Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự gen cry1ab, cry1ac mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ========== TRƯƠNG PHÚC HƯNG NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN cry1Ab, cry1Ac MÃ HĨA PROTEIN DIỆT CƠN TRÙNG BỌ CÁNH VẢY TỪ CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thái Nguyên tỉnh miền núi trung du, nằm vùng trung du miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên 3.562,82 km Với địa hình thấp dần từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng theo hướng Bắc – Nam làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt mùa đông: vùng lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm hai mùa rõ rệt mùa mưa mùa khô Do ảnh hưởng địa hình, đất đai Thái Nguyên chia thành ba loại chính, đó, đất núi chiếm diện tích lớn (48,4%) hình thành phong hố đá Macma, đá biến chất trầm tích, độ cao 200m, tạo điều kiện cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, đặc sản….đất đồi chiềm 31,4% chủ yếu hình thành cát kết, bột kết phiến sét phần phù sa cổ kiến tạo, độ cao từ 150 – 200m, phù hợp với ăn lâu năm, công nghiệp đất ruộng chiếm 14,4% Thái Ngun cịn có diện tích lớn đất chưa sử dụng Kết cấu đất, điều kiện khí hậu đặc điểm địa hình tạo cho Thái Nguyên đa dạng thực vật, động vật, lồi vi sinh vậtt rong có vi khuẩn Bacillus thuringiensis[23] B thuringiensis vi khuẩn gram dương, mang gen cry sinh tổng hợp bào tử protein tinh thể độc tố có hiệu diệt nhiều lồi trùng thuộc cánh vảy, cánh cứng hai cánh Trong năm gần chủng Bt nhà khoa học phân lập với số lượng phong phú [3] Tuy nhiên, chủng chứa số nhóm gen cry gây độc với số lồi trùng định Vì việc sàng lọc chủng B thuringiensis có chứa gen cry mong muốn, tạo dịng xác định trình tự gen độc tố vấn đề cần thiết, làm sở cho nghiên cứu sâu gen cry như: nhằm tạo chủng B thuringiensis tái tổ hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao nhiều lồi trùng quan trọng; việc biến nạp gen độc tố cry thích hợp vào loại trồng để bảo vệ chúng trước công côn trùng Protein tinh thể độc cry1Ab, cry1Ac nhiều protein có hoạt tính cao chống lại trùng cánh vảy Xuất phát từ mục đích này, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu Tách dịng đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt trùng cánh vảy phân lập từ số mẫu đất thuộc tỉnh Thái Nguyên” Mục tiêu đề tài - Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt trùng cánh vẩy - Tách dịng đọc trình tự chủng Bt nghiên cứu mang gen cry1Ab gen cry1Ac Nhiệm vụ đề tài - Thu thập chủng Bt phân lập chưa qua tuyển chọn từ đất Thái Nguyên; - Phân loại chủng Bt var kurstaki phương pháp huyết thanh; - Phát gen cry1Ab gen cry1Ac phương pháp PCR; - Sàng lọc chủng Bt var kurstaki có hoạt tính diệt sâu tơ; - Tách dịng gen cry1Ab gen cry1Ac; - Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab đoạn gen cry1Ac tách dòng từ chủng Bt nghiên cứu so sánh với trình tự gen Ngân hàng Gen quốc tế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lƣợc sử nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) giới Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát loại vi khuẩn gây bệnh sotto tằm ông đặt tên Bacillus sotto Năm 1911, nhà khoa học Đức E Berline phân lập loại vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải, Anagasta kaenniella Mãi đến năm 1915, vi khuẩn thức mang tên Bacillus thuringiensis vi khuẩn phân lập từ vùng Thuringen Đức Đến năm 1930, Bt thử nghiệm chống sâu đục thân Châu Âu Năm 1938, chế phẩm Bt sản xuất lần để diệt sâu hại lúa mỳ Pháp Năm 1953, Hannay Fitzjame phát thể vùi cơng bố tinh thể có chất protein Năm 1956, Angus chứng minh hoạt tính diệt sâu tinh thể tách từ tế bào bào tử Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) sản xuất số lượng lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng Bt var kurstaki Đến năm 1962, de Barjac Bonnfoi đưa phương pháp phân loại cho chủng Bt Bacillus sphaericus (Bs) phương pháp huyết Vào năm 1960 – 1976, nhiều chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao phân lập ứng dụng Năm 1977, Goldberg Margarit phát Bt var isralensis diệt ấu trùng muỗi ruồi thuộc hai cánh Năm 1981, Schnepf Whiteley lần phân lập tách dịng gen độc tố mã hố protein tinh thể diệt sâu chủng Bt var kurstaki HD-1 gọi gen cry1 biểu E coli Từ đó, số lượng lớn gen tách dòng đọc trình tự Năm 1983, Krieg cộng phân lập loài phụ Bt var tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu tenebrio molitar Sau đó, cơng ty Mycogen phát Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chủng tương tự Bt var tenebrionit tên Bt var sandiego tổng hợp chuỗi gen độc tố chúng Năm 1985, gen cry Bt chuyển vào trồng để diệt sâu Năm 1987, phát Bt diệt giun tròn thực vật Năm 1991, phát Bt diệt ve bét, mạt thuộc Trematoda Năm 1995, chuyển gen thương phẩm đưa sản xuất Năm 2003, saikai cộng công bố protein tinh thể Bt diệt tế bào ung thư Năm 2005, Ohba phát protein loài Bt phân lập Việt Nam có khả chống tế bào ung thư cổ tử cung người [3] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Việt Nam Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt ứng dụng Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971 Nguyễn Văn Cảm cs, khảo nghiệm loại thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô, Trung Quốc cho kết khả quan Tuy nhiên, nghiên cứu, sản xuất ứng dụng Bt Nguyễn Cơng Bình cs thực lần vào năm 1973 Viện Sinh vật, Viện Khoa học (nay Viện Khoa học Công nghệ) Có thể chia lịch sử 30 năm phát triển Bt thành thời kỳ sau: 1.1.2.1 Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Nguyễn Cơng Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngơ Đình Bính người mở đường nghiên cứu Bt Việt Nam Năm 1973, Viện Sinh vật tiến hành sản xuất Bt phương pháp thủ cơng bán cơng nghiệp phịng thí nghiệm Năm 1973-1976, Bt sản xuất chủ yếu môi trường đặc với giá thể agar tự chế tạo từ rong câu nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá, chủng Bt sử dụng để sản xuất thời kỳ Nguyễn Cơng Bình mang từ Trung Quốc có lồi phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội thu kết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tốt đẹp Năm 1975, chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp lên men chìm nồi lên men tự tạo Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học đóng thành phố Hồ Chí Minh Năm 1982, Viện Công nghệ thực phẩm sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men 5m3 Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt bị giảm sút chế phẩm Bt sản xuất có chất lượng khơng cao nên tốc độ tiêu thụ giảm Nhìn chung, thời kỳ bắt đầu sản xuất áp dụng thành công chế phẩm Bt khiến cho nghiên cứu Bt mở đầu thuận lợi tốt đẹp 1.1.2.2 Thời kỳ sản xuất ứng dụng (1984-1994) Các chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp dịch thể áp dụng rộng rãi, có hiệu phòng trừ rõ rệt, giá bán khơng cao (khoảng 6000 đồng/lít) nên phù hợp với thu nhập nông dân Việc sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng số đơn vị thuộc trường đại học đề xuất không thu đươc kết tốt 1.1.2.3 Thời kỳ nghiên cứu bản, ứng dụng phát triển (1994-nay) Cuối thời kỳ sản xuất ứng dụng 1984-1993, chế phẩm Bt chất lượng không tiêu thụ Sản xuất ứng dụng Bt bước vào thời kỳ thoái trào, nhà nghiên cứu lại phải quay lại nghiên cứu để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất sở ứng dụng Do vậy, khoảng 10 năm trở lại đây, nhà khoa học chuyển việc nghiêm cứu Bt sang hướng tìm chủng Bt có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu Bt ứng dụng công nghệ chuyển gen Bt phục vụ sản xuất Các chủng Bt phân lâp Việt Nam đa dạng thành phần loài đa dạng gen Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H chế tạo 34 sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại Bt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn phương pháp huyết Bằng phương pháp PCR với hỗn hợp cặp mồi đặc hiệu cho gen thuộc nhóm gen cry typ cho thấy có 102 chủng Bt tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88.7%), đáng