Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein của con ruốc khô

ĈҤI HӐC QUӔC GIA THÀNH PHӔ HӖ CHÍ MINH 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA oOo NGUYӈN TRӐNG NAM KHҦO SÁT HOҤT TÍNH KHÁNG OXY HĨA CӪ$&È&3+Ỉ1Ĉ2ҤN PEPTIDE THU NHҰN TӮ DӎCH THUӸ PHÂN PROTEIN CӪA CON RUӔC KHƠ Chun ngành: Cơng NghӋ Thӵc Phҭm Mã sӕ: 60 54 01 01 LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ TP HӖ CHÍ MINH, 01/201 &Ð1*75Ỵ1+ĈѬӦC HOÀN THÀNH TҤI 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA –Ĉ+4*–TP.HCM Cán bӝ Kng dn khoa hc: TS 9đẻ1+/ TM Cỏn b chm nhұn xét 1: PGS TS: Hoàng Thӏ Kim Anh Cán bӝ chҩm nhұn xét 2: TS: Lê Phi Nga LuұQYăQWKҥFVƭÿѭӧc bҧo vӋ tҥL7Uѭӡng Ĉҥi hӑF%iFK.KRDĈ+4*7S+&0 1Jj\WKiQJQăP Thành phҫn HӝLÿӗQJÿiQKJLiOXұQYăQWKҥFVƭJӗm: (Ghi rõ hӑ, tên, hӑc hàm, hӑc vӏ cӫa HӝLÿӗng chҩm bҧo vӋ luұQYăQWKҥFVƭ Chӫ Tӏch: GS 76/r9ăQ9LӋt Mүn Phҧn biӋn 1: PSG.TS Hoàng Thӏ Kim Anh Phҧn biӋn 2: TS Lê Thӏ Nga Ӫy viên: TS: Tôn Nӳ Minh NguyӋt Ӫy viên, TKѭNê: TS Trҫn Thӏ Ngӑc Yên Xác nhұn cӫa Chӫ tӏch HӝLÿӗQJÿiQKJLiOXұQYăQYj7Uѭӣng Khoa quҧn lý chuyên ngành sau luұQYăQÿmÿѭӧc sӱa chӳa (nӃu có) CHӪ TӎCH HӜ,ĈӖNG 75ѬӢNG KHOA ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP.HCM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA CӜNG HÒA XÃ HӜI CHӪ 1*+Ƭ$9,ӊT NAM Ĉӝc lұp - Tӵ - Hҥnh phúc NHIӊM VӨ LUҰ19Ă1THҤ&6Ƭ +ӑWrQKӑFYLrQ1JX\ӉQ7UӑQJ1DP MSHV: 1570430 1Jj\WKiQJQăPVLQK22/03/1992 1ѫLVLQKCà Mau Chuyên QJjQK&{QJQJKӋWKӵFSKҭP 0mVӕ I 7Ç1Ĉӄ TÀI: KHҦO SÁT HOҤT TÍNH KHÁNG OXY HĨA CӪ$&È&3+Ỉ1Ĉ2ҤN PEPTIDE THU NHҰN TӮ DӎCH THӪY PHÂN PROTEIN CӪA CON RUӔC KHÔ II NHIӊM VӨ VÀ NӜI DUNG: 1KLӋPYө : Khҧo sát hoҥt tính kháng oxy hóa cӫa SKkQÿRҥn peptide thu nhұn tӯ dӏch thӫy phân protein cӫa ruӕc khô 1ӝLGXQJ: Khҧo sát thành phҫn hóa hӑc cӫa ruӕc khơ KhҧRViWÿLӅu kiӋn thӫy phân nhҵm thu dӏch thӫy phân có hoҥt tính kháng oxy hóa cao nhҩt TӕLѭXKyDÿLӅu kiӋn thӫy phân nhҵm thu dӏch thӫy phân có hoҥt tính kháng oxy hóa cao nhҩt 7iFKSKkQÿRҥn dӏch thӫy phân khҧo sát hoҥt tính kháng oxy hóa cӫDFiFSKkQÿRҥn III NGÀY GIAO NHIӊM VӨ: 10-7-2017 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIӊM VӨ: 03-12-2017 IV CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN: TS : 9}ĈuQK/Ӌ Tâm Tp HCM, ngày 03 tháng 01 QăP18 CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN CHӪ NHIӊM BӜ 0Ð1Ĉ¬27ҤO (Hӑ tên chӳ ký) (Hӑ tên chӳ ký) 75ѬӢNG KHOA (Hӑ tên chӳ ký) LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài luận văn thạc sĩ nhờ hƣớng dẩn nhiệt tình quý Thầy Cô, nhƣ động viên ủng hộ gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến Cơ TS Võ Đình Lệ Tâm ngƣời hết lịng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn q thầy phịng thí nghiệm, đặc biệt Nguyễn Thị Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất… suốt thời gian thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thể q thầy khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa TP HCM tận tình truyền đạt kiến thức quý báo nhƣ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn đến gia đình, q thầy bạn bè hỗ trợ tơi nhiều suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận văn thạc sĩ TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Trọng Nam i TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein ruốc khô đƣợc khảo sát Đầu tiên, thành phần hóa học ruốc khơ đƣợc phân tích gồm 72,8% protein, 16,8% tro, 4,3% béo (theo khối lƣợng chất khô) 12,3% ẩm Tiếp theo, ảnh hƣởng loại enzyme, pH, nhiệt độ, tỉ lệ enzyme/cơ chất, thời gian thủy phân lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân đƣợc khảo sát sử dụng phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH (2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl) phƣơng pháp khử sắt FRAP Kết cho thấy hoạt tính kháng oxy dịch thủy phân cao (67,32% ) sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme, pH 7, nhiệt độ 55°C, tỉ lệ enzyme/cơ chất 60 U/g protein, thời gian thủy phân Sau đó, điều kiện thuỷ phân đƣợc sàng lọc tối ƣu hoá sử dụng thiết kế ma trận Plackett-Burman phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM-CCC) thông qua ảnh hƣởng pH, nhiệt độ, tỉ lệ enzyme/cơ chất, thời gian thủy phân lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân sử dụng phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH Kết cho thấy dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy cao theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH đạt 68,01% sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme, pH 7, nhiệt độ 55°C, tỉ lệ enzyme/cơ chất 59,39 U/g protein thời gian thủy phân 3,05 Sau dịch thủy phân đƣợc tách phân đoạn sử dụng thiết bị ly tâm siêu lọc với kích thƣớc màng lọc 30kDa, 10 kDa, kDa kDa Kết cho thấy phân đoạn peptide < kDa có hoạt tính kháng oxy hóa cao với giá trị ức chế 50% gốc tự DPPH (IC50) đạt 1107,7 µg/mL cao giá trị IC50 Vitamin C 150 lần giá trị FRAP đạt 151 µM Trolox thấp giá trị FRAP vitamin C 454 lần Điều cho thấy tiềm nghiên cứu, ứng dụng ruốc khô nhƣ nguồn protein tự nhiên để thu nhận peptide có hoạt tính kháng oxy hóa ứng dụng công nghiệp thực phẩm dƣợc phẩm ii ABSTRACT In this study, the antioxidant activity of protein fractions isolated from protein hydrolysate of dried Acetes were investigated using ultrafiltration centrifugal devices with distinct molecular-weight cutoffs 30kDa, 10kDa, 3kDa and 1kDa Firstly, the chemical composition of dried Acetes was analysed The result showed that dried Acetes contained 72,8% crude protein, 16,8% ash, 4,3% crude lipid (on dry weight basis) and 12,3% moisture Secondly, the effects of five factors including enzyme types, pH value, hydrolysis temperature, enzyme/substrate ratio and hydrolysis time on the antioxidant activity of protein hydrolysates were optimized using DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical scavenging method and FRAP (Rerric Reducing Antioxidant Potential) method The optimal conditions for highest antioxidant activity of the hydrolysate were enzyme Flavourzyme, pH 7.0, 55°C, enzyme/substrate ratio of 60 U/g protein and hydrolysis time of hours Then, Plackett-Burman and Response surface methodology (RSM-CCC) were used to obtain the best optimal hydrolysis conditions assessed by DPPH radical scavenging ability The antioxidant potential