Khảo sát động thái lên men của chủng streptomyces sp t1 và streptomyces sp t4 làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong xử lý chất thải chăn nuôi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  TRẦN TRUNG KIÊN Tên đề tài: "KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI LÊN MEN CỦA CHỦNG Streptomyces sp T1 VÀ Streptomyces sp T4 LÀM CƠ SỞ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NI" KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  TRẦN TRUNG KIÊN Tên đề tài: "KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI LÊN MEN CỦA CHỦNG Streptomyces sp T1 VÀ Streptomyces sp T4 LÀM CƠ SỞ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NI" KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên TS Dương Văn Cường Khoa CNSH & CNTP – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp: Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Quang Tuyên – Viện khoa học sống – ĐH Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn, bảo suốt q trình thực hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn TS Dương Văn Cường cán Khoa CNSH & CNTP Đại học Nơng Lâm Thái Ngun nhiệt tình giúp đỡ bảo tơi Xin chân thành cảm ơn ThS Đỗ Bích Duệ tất cán Bộ môn Vi sinh – Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trinh hồn thành khóa luận Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình người thân yêu Thái Nguyên, tháng năm 2014 Sinh viên Trần Trung Kiên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt VSV XK CFU CTR Chú thích Vi sinh vật Xạ khuẩn Colony Forming Unit (Đơn vị đo khuẩn lạc) Chất thải rắn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh muc chế phẩm sinh học lưu hành xử lý chất thải Việt Nam 16 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.3 Môi trường Gause I lỏng 21 Bảng 3.4 Môi trường Gause I 22 Bảng 4.1 Kết lượng sinh khối khô thu 28 Bảng 4.2 Kết xác định ảnh hưởng mơi trường lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn 29 Bảng 4.3 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng chủng XK 31 Bảng 4.4 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn 32 Bảng 4.5 Kết xác định ảnh hưởng pH lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn nghiên cứu 34 Bảng 4.6 Kết xác định ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 35 Bảng 4.7 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng xạ khuẩn 37 Bảng 4.8 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ muối lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 38 Bảng 4.9 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ oxy lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 40 Bảng 4.10 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ oxy lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 41 Bảng 4.11 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 43 Bảng 4.12 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn 44 Bảng 4.13 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 46 Bảng 4.14 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 47 Bảng 4.15 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T1 49 Bảng 4.16 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T4 51 Bảng 4.17 Kết số khuẩn lạc trung bình (pha lỗng 10-6) chủng xạ khuẩn T1 53 Bảng 4.18 Kết số khuẩn lạc trung bình (pha lỗng 10-6) chủng xạ khuẩn T4 53 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 4.1 Kết lượng sinh khối khô thu 28 Hình 4.2 Kết xác định ảnh hưởng mơi trường lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 30 Hình 4.3 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng 32 Hình 4.4 Kết xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chủng XK 33 Hình 4.5 Kết xác định ảnh hưởng pH lên sinh trưởng chủng XK 35 Hình 4.6 Kết xác định ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 36 Hình 4.7 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng chủng XK 37 Hình 4.8 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ muối lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 39 Hình 4.9 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ oxy lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 40 Hình 4.10 Kết xác định ảnh hưởng nồng độ oxy lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 42 Hình 4.11 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 43 Hình 4.12 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn 45 Hình 4.13 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn 47 Hình 4.14 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 48 Hình 4.15 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T1 50 Hình 4.16 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T4 51 Hình 4.17 Tính đối kháng chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52 MỤC LỤC PHÂN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan xạ khuẩn 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên 2.1.3 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 2.1.4 Hình thái, kích thước cấu tạo tế bào 2.1.5 Bào tử hình thành bào tử xạ khuẩn 2.1.6 Đặc điểm trình trao đổi cacbon, nitơ số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sinh enzyem xạ khuẩn 2.1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sinh enzyem xạ khuẩn 2.2 Đại cương công nghệ lên men 2.2.1 Giai đọan nhân giống 2.2.2 Lên men điều khiển trình lên men 2.2.3 Khống chế bọt 10 2.2.4 Thu hồi sản phẩm lên men 11 2.3.Enzyme ngoại bào số ứng dụng 11 2.4 Tổng quan chất thải chăn nuôi 13 2.4.1 Đặc điểm chất thải chăn nuôi 13 2.4.2 Tình hình xử lý chất thải chăn ni 13 2.5 Chế phẩm xử lý chất thải 16 2.5.1 Khái niệm chế phẩm xử lý chất thải 16 2.5.2 Tính đối kháng chủng vi sinh vật chế phẩm 19 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu: Chủng Streptomyces sp T1 Streptomyces sp T4 Viện Khoa học sống cung cấp 20 3.2.2 Thiết bị hóa chất sử dụng 20 3.2.3 Môi trường nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp lựa chọn môi trường lên men thích hợp 22 3.3.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng yếu tố tới khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 23 3.3.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng yếu tố tới khả sinh enzyme hoạt tính enzyme 23 3.3.4 Phương pháp xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển xạ khuẩn 24 3.4 Lên men thiết bị Infors HT (Switzerland) tạo chế phẩm 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu tính đối kháng 27 3.6 Phương pháp lựa chọn chất mang phù hợp 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường lên men thích hợp 28 4.2 Kết xác định số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng sinh enzyme chủng xạ khuẩn 31 4.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ: 31 4.2.2 Ảnh hưởng giá trị pH 34 4.2.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon 43 4.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ 46 4.3 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase, amylase, protease chủng xạ khuẩn 49 4.4.Kết khả đối kháng chủng xạ khuẩn 52 4.5 Kết tỷ lệ phối trộn chất mang 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 Kết luận 54 Kiến nghị: 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHÂN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Công nghệ sinh học ngày phát triển nhanh chóng đặc biệt việc nghiên cứu khai thác ứng dụng vô to lớn vi sinh vật, mang lại nhiều lợi ích đáng kể kinh tế quốc dân Việt Nam nước nằm vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển vi sinh vật cách phong phú đa dạng nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn Trong đó, xạ khuẩn với số lượng lớn phân bố nhiều vùng sinh thái khác nhau, chúng có vai trị quan trọng vịng tuần hoàn vật chất lượng hệ sinh thái Đặc biệt khả tạo sản phẩm thứ cấp có giá trị sử dụng cao enzyme thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh nhiều hợp chất y dược khác Việt Nam nước nơng nghiệp, ngành chăn ni giữ vai trị quan trọng Tuy nhiên, hoạt động chăn nuôi gia súc, gia cầm tiềm ẩn nguy gây ô nhiễm môi trường cao đặc thù nguồn chất thải chăn nuôi chưa qua xử lý hay xử lý không cách Hầu hết trang trại chăn nuôi nằm gần khu dân cư gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới đời sống, sức khỏe người dân.Việc xử lý chất thải đặt thực từ lâu với nhiều biện pháp khác như: chôn lấp; đốt; đổ sông, hồ, biển Tất biện pháp xử lý bất tiện, gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sinh thái [14] Trong năm gần phát triển khoa học kỹ thuật nơng nghiệp Việt nam có bước tiến lớn việc bảo vệ môi trường áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản suất Một số phương pháp khoa học công nghệ xử lý chất thải vật nuôi hầm Bioga hay việc đời loại chế phẩm sinh học mang lại hiệu khả quan chế phẩm vi sinh AT-YTB,WEVIRO, ứng dụng rộng rãi Đóng góp to lớn vào thành cơng chế phẩm tác dụng ưu việt xạ khuẩn có thành phần gói chế phẩm sinh học có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải xelluloza, proteaza, amylaza Viện Khoa học sống- Đại học Thái Nguyên phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại đăng ký thành công Genbank chủng 44 Kết bảng 4.11 hình 4.11 cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả nãng sinh trưởng nguồn cacbon nghiên cứu Chúng sinh trưởng tốt môi trường có nguồn cacbon glucose Trong mơi trường có nguồn cacbon lactose chúng phát triển yếu Xạ khuẩn vi sinh vật có cấu tạo tế bào giống vi khuẩn Gram dương, song chúng sinh trưởng phân nhánh mạnh, tạo thành hệ khuẩn ty Chúng có khả sinh trýởng phát triển tốt điều kiện mơi trường khắc nghiệt, nhờ có hệ enzyme cần thiết để phân hủy hợp chất hữu có phân tử lớn thành phần nhỏ để hấp thu Kết hoạt tính sinh enzyme cellulase, amylase protease chủng xạ khuẩn mơi trường có nguồn cacbon khác trình bày bảng 4.12 hình 4.12 Bảng 4.12 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn Xạ khuẩn T1 T4 Xạ khuẩn T1 T4 Xạ khuẩn T1 T4 Hoạt tính celluase(đường kính vịng phân giải D-d, mm) CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột 23 15 17 11 20 25 20 18 12 23 Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột 28 15 19 15 24 26 20 18 14 23 Hoạt tính protease (đường kính vịng phân giải D-d, mm) CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột 25 17 20 15 23 24 19 17 14 20 45 30 25 23 25 20 D-d (mm) 23 20 15 20 17 18 T1 11 12 15 T4 10 CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột Nguồn cacbon Hoạt tính cellulase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) 30 28 26 24 23 D-d (mm) 25 20 20 19 18 15 15 14 15 T1 T4 10 CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột Nguồn cacbon Hoạt tính amylase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) 30 D-d (mm) 25 25 24 20 23 17 19 20 20 17 15 15 14 T1 T4 10 CMC Sacarose Glucose Lactose Tinh bột Nguồn cacbon Hoạt tính protease (đường kính vịng phân giải D-d, mm) Hình 4.12 Kết xác định ảnh hưởng nguồn cacbon lên hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn 46 Kết thu bảng 4.12 hình 4.12 cho thấy, chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase, amylase protease mơi trường có nguồn cacbon nghiên cứu Chúng sinh tổng hợp enzyme tốt môi trường có nguồn cacbon CMC Glucose khơng ức chế sinh tổng hợp cellulase chủng tuyển chọn Ta thấy chủng xạ khuẩn cho kết vòng phân giải khác môi trường chứa nguồn cacbon