ý chủng chứa gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C cry1D - chiếm 6,8% [1] Trên sở phát hiện, tách dịng đọc trình tự gen có chủng Bt phân lập Việt Nam, Ngô Đình Bính cs tách dịng biểu gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C Cry1D diệt sâu khoang E coli từ chủng Bt aizaiwai phân lập từ mẫu đất Hà Nội Hà Tĩnh, protein tái tổ hợp thu cho hiệu diệt sâu cao so với đôi chứng Năm 2000, Võ Thị Thứ cs tách dịng biểu gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào [1] Ở Việt Nam, nghiên cứu lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào trồng để tạo có khả kháng sâu bệnh cuối kỷ 20 Trong đó, có nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium fumefaciens để tạo giống trồng có khả kháng sâu như: đậu xanh, cải bơng [4.5,6,9,10] Năm 2003, Phan Đình Pháp cs chuyển gen cry1B vào lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu chuyển vào cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11] 1.2 Đại cƣơng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm hình thái Theo tài liệu phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng Sneath (1986) Wistreich Lechtman (1988), Syahly (1991) vi khuẩn Bt xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, nghành Firmicutes [3] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bt thuộc chi Bacillus vi khuẩn đất, hình que, gram dương, hơ hấp hiếu khí kỵ khí khơng bắt buộc, kích thước tế bào từ – µl, có phủ tiêm mao khơng dày, chuyển động Các lồi thuộc chi Bacillus có khả hình thành bào tử gặp điều kiện bất lợi mơi trường, bào tử có dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - µl nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng gặp điều kiện thuận lợi Bào tử dạng sống tiềm ẩn vi khuẩn có khả chịu nhiệt, xạ, hố chất, áp suất thẩm thấu cao Màng ngồi nằm ngồi phần sót lại tế bào mẹ, chiếm khoảng – 10% khối lượng khô bào tử Thành phần chủ yếu lipoprotein, có lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu Lớp áo bào tử có cấu tạo – 15 lớp, chủ yếu protein sừng Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu cation Dưới áo bào tử vỏ bào tử Vỏ bào tử chứa lượng lớn peptidoglucan đặc biệt, liên kết chéo, ngồi cịn có – 10% (tính theo khối lượng khơ bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không chứa axit teicoic Áp suất thẩm thấu lớp vỏ bào tử cao tới 20atm, lượng chứa nước 70% Dưới lớp vỏ bào tử lõi bào tử gọi thể chất nguyên sinh cấu tạo thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất vùng nhân Đặc biệt trình hình thành bào tử vi khuẩn Bt sinh tinh thể mang tính độc trùng Tinh thể loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 μm chiếm 25% trọng lượng khơ tế bào có hình dạng đa dạng: hình tháp, hình ovan, hình lập phương có hình dạng không xác định … Khi tế bào sinh dưỡng bào tử tinh thể thường nằm kề nhau, tế bào tan bào tử tinh thể ngồi [3,14] Khi nhuộm tế bào Bt thuốc nhuộm fushin quan sát kính hiển vi ta thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm cịn bào tử bắt màu hồng nhạt (hình 1.1) [3,6,7] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn A B Hình 1.1: Hình thái bào tử tinh thể số chủng Bacillus thuringiensis (A: Kính hiển Vi quang học; B: Kính hiển vi điện tử qt) Bt có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hố giống với nhóm trực khuẩn sinh bào tử B cereus, B mycoides B anthracis nhiên Bt có khả sinh tinh thể cịn lồi khác khơng [4] 1.2.2 Đặc điểm sinh hố Bt khơng lên men sinh axit với arabinoza, xiloza manitol tạo axít mơi trường có glucoza, có khả thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, có phản ứng với lịng đỏ trứng gà, phát triển mơi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozim Bt có khả sinh trưởng phát triển nhiệt độ 15 – 450C, nhiệt độ tối ưu 28 – 300C, pH = Bt khơng có khả khử amin phenilalanin, khơng sử dụng axít axetic, khơng khử muối sunfit 1.2.3 Tính chất ni cấy Tính chất ni cấy đặc tính vốn có vi sinh vật, tiêu chuẩn để định loại vi sinh vật Tính