of the hydrolysate reached 68,01% when enzyme was Flavourzyme, pH was 7, hydrolysis temperature was 55°C, enzyme/ substrate ratio was 59,39 U/g protein and hydrolysis time was 3,05 hours Next, the proteolysate was further fractionated using MWCOs of 30kDa, 10kDa, 3kDa and 1kDa and peptide fractions were investigated for their antioxidant activity The result showed that the < 1kDa fraction showed the strongest antioxidant activity with the IC50 value of 1107,7 µg/mL which was 150-fold higher than that of Vitamin C and the FRAP value of 151 µM Trolox equivalent which was 454-fold lower than that of Vitamin C After all, dried Actetes can be considered as a potential protein source to obtain natural antioxidative peptides that can be valued food and pharmaceutical industries iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii danh mục hình viii danh mục bảng ix danh mục thuật ngữ viết tắt x ĐẶT VẤN ĐỀ xi CHƢƠNG 1: Tổng quan 1.1 Giới thiệu ruốc 1.1.1 Đặc điểm phân loại ruốc 1.1.2 Tình hình thu hoạch, chế biến xuất ruốc 1.2 Dịch thủy phân protein 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Tính chất hóa lý 1.2.3 Hoạt tính sinh học dịch thủy phân 1.2.4 Các phƣơng pháp thủy phân protein .5 1.3 Peptide có hoạt tính sinh học .6 1.3.1 Khái niệm peptide sinh học 1.3.2 Các hoạt tính sinh học peptide .7 1.4 Enzyme protease 1.4.1 Giới thiệu 1.5 Chất chống oxy hóa 10 1.5.1 Khái niệm 10 iv 1.5.2 Phân loại .10 1.5.3 Một số phƣơng pháp phân tích hoạt tính kháng oxy hóa 10 1.6 Tách phân đoạn peptide .11 1.6.1 Giới thiệu thu nhận phân đoạn peptide .11 1.6.2 Phƣơng pháp thu nhận phân đoạn peptide 11 1.7 Tình hình nghiên cứu dịch thủy phân từ thủy sản nƣớc 13 1.7.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc .13 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc .13 CHƢƠNG 2: nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu .15 2.1 Nguyên liệu 15 2.1.1 Ruốc khô .15 2.1.2 Chế phẩm enzyme .15 2.1.3 Hóa chất 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16 2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 16 2.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp DPPH, FRAP 17 2.4 Các quy trình nghiên cứu 20 2.4.1 Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu 20 2.4.2 Quy trình sản xuất dịch thủy phân từ ruốc khô sử dụng chế phẩm enzyme 20 2.4.3 Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học nguyên liệu 22 2.4.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 22 v 2.4.5 Phƣơng pháp sàng lọc yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân .23 2.4.6 Phƣơng pháp tối ƣu hoá điều kiện thuỷ phân .23 2.4.7 Phƣơng pháp tách phân đoạn peptide dịch thuỷ phân 24 2.4.8 Phân tích thống kê 24 CHƢƠNG 3: kết bàn luận 25 3.1 Kết khảo sát thành phần hóa học ruốc khơ 25 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng loại enzyme thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH phƣơng pháp khử sắt FRAP 26 3.