối chứng Không phát 141,57C 1,77a Mẫu Không phát 100,00D 2,54b Mẫu Không phát 240,47A 4,39c Mẫu Không phát 201,30B − Số liệu thu giá trị trung bình n = 8,94d Tên mẫu Các kí tự a,b,c, d thể khác có ý nghĩa thống kê mẫu cột, với mức ý nghĩa 5% 15.Kết mẫu rượu thử nghiệm quy mô lớn (8 kg gạo) − Cỡ mẫu Đơn vị Các tiêu 6400 (A) 200 (B) ml Độ rượu 42 42,5 %v/v Hàm lượng methanol không phát không phát %v/v Eatnol 100o Hàm lượng aldehyde 232,05 100 mg/L Etanol 100o Hàm lượng furfurol 160,17 2,54 mg/L Etanol 100o 178 PHỤ LỤC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 7.1 Nguyên liệu số cơng đoạn làm rượu Hình 7.1 Ngun liệu gạo bánh men Hình 7.2 Đỗ đĩa 179 Hình 7.3 Làm nguội tơi cơm Hình 7.4 Rải bánh men Hình 7.5 Cơm sau ngày ủ Hình 7.6 Cơm sau ủ Hình 7.7 Lên men ngày 180 ĐC 25oC 30 oC 35 oC Hình 7.8 Lên men rượu 15 ngày nhiệt độ khác Hình 7.9 Dịch lên men Hình 7.10 Lọc dịch lên men 181 7.2 Một số hình ảnh trình nghiên cứu Hình 7.11 Máy nước cất Hình 7.12 Xác định pH Hình 7.13 Bể ổn nhiệt để lên men rượu Hình 7.14 Xác định acid amin Hình 7.15 Xác định acid tổng số 182 Hình 7.16 Xác định hàm lượng đường tinh bột Hình 7.17 Hệ thống chưng cất rượu Hình 7.18 Xác định độ rượu 183 Hình 7.19 Rượu thành phẩm Hình 7.20 Đánh giá cảm quan sản phẩm rượu 184 Mau P3s3,39,40,42-49,51,54,70-73,76,77,79,80,82-84,86,87,89,90,95,96,178-183 Den P3s2-p2s3,p4s3-p38s3,41,50,52,53,55-69,74,75,78,81,85,88,91-94,97-177 ... LÂM TRẦN THỊ PHƯƠNG NGA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TRONG BÁNH MEN LÁ VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN RƯỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành:... Khảo sát khả lên men chủng nấm men tuyển chọn  Bổ sung nấm men tuyển chọn vào chế biến rượu men  Đánh giá chất lượng rượu thành phẩm sau bổ sung nấm men chọn vào trình lên men rượu truyền thống... tiêu đề tài  Phân lập chủng nấm men từ bánh men Đá Bàn thuộc tỉnh Quảng Trị  Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao sản xuất rượu đặc sản từ chủng phân lập  Định danh chủng nấm men có hoạt