khác Kết phù hợp với nghiên cứu Spirodonov Wilson [16], nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon lên sinh tổng hợp xenlulase chủng xạ khuẩn Thertmomonospora fusca.Lactose nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng hoạt tính cellulase, amylase protease hầu hết chủng xạ khuẩn 4.2.4 Ảnh hưởng nguồn Nitơ Nitơ nguồn dinh dưỡng khơng thể thiếu vi sinh vật nói chung xạ khuẩn nói riêng Nitơ có mơi trường ni cấy xạ khuẩn dạng vơ hữu Tìm hiểu ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng tổng hợp cellulase, amylase protease yếu tố quan trọng giúp tối ưu hóa điều kiện trình lên men Để lựa chọn nguồn nitơ thích hợp, chúng tơi sử dụng nguồn nitơ phổ biến: Cao nấm men, bột đậu tương, pepton, nitrat kali (KNO3), sunfat amon (NH4)SO4 Bảng 4.13 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn Sinh khối khô (mg/ml) Xạ khuẩn Pepton Cao nấm Bột đậu men tương KNO (NH ) SO T1 25,84 23,02 18,23 14,01 13,05 T4 22,46 24,19 20,11 12,24 11,17 47 30 25.84 24.19 Sinh khối khô (mg/ml) 25 20 15 10 T1 T4 Pepton Cao nấm men Bột đậu tương KNO-3 Nguồn Nitơ (NH4)-2SO4 Hình 4.13 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng chủng xạ khuẩn Từ kết có bảng 4.13 hình 4.13 cho thấy chủng xạ khuẩn T1 có khả sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn nitơ pepton 25,84(mg/ml), chủng xạ khuẩn T4 có khả sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn nitơ cao nấm men 24,19(mg/ml), mơi trường có nguồn nitơ bột đậu tương cho sinh khối khô cao Trong mơi trường có nguồn nitơ KNO3, (NH4)2SO4 chúng phát triển yếu Bảng 4.14 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn Hoạt tính cellulase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) Chủng Cao Bột đậu (NH ) S0 KNO Pepton nấm men tương T1 14 18 24 23 17 T4 15 19 23 24 15 Hoạt tính amylase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) Chủng Cao Bột đậu (NH ) S0 KNO Pepton nấm men tương T1 13 20 25 24 16 T4 12 18 21 23 12 Hoạt tính protease (đường kính vịng phân giải D-d, mm) Chủng Cao Bột đậu (NH ) S0 KNO Pepton nấm men tương T1 17 19 22 25 19 T4 13 23 18 25 15 48 30 24 D-d (mm) 25 24 20 15 10 T1 T4 (NH4)2S04 KNO3 Pepton Cao nấm men Bột đậu tương Nguồn Nitơ Hoạt tính cellulase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) 30 25 D-d (mm) 25 23 20 15 10 T1 T4 (NH4)2S04 KNO3 Pepton Cao nấm men Bột đậu tương Nguồn Nitơ Hoạt tính amylase (đường kính vịng phân giải D-d, mm) 30 25 25 D-d (mm) 25 20 15 T1 10 T4 (NH4)2S04 KNO3 Pepton Cao nấm men Bột đậu tương Nguồn nitơ Hoạt tính protease (đường kính vịng phân giải D-d, mm) Hình 4.14 Kết xác định ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn 49 Từ kết bảng 4.14 hình 4.14 đưa nhận xét hầu hết nguồn nitơ tốt cho sinh trưởng chủng xạ khuẩn khả sinh enzyme chủng xạ khuẩn nguồn nitơ khác khác Hoạt lực cellulase, amylase protease chủng xạ khuẩn không giống nguồn nitơ khác Cao nấm men pepton có tác dụng tốt đến hoạt lực tất chủng Đặc biệt nguồn bột đậu tương cho kết cao đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp tiềm lại lựa chọn tốt có số lượng lớn thị trường, giá thành rẻ nhiều so với cao nấm men pepton mà đảm bảo số lượng hoạt tính enzyme Trong mơi trường bổ sung KNO3 (NH4)2S04 chủng xạ khuẩn sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme yếu Như lựa chọn pepton cao nấm men bột đậu tương tốt tùy vào đối tượng mục đích quy mơ nghiên cứu hay sản xuất 4.3 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase, amylase, protease chủng xạ khuẩn Từ kết nghiên cứu cho phép lựa chọn môi trường điều kiện lên men thích hợp cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu Nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T1 môi trường Gause I dịch thể, nguồn cacbon Glucose nguồn nitơ pepton muối khống khác thành phần mơi trường Gauze I, nguồn cacbon tinh bột , pH=7, 30°C, nhu cầu oxy cao(95%), nồng độ muối 1% Bảng 4.15.Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T1 Giờ chạy lên men 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Sinh khối khô (mg/ml) 0,55 0,63 0,76 1,17 1,35 1,44 3,96 7,43 12,65 15,78 18,80 20,14 22,24 22,32 22,65 22,7 22,78 Tốc độ khuấy (vòng) 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 pH 7,00 7,03 7,03 6,89 6,9 6,95 7,02 7,1 7,23 7,2 7,13 7,04 6,98 6,93 7,0 7,01 7,09 Nồng độ oxy(%) 95 92,6 90,3 89,6 83,7 80,3 75,2 62,3 49,5 43,6 38,3 31,9 26,8 24,7 21,5 19,4 17,3 Nhiệt độ 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 50 Sinh khối khô (mg/ml) Sinh khối khô (mg/ml) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 20 15 10 Nồng độ oxy (%) Nồng độ oxy Nồng độ oxy (%) 25 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Thời gian lên men Hình 4.15 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T1 Từ bảng 4.15 hình 4.15 cho thấy (từ 0- 15h lên men) chủng T1 chưa phân chia mạnh (sinh khối 0,55- 1,44) lượng oxy sử dụng thấp (lượng oxy bão hịa mơi trường ≥80%) Trong pha tế bào chưa phân cắt thể tích khối lượng tăng lên có tăng thành phần tế bào Do điều kiện môi trường nên cần thời gian định tổng hợp enzyme dể sử dụng chất cần thiết Từ thứ 15 đến thứ 36 chủng T1 sinh trưởng mạnh sinh khối từ 1,44 lên tới hẳn 22,24(mg/ml), lượng oxy sử dụng tăng nhanh, 36h 68,2% Đến pha ổn định từ 36 tới 48h lượng sinh khối giữ mức 22,2422,78(mg/ml) dao động không đáng kể Ở pha ổn định tế bào giữ ổn định kích thước số lượng, kết sinh khối giữ mức ổn định.Qua kết trên, thời gian thu sinh khối enzyme thực đầu pha ổn định 36h Nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T4, lựa chọn môi trường lên men Gause I dịch thể, nguồn cacbon glucose nguồn nitơ cao nấm men muối khoáng khác thành phần môi trường Gause I, nguồn cacbon tinh bột , pH=7, 30°C, nhu cầu oxy(95%), nồng độ muối 1% 51 Bảng 4.16: Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T4 Giờ chạy lên men 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Sinh khối khô (mg/ml) 0,45 0,56 0,76 1,10 5,32 7,44 10,90 12,33 14,65 17,68 21,70 22,68 24,90 25,20 25,56 25,62 25,70 Tốc độ khuấy (vòng) 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 Nồng độ oxy(%) 95,0 94,7 93,6 92,5 90,7 80,1 75,2 60,6 45,7 36,6 34,2 22,4 20 19,2 19,5 19,3 19,0 pH 7,02 7,02 6,9 6,03 6,85 6,95 7,02 6,84 6,8 6,85 7,05 7,12 6,95 6,9 7,10 7,10 Nhiệt độ 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC 30oC Sinh khốikhô khô(mg/ml) (mg) Sinh khối Sinh khối khô (mg) Sinh khối khô (mg/ml) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 25 20 15 10 Nồngđộ độoxy oxy(%) Nồng Nồng độ độ oxy Nồng oxy(%) 30 12 15 18 21 2427 30 33 36 3942 45 48 Thời gian lên men Hình 4.16 Kết nghiên cứu động học lên men chủng xạ khuẩn T4 Từ bảng 4.16 hình 4.16 cho thấy (từ 0- 9h lên men) chủng T4 chưa phân chia mạnh (sinh khối 0,45- 1,1) lượng oxy sử dụng 52 thấp (lượng oxy bão hịa mơi trường ≥92,5%) Trong pha tế bào chưa phân cắt thể tích khối lượng tăng lên có tăng thành phần tế bào.Do điều kiện môi trường nên cần thời gian định tổng hợp enzyme để sử dụng chất cần thiết Từ thứ 12 đến thứ 33 chủng T4 sinh trưởng mạnh sinh khối từ 5,32 lên tới 22,68(mg/ml), lượng oxy sử dụng tăng nhanh, 36h 75% Đến pha ổn định từ 36 tới 48h lượng sinh khối giữ mức 24,90- 25,7(mg/ml) dao động không đáng kể Ở pha ổn định tế bào giữ ổn định kích thước số lượng, kết sinh khối giữ mức ổn định Qua kết nghiên cứu trên, thời gian thu sinh khối enzyme thực đầu pha ổn định 36h 4.4.Kết khả đối kháng chủng xạ khuẩn Kết nghiên cứu tính đối kháng chủng Streptomyces sp T1 Streptomyces sp T4 có ý nghĩa