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH phƣơng pháp khử sắt FRAP 27 3.4 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH phƣơng pháp khử sắt FRAP 30 3.5 Kết khảo sát ảnh hƣởng tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH phƣơng pháp khử sắt FRAP 32 3.6 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH phƣơng pháp khử sắt FRAP .34 3.7 Kết sàng lọc thông số ảnh hƣởng q trình thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân sử dụng phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH 36 3.8 Kết tối ƣu hóa điều kiện thủy phân với thông số tỉ lệ E/S thời gian thủy phân sử dụng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt RSM-CCC 38 vi o Bộ cất đạm - Hoá chất o H2SO4 đậm đặc o Xúc tác H2O2/H2SO4 o NaOH 40% o Dung dịch NaOH 0,1 N, dung dịch chuẩn H2SO4 0,1 N o Thuốc thử phenolphthalein - Cách tiến hành Vơ hố mẫu: Tiến hành tủ Hotte Cân 0,5 g mẫu cho vào bình Kjeldahl Thêm vào từ từ 10 mL H2SO4 đậm đặc Sau thêm chất xúc tác H2O2/H2SO4, đun nhẹ hỗn hợp để tránh sôi trào đun mạnh hỗn hợp hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng Trong trình đun thình thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu ngun liệu thí nghiệm chƣa bị phân huỷ sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng Cất đạm: Sau vơ hóa kết thúc, mẫu đƣợc đem cất đạm máy cất bán tự động Gerhardt Chuyển toàn mẫu sau vơ hố xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100, thêm nƣớc cất vạch định mức Lúc nhiệt toả mạnh nƣớc bay phần Làm nguội điều chỉnh lại mức nƣớc để tránh sai số, sau đổ erlen để dễ lắc trộn dung dịch mẫu đồng Chuẩn bị máy: cắm điện, bật máy, hình lên chữ “H”, mở vòi nƣớc - Làm lạnh, chờ đến hình chữ “P”, máy sẵn sàng làm việc - Cho 20 mL acid boric 2% vào bình tam giác 100 mL, thêm giọt thuốc thử, lắp - Vào vị trí hứng mẫu máy Chú ý nhúng ngập ống vào dung dịch - Lắp ống Kjeldahl chứa mẫu vơ hóa vào hệ thống - Cài đặt chƣơng trình cho máy nhƣ sau: 55 - Nhấn RESET - Nhấn PROGRAM - Step 1: 01 (ứng với 10 mL NaOH 40%) - Nhấn PROGRAM - Step 2: 05 (ứng với thời gian phản ứng giây) - Nhấn PROGRAM - Step 3: 300 (ứng với thời gian sục nƣớc phút) - Nhấn PROGRAM - Step 4: 60 (ứng với hiệu suất làm việc máy) - Nhấn PROGRAM để đƣợc hình với chữ “P” - Cho máy chạy cách nhấn nút RUN - Kết thúc lần thí nghiệm hình lên chữ “End”, ta thay ống phản ứng tiếp tục nhấn RUN - Cơng thức tính tốn: Hàm lƣợng nitơ tổng: N (a  b.K)  0,0014  V 100 Vm Trong đó: o N: hàm lƣợng nitơ tính phần trăm khối lƣợng o a: số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0,1 N đem hấp thu NH3 o b: số mL NaOH 0,1 N tiêu tốn cho chuẩn độ o m: khối lƣợng mẫu vơ hố, g o V: tổng thể tích định mức dung dịch vơ hố (100 mL) o v: thể tích dung dịch vơ hố dùng chƣng cất (10 mL) o 0,0014: lƣơng gam nito ứng với mL H2SO4 0,1 N o K: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N 56 Hàm lƣợng protein thơ: Protein (%) = Nitơ (%) × 6,25 A.