chất ni cấy lồi Bt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn khác khác nhau, đồng thời phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời gian nhiệt độ ni cấy Khuẩn lạc lồi Bt var kurstaki nuôi cấy môi trường MPA 300C 72 đa số có hình trịn, màu trắng sữa có mép nhăn đường kính đạt tới – 10mm Trong khuẩn lạc lồi phụ berlinner có dạng thảm, với sợi hình phóng xạ, đường kính khoảng 10mm; màu vàng nhạt trơn ướt, viền nhăn thành hình vải thơ mở rộng xung quanh nên gọi dạng phóng xạ nhăn Nếu ni cấy có bổ sung 2% gluco, ni 300C 24 thấy điểm khuẩn lạc nhỏ màu vàng bề mặt, sau 42 thành hình vành khăn trịn dày, đường kính 3mm, có vành tròn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, ánh quang, dạng hạt thô khô, sau 72 đường kính đạt 2cm Một số chủng Bt xuất khuẩn lạc trơn nhẵn [3,4] 1.2.4 Phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis Có nhiều phương pháp phân loại Bt khác Khóa phân loại thiết lập dựa đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hoá (Heimpel Angus, 1958) Tuy nhiên phân loại theo phương pháp không phân biệt chủng Bt cách rõ ràng Bt có đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố rât giống đại diện nhóm trực khuẩn sinh bào tử Bacillus cereus, B thuringiensis, B mycoides, B anthacis Mới phát thêm loài B weihenstephanensis B pseudomycoides [3,4,14] Ngoài ra, người ta phân loại vi khuẩn Bt theo typ huyết kháng protein tinh thể, typ huyết kháng nguyên – O, theo loại hình enzym lipaza, dựa plasmit phân loại theo nguồn bệnh Nhưng chủng có tồn typ gen ngoại độc tố khác (Sanchis cộng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 phẩm Bacillus thuringiensis subsp Israllensis Việt Nam” Báo cáo khoa học Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban 2006 Công nghệ gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật 153 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịchcho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu 2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302 Ngơ Đình Bính 2005 Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính 2004 Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004 NXB KHKT 59 – 62 Nguyễn Lân Dũng 1981 Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng NXB KHKT Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2003 Vi sinh vật học NXB giáo dục Hoàng Thị Lợi 2003 Giáo trình trùng học nơng nghiệp tập NXB Nông nghiệp Hà Nội Trang 122 – 167 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh Di truyền học, tập NXB Đại học Sư Phạm Trang 49 – 53 Khuất Hữu 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXBKHKT Trang137 – 140, 206 – 210 10 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý 1999 Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào hai mầm Báo cáo Hội nghị sinh học tồn quốc 1371-1376 Tài liệu Tiếng Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 11 Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) Genes encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans 12 Attathom T, Chanpaisang J, and Hongrattanameteekul W Bacillus thuringiensis Isolation, Indentification, and Bioasay 1994 In Bacillus thuringiensis Biotechology and Environmental Benefits 70 – 86 13 Barjac D H and Bonnefoi A, 1962 Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis Entomophaga, 7, – 31 14 Barjac D H 1981 Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36 – 42 Burges H.D (edited) In microbial control of pests and plant Diseasis 1970 – 1980 15 Barjac D H & Frachon E 1990 Classification of Bacillus thuringiensis strains Entomophaga 35,233 – 240 16 Bernard R Glick, Jack J Pasternale Molecular Biotechnology principle ADN applications of recombinant DNA Department of Biology, University of Waterloo, Ontario, Canada 17 Cheng X Y, Sardana R, Kaplan H et al (1998) Agrobacteriumtransformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer 18 Dams A, L.F., T.E Visick, ADN H.R.Whiteley 1989 A20 – Kilodaltonprotein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis var israelensis 27 – Kilodalton crystal protein in E coli J Bacteriol 171: 521 – 530 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 19 Didier, L.D Ameller, ADN M.Marguerite 1993 Lecadet Diverst ty of Bacillus thuringiensis toxin ADN Genes 20 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, ADN AI Aronson 1991 Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis FEMS microbial Lett 81 – 31 21 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of Bacillus thuringiensis toxin and genes In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs 1993, 37 – 60 22 Frankenhuyzen V K The challenge of Bacillus thuringiensis In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide: Theory and Practice Edited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs 1993, – 23 23 http://www.thainguyen.gov.vn 24 http: //www.promege.com/vectors/ 25 http://www.en.wikipedia.org/wiki/Lepidoptera # cite_note-cgillott-5 26 http://www.promega.com Pgem-Teasy Vector Systems Technical Manual No 042 Instruction for use of products A1360, A1380, A3600 and A3610 27 Iizuka T, M Ishino and Nakajima K 1982 Comparative morphological of parasporal crystal and characterization of plasmid DNA from various subspecies of entomopathogenic bacteria, Bacillus thuringiensis J Facul Agric Hokkaido Univ 13: 423 – 431 28 J Li, D J Derbyshire, B Promdonkoyt and D J Ellart 2001 Structural implicatios for ransformation of Bacillus thuringiensis - endotoxin from Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 water –soluble to membrane –inserted forms Biochemical Society: 571577 29 Koo, B T., S H Park, S K Choi, B S Shin, J I Kim, J H Yu (1995), “Cloning of a novel crystal protein gen Cry1 K from Bacillus thuringiensis subsp Morrisoni” FEMS Microbiology Letter 134, p.159-164 30 Kalman, S., K L Kiehne, K J Libs, and T Yamatomo (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp– galleriae” Applied and Environmental Microbiology, p.1131-1137 31 Lecadet, M M at al (1996), Collection of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus I.E.B.C, catalogue No.1 32 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen 2003 Vip3A a novel insecticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity 33 Lopez-Meza, J E And J E Ibarra (1996), “Characterization of a Novel Strain of Bacillus thuringiensis” Applied and Environmental Microbiology, p.1306-1310 34 Navon A Control of lepidopteran pests with Bacillus thuringiensis In Bacillus thuringiensis an Environmental pesticide Theory and Practice Dited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs 1993, 125 – 143 35 Ngo Dinh Binh, Nguyen Quynh Chau, Nguyen Van Thuong, Vi Thi Doan Chinh, Nguyen Hoai Tram, Nguyen Van Tuat, Yeon Ho Je, Jin Hee Chang and Seok KwonKang 1999 Isolation, screening and characterization of Bacillus thuringiensis from Viet Nam Biotechnology of Bacillus thuringiensis Eds YuZiniu, Sun Ming and Liu Ziduo, Science Press, Beijing, New York V.3,46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 36 Ngo Dinh Binh, Shinichiro Asano, Hisanori Bando and Toshihiko Iizuka 2002 Identification of cry1 genes of Bacillus thuringiensis isolated from Viet Nam Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its Environmental Impact, Proceeding of the 4th Pacijic Rim Conference.142 – 146 37 Powell K, Carol A Charlton and Takashi Yamamoto 1995 Recent advances in structure and Function research on Bacillus thuringiensis crystal protein 38 Sambrook J., Russell D.W (2001), “Molecullar cloning”, A laboratory manual, 3rd ed, Cold spring Harbor laboratory press, Cold spring harbor, NY 39 Schrepf H.E ADN White H.R 1981 Cloning ADN expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein in E.coliproc Nat Acad.Sci.USA, 78 : 2893 – 2897 40 Schrepf H.E ADN Whitel H.R 1981 Cloning ADN expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein in E.coliproc Nat Acad.Sci.USA, 78: 2893 – 2897 41 Shin – ichiro Asano, Chikage Yamashita, Toshihiko Inzuka, Katsuyoshi Takeuchi, Satoshi Yamanaka, David Cerf ADN Takashi Yamamoto; 2003 A strain of Bacillus thuringiensis subsp Galleriae containing a novel cry8 gene highly toxin to Anomala cuprea (Coleoptera : Scarabaeidae) Biological control 28.