quan trọng Hình 4.17 Tính đối kháng chủng xạ khuẩn nghiên cứu Qua hình 4.17 cho thấy tất điểm giao cắt, chủng xạ khuẩn phát triển bình thường, điều chứng tỏ chủng xạ khuẩn khơng có tính đối kháng lẫn nhau, chủng giống hồn tồn sinh trưởng 53 phát triển mơi trường Chúng ta hồn tồn sử dụng chủng xạ khuẩn để sản xuất chế phẩm vi sinh để xử lý chất thải rắn chăn nuôi 4.5 Kết tỷ lệ phối trộn chất mang Lựa chọn chất than bùn, cám ngô, bột đậu tương vừa chất mang vừa nguyên liệu cho xạ khuẩn sinh trưởng Tiến hành phối trộn chất mang theo tỷ lệ (60: 30: 10; 50:40:10; 70:20:10) để tìm tỷ lệ thích hợp Bảng 4.17 Kết số khuẩn lạc trung bình (pha lỗng 10-6) chủng xạ khuẩn T1 STT Chất mang Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Tỷ lệ 60: 30: 10 50: 40: 10 70: 20: 10 Số khuẩn lạc trung bình 22 11 Bảng 4.18 Kết số khuẩn lạc trung bình (pha loãng 10-6) chủng xạ khuẩn T4 STT Chất mang Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Than bùn + cám ngô + bột đậu tương Tỷ lệ 60: 30: 10 50: 40: 10 70: 20: 10 Số khuẩn lạc trung bình 32 15 Qua khảo sát thấy chất mang phối trộn tỷ lệ 60:30:10 cho số lượng khuẩn lạc trung bình chủng xạ khuẩn cao T1: 22 khuẩn lạc (pha loãng 10-6), T4: 32 khuẩn lạc( pha lỗng 10-6) Vậy tơi lựa chọn tỷ lệ để làm chất mang thích hợp để sản xuất chế phẩm Các chất mang cân tỷ lệ phối trộn trùng 105oC, để nguội Sau bổ sung giống cấp có 10% giống vào chất mang với độ ẩm 50%, ủ 30oC vòng 48 Sấy nhẹ sản phẩm 40oC để nhiệt độ phòng, kiểm tra lại mật độ tế bào sản phẩm phối trộn, kiểm tra độ ẩm < 10% 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Nghiên cứu lựa chọn môi trường Gause I làm môi trường lên men thích hợp - Các yếu tố pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nồng độ oxy, nguồn cacbon,nguồn nitơ ảnh hưởng đến khả sinh trưởng khả sinh enzyme chủng xạ khuẩn Điều kiện nuôi cấy tối ưu để cài đặt thông số nồi lên men nhiệt độ 30°C, pH:7, nồng độ muối 1%, nồng độ oxy 95% - Các chủng xạ khuẩn T1 T4 sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn cacbon Glucose nguồn nitơ cao nấm men, pepton, sinh enzyme hoạt tính enzyme tốt nguồn cacbon CMC, nguồn nitơ cao nấm men, pepton - Thời gian thu sinh khối thích hợp 36h - Chủng xạ khuẩn T4 T1 tính đối kháng lẫn nhau, chủng giống hồn tồn sinh trưởng phát triển mơi trường hồn tồn sử dụng chủng xạ khuẩn để sản xuất chế phẩm vi sinh để xử lý chất thải rắn chăn nuôi - Tỷ lệ phối trộn 60:30:10 (than bùn: cám ngơ: bột đậu tương) thích hợp để làm chất mang Kiến nghị: Do thời gian có hạn nên đề tài dừng lại nghiên cứu chủng xạ khuẩn đánh giá quy mơ phịng thí nghiệm với thí nghiệm đơn lẻ, số tiêu chưa thể đánh giá hết hiệu chế phẩm Vì tơi xin có số kiến nghị sau: - Tiến hành bố trí thí nghiệm cách đồng thời để đánh giá xác khả chủng xạ khuẩn - Cần nghiên cứu bổ sung thêm chủng vi sinh có lợi khác vào chế phẩm để tăng hiệu xử lý chế phẩm - Nghiên cứu thêm trình ủ xử lý lượng chất bổ sung, yếu tố vi lượng để chế phẩm đạt hiệu cao 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2010), "Khoa học công nghệ nông nghiệp 20 năm đổi mới”, NXB Chính trị Quốc gia, Hà Nội, tr.11- 13 Ngơ Đình Quang Bính (2005),Vi sinh vật học cơng nghiệp, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên công nghệ Quốc gia, Hà Nội, tr 53- 71 Nguyễn Văn Cách (2004), "Công nghệ lên men chất kháng sinh”, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tăng Thị Chính (2001), Nghiên cứu vi sinh vật phân giải xenluloza phân hủy rác thải hiếu khí ứng dụng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội Tăng Thị Chính (2007a), "Cơng nghệ xử lý chất hữu rác thải sinh hoạt vi sinh vật ưa nhiệt”, tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị Môi trường tồn quốc, tr 975-987 Tăng Thị Chính (2007b), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường, Viện Công Nghệ Môi Trường, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, (1972), Một số phương pháp vi sinh vật học, Tập I, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội, tr 328- 345 Nguyễn Thành Đạt, KA Vinogradva V.A Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn, Act.A.buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia ccccp Đặng Minh Hằng (2009),“ Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp xenluloza số chủng vi sinh vật để xử lý rác thải“, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 333-339 10 Bùi Huy Hiển (2010), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải chăn nuôi”, Báo cáo tổng kết đề tài, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, Hà Nội 56 11 Hồ Thị Kim Hoa, Lê Thanh Hiền, Trần Thị Dân (2007), Tình hình quản lý chất thải chăn ni số huyện TP.Hồ Chí Minh tỉnh lân cận, Tạp chí chăn ni, số1, tr 20 12 Phạm Bích Hiên (2012), “Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn”, Luận án tiến sỹ, Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội 13 Lê Gia Hy (1992), “Tính đối kháng xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam bệnh đạo ơn”, Tạp chí khoa học, tập 14, số 4, tr.11-12 14 Nguyễn Xuân Trạch (2009), “Chất thải chăn nuôi – trạng giải pháp”, Hội thảo Đại học Nơng nghiệp, Hà Nội 15 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hồng Thị Bích, Hoàng Thị Hà Giang (2008), “Nghiên cứu sử dụng cellulose tách từ Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp”, Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nơng, sinh, y học công nghệ thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 901- 903 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Spirodanov A.N and Wilson D.B (2008), Regulation of biosynthes of invidual cellulases in Thermomonospora fusca, Bacteriology, 180(14), pp 3529 17 Waksman S A (2001), The Actinomycetes, Classification, identification and descriptions of general and species, vol 2, the Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA III MỘT SỐ TRANG WEB 18 http://vea.gov.vn/vn/vanbanphapquy/hoidapcsvbpl/Pages/Danh-mục-chếphẩm-sinh-học-được-lưu-hành-trong-xử-lý-chất-thải-tại-Việt-Nam.aspx PHỤ LỤC Một số mơi trường sử dụng STT Hóa chất Khối lượng (g) Môi trường Gause I (Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn) Tinh bột 20 NaCl K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 KNO3 FeSO4 0.01 Agar 20 H2O 1000 ml Môi trường xác định hoạt tính sinh enzyme ngoại bào Mơi trường tinh bột Tinh bột 20 Pepton NaCl 0.5 Agar 20 H2O 1000ml Môi trường casein NaCl K2HPO4 1.5 KH2PO4 0.5 Casein Cao thịt Agar 20 H2O 1000ml Môi trường xenlulloza (NH4)2HPO4 15 KH2PO4 0.5 MgSO4 0.4 NaCl 0.1 FeSO4, MnSO4 Vết Bột giấy Agar 20 H2O 1000ml Môi trường sở để lựa chọn làm môi trường lên men Môi trường Guase II Nước chiết thịt 30ml Pepton 5g NaCl 5g Glucoza 10g H2O 1000ml Môi trường ISP4 Tinh bột tan 10g K2HPO4 1g (NH4)2SO4.7H2O 2g MgSO4.7H2O 1g CaCO3 2g pH 7,0 – 7,2 ... dẫn sở thực tập nên tiến hành nghiên cứu đề tài với nội dung: ? ?Khảo sát động thái lên men chủng Streptomyces sp T1 Streptomyces sp T4 làm sở sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng xử lý chất thải chăn. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  TRẦN TRUNG KIÊN Tên đề tài: "KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI LÊN MEN CỦA CHỦNG Streptomyces sp T1 VÀ Streptomyces sp T4 LÀM CƠ SỞ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH. .. tiếp tục nghiên cứu để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng xử lý chất thải chăn nuôi Trong tối ưu hóa động thái lên men giai đoạn nghiên cứu quan trọng sản xuất chế phẩm Mục đích giai đoạn lựa