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Chén nung sứ o Đèn cồn hay bếp điện o Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (500 – 600°C) o Cân phân tích o Bình hút ẩm - Hố chất o HNO3 đậm đặc H2O2 - Tiến hành Nung chén rửa tới 500 – 600°C đến trọng lƣợng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001 g Cho vào chén khoảng g mẫu Cân tất cân phân tích Cho tất vào lị nung tăng nhiệt độ từ từ đến 500 – 600°C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thƣờng 6-8 Trong trƣờng hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc H2O2 nung cho trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân khối lƣợng không đổi Kết hai lần nung cân liên tiếp không cách 0,0005 g cho mẫu - Tính kết quả: X(%) = G1 - G ×100 m Trong : o G khối lƣợng chén nung, g o G1 khối lƣợng chén nung tro tổng số, g o m khối lƣợng mẫu thử, g 57 A.7 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng béo (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Bộ trích ly soxhlet o Tủ sấy o Bình hút ẩm - Hố chất o Dung mơi Hexan - Tiến hành thí nghiệm Sấy khơ ngun liệu đến khối lƣợng khơng đổi Cân xác g ngun liệu đƣợc nghiền nhỏ, cho vào bao giấy đƣợc sấy khô biết khối lƣợng Đặt bao giấy vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lƣợng dung mơi chảy xuống bình cầu lƣợng phễu cịn đủ ngập mẫu Dùng bơng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nƣớc lạnh vào ống sinh hàn Mở cơng tắc đèn bắt đầu trích lipid Điều chỉnh nhiệt độ trích cho chu kỳ hồn lƣu dung môi đạt từ đến lần Chiết trích ly hoàn toàn hết chất béo Thử cách lấy vài giọt dung môi cuối ống xiphong nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay không để lại vết dầu loang kết thúc Cho dung mơi chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra, đặt dƣới tủ hotte cho bay hết dung môi nhiệt độ thƣờng cho vào tủ sấy, sấy 100-105°C 1,5 Để nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lƣợng - Cơng thức tính: X(%) = M1 - M ×100 m Trong : o M1: khối lƣợng bao giấy mẫu ban đầu, g o M2: khối lƣợng bao giấy mẫu sau trích lipid sấy khô, g o m: khối lƣợng mẫu ban đầu, g A.8 Xác định hoạt độ chế phẩm enzyme 58 Định nghĩa: đơn vị hoạt tính enzyme lƣợng enzyme xúc tác chuyển hóa đƣợc µmol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn Phƣơng pháp: sử dụng phƣơng pháp Sigma-Aldrich St Louis Nguyên tắc: Cho enzyme thủy phân tác dụng với chất casein, sản phẩm tạo thành đoạn peptide ngắn, acid amin Trong loại acid amin L- Tyrosine chiếm đa số Xác định L-Tyrosine phản ứng màu với thuốc thử Foline, từ xác định hoạt tính enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Sigma-Aldrich St Louis lƣợng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm pH= 7,5, T = 37°C, thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin, cho độ hấp thu bƣớc sóng 660 nm tƣơng ứng với mM L- Tyrosine đƣờng chuẩn Để xác định hoạt tính chế phẩm enzyme: - Cơ chất: dung dịch L- Tyrosine 1,1 mM; - Điều kiện tiêu chuẩn: pH= 7,5; T = 37°C Hóa chất- thuốc thử - Đệm K2HPO4 50 mM, pH= 7,5; T= 37°C - Casein 0,65% (v/w) - Dung dịch TCA 110 mM - Thuốc thử Folin & Ciocalteu (tỷ lệ thuốc thử:nƣớc cất= 1:4) - Dung dịch Na2CO3 50 mM - Dung dịch đệm acetate 10 mM, pH= 7,5; T= 37°C - Dung dịch L- Tyrosine 1,1 mM Dung dịch enzyme phân tích: pha lỗng nồng độ 8000-10000 (tùy loại chế phẩm enzyme) lần dung dịch đệm acetate mM Tiến hành xác định - Xây dựng đƣờng chuẩn: thực theo bảng dƣới 59 Ống nghiệm Blank Thể tích L- Tyrosine, mL 0,05 0,1 0,2 0,4 H2O, mL 