(2003) 42 Thiery ADN E Frachon 1997 Indentification Isolation culture ADN preservation entomopathogenic bacteria Biologycal techniques Manual of Technology in Ínsect Phathology, A academic press 55 – 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 43 Wei J Z, Hale K, Carta L et al (2003) Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes Proc Natl Acad Sci USA 100:2760 2765 44 Wu, G., Cui, HR, Shu, QY et al., Stability and inheritance of gene expression cry1Ab in progenies of transgenic “Kemingdao”, Journal of Agricultural Biotechnology (in Chinese), 2000 45 World Health Organization Geneva 1999 Environmental health criteria for Bacillus thuringiensis Microbial pest control agent Bcillus thuringiensis 1-125 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục ký hiệu, viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình (hình vẽ, ảnh chụp, đồ thị) vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) giới 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Việt Nam 1.1.2.1 Thời kỳ mở đầu nghiên cứu 1.1.2.2 Thời kỳ sản xuất ứng dụng (1984-1994) 1.2 Đại cương vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm sinh hoá 1.2.3 Tính chất ni cấy 1.2.4 Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis 1.2.5 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki 11 1.2.6 Hệ thống di truyền vi khuẩn 12 1.2.6.1 Hệ gen vi khuẩn Bt 12 1.2.6.2 Phân loại gen độc tố diệt trùng Bacillus thuringiensis 13 1.2.6.3 Vị trí gen mã hố protein tinh thể diệt trùng tế bào 13 1.2.6.4 Đặc điểm riêng số nhóm gen độc tố chúng 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 1.3 Các loại độc tố Bt 17 1.4 Đặc điểm protein tinh thể độc 18 1.4.1 Cấu trúc protein tinh thể Cry 18 1.4.2 Cơ chế tác động protein tinh thể diệt côn trùng 20 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình thành protein tinh thể độc 22 1.5 Đại cương côn trùng thử nghiệm 24 1.6 Tổng quan tạo dòng gen 26 1.6.1 Khái niệm tách dòng gen 26 1.6.2 Vectơ tách dòng 26 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 2.1 Vật liệu 30 2.2 Hóa chất thiết bị 30 2.2.1 Hóa chất: 30 2.2.2 Thiết bị 30 2.2.3 Môi trường 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ bào tử 33 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 33 2.3.3 Kỹ thuật định typ huyết 34 2.3.4 Phương pháp tách DNA plasmind 35 2.3.5 Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac 36 2.3.6 Phương pháp tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac 37 2.3.6.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy 37 2.3.6.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α 38 2.3.6.3 Phương pháp tách DNA plasmid vi khuẩn E.coli DH5α 38 2.3.7 Xác định trình tự nucleotid đoạn gen tách dòng 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry1Ab, cry1Ac có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy 40 3.1.1 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis 40 3.1.2 Hình dạng tinh thể chủng Bt 41 3.1.3 Phân loại Bt phương pháp huyết 42 3.1.5 Thử hoạt tính sinh học chủng Bt var kustaki phân lập 45 3.1.5.1 Xác định nồng độ bào tử 45 3.1.5.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng Bt var kustaki phân lập 46 3.2 Tách dòng đọc trình tự gen cry1Ab cry1Ac 47 3.2.1 Tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac 47 3.2.1.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T Easy 47 3.2.1.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α 48 3.2.1.3 Kiểm tra có mặt gen cry1Ab, cry1Ac dòng plasmid tái tổ hợp 50 3.2.2 Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab cry1Ac 52 3.2.2.1 Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab 52 3.2.2.2 Xác định trình tự đoạn gen cry1Ac 54 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 Trịnh Thu Hà, Nguyễn Đình Tuấn, Vũ Thị Nhung, Trương Phúc Hưng, Ngơ Đình Bính 2009 “Đánh giá hoạt tính diệt ấu trùng muỗi tồn lưu chế phẩm Bacillus thuringiensis subsp Israllensis Việt Nam” Báo cáo khoa học Hội Nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ Amp Ampicillin Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis CNSH Công nghệ sinh học DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid OD Optical density- mật độ quang học PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TE Tris EDTA 13 X- gal 5- Bromo- Cloro- indolyl ß- d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 Dh2O Deion water Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG - Bảng 1.1 Phân loại độc tố Cry1 Bacillus thuringiensis var kurstaki côn trùng đích - Bảng 1.2 Thành phần plasmid pGEM – T Easy - Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis - Bảng 3.2 Bảng kết chủng Baccillus thuringiensis var kustaki mang gen - Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ sau ngày thử nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ - Hình 1.1: Hình thái bào tử tinh thể số chủng Bacillus thuringiensis phân lập (A: Kính hiển Vi quang học; B: Kính hiển vi điện tử qt) - Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H - Hinh 1.3 Cấu trúc khơng gian độc tố cry1Ab, cry1Ac - Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc chung protein độc tố Cry - Hình 1.5 Cơ chế tác động protein tinh thể diệt trùng - Hình 1.6 A: Sâu tơ (Plutella xylostela) B: Rau cải bắp bị sâu hại - Hình 1.7 Các giai đoạn phát triển sâu tơ (Plutella xylostella - Hình 1.8 Trình tự cấu trúc vectơ pGEM-T Easy - Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bt môi trường MPA sau 72 ni cấy 280C - Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể chủng Bt 3.4TN phóng đại 100 lần kính hiển vi quang học - Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng Btk 3.4TN (1) chủng đối chứng 4D4(2) với typ huyết H3a,3b,3c kính hiển vi quang học - Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% - Hình 3.5 Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng Bt nghiên cứu - Hình 3.6 Hình ảnh biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α - Hình 3.7 Điện di DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc xanh , trắng - Hình 3.8 điện di sản phẩm cắt DNA plasmid - Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ dịng khuẩn lạc - Hình 3.10 So sánh trì nh tự gen cry1Ac chủng 3.4TN chủng 36.8TN với các trình tự ngân hàng gen quốc tế phần mềm BioEdit - Hình 3.11 So sánh trì nh tự gen cry1Ac chủng 3.4TN, 36.8TN chủng 6.8TN với các trì nh tự ngân hàng gen q́c tế bằng phần mềm BioEdit Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngơ Đình Bính - Trưởng phịng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi q trình thực khố luận Tơi xin chân thành cám ơn cán phòng Di truyền Vi sinh vật giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt khố luận Bên cạnh tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, người chia sẻ, động viên giúp tơi học tập hồn thành khố luận Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ nhiệt tình quý báu Thái Nguyên, tháng năm 2010 Học viên Trương Phúc Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Học viên Trương Phúc Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... đích này, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu Tách dịng đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt trùng cánh vảy phân lập từ số mẫu đất thuộc tỉnh Thái Nguyên? ?? Mục tiêu đề... loại tinh thể (21,4%) loại tinh thể (3,6%) Điều thể tính đa dạng hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập Thái Nguyên qua cho thấy Bt có phổ diệt trùng rộng từ côn trùng cánh vảy, cánh cứng, hai cánh. .. tách dịng đọc trình tự gen có chủng Bt phân lập Việt Nam, Ngơ Đình Bính cs tách dịng biểu gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C Cry1D diệt sâu khoang E coli từ chủng Bt aizaiwai phân lập từ mẫu đất