1,95 1,9 1,8 1,6 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Ủ 30 phút 37 So màu bƣớc sóng 660 nm - Đối với mẫu thử Mẫu thử theo bảng dƣới Ống nghiệm Mẫu Blank Dung dịch Casein 0,65%, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 Hóa chất Trộn đều, ủ 37 , thời gian 10 phút Dung dịch TCA 0,11M, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 Trộn đều, ủ 37 , thời gian 30 phút Lọc giấy lọc thu dịch lọc Dịch lọc 2,0 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 60 So màu bƣớc sóng 660nm Tính tốn kết quả: - Hoạt tính enzyme đƣợc tính theo cơng thức sau: U/g x.V1 VE t.V2 Trong đó: - : nồng độ Tyrosine suy từ đƣờng chuẩn, mM - : tổng thể tích phản ứng, 11 mL - : thể tích dịch lọc sử dụng để tiến hành xác định, mL - : thể tích enzyme sử dụng, mL - t: thời gian để phản ứng xảy ra, 10 phút Kết hoạt độ: - Chế phẩm enzyme Alcalase: 1447 U/mL - Chế phẩm enzyme Corolase: 1184 U/mL - Chế phẩm enzyme Flavouzyme: 1111 U/g - Chế phẩm enzyme Neutrase: 1816 U/mL - Chế phẩm enzyme Protamex: 418 U/g 61 PHỤ LỤC B: CÁC BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH Bảng 1: Kết khảo sát ảnh hƣởng loại enzyme lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH Loại enzyme Alcalase Corolase Flavourzyme Neutrase Protamex Hoạt tính nhốt 37,27 ± 36,38 ± 46,40 ± 39,50 ± 33,94 ± gốc tự DPPH 0,11bc 0,37c 0,38a 0,31b 0,29d (%) Bảng 2: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng loại enzyme thủy phân lên hoạt tính nhốt gốc tự DPPH dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 726,25 0,0000 Squares Between groups 270,243 67,5608 Within groups 0,930267 10 0,093027 Total (Corr.) 271,174 14 Bảng 3: Kết khảo sát ảnh hƣởng loại enzyme thủy phân lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp khử sắt FRAP Loại enzyme Alcalase Corolase Flavourzyme Neutrase Protamex µM trolox 94,02 ± 92,72 ± 112,10 ± 100,90 ± 75,97 ± 2,3bc 2,7c 6,8a 1,8b 4,4d Bảng 4: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng loại enzyme thủy phân lên hoạt tính khử sắt FRAP dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 30,07 0,0000 Squares Between groups 2077,07 519,267 Within groups 172,667 10 17,2667 Total (Corr.) 2249,73 14 62 Bảng 5: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH pH 5,5 6,5 7,5 Hoạt tính nhốt gốc tự DPPH (%) 33,53 ± 0,64d 39,64 ± 0,51c 41,90 ± 0,43b 42,03 ± 0,3b 44,38 ± 0,14a 42,17 ± 1,65b Bảng 6: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng pH lên hoạt tính nhốt gốc tự DPPH dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 76,07 0,0000 Squares Between groups 234,419 46,8837 Within groups 7,39613 12 0,616344 Total (Corr.) 241,815 17 Bảng 7: Kết khảo sát ảnh hƣởng pH lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp khử sắt FRAP pH 5,5 6,5 7,5 µM trolox 61,3 ± 1,1d 72,14 ± 2,3c 83,00 ± 1,2b 82,86 ± 2,0b 105,77 ± 3,4a 84,00 ± 2,65b Bảng 8: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng pH lên hoạt tính khử sắt FRAP dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 134,34 0,0000 Squares Between groups 3321,17 664,233 Within groups 59,3333 12 4,94444 Total (Corr.) 3380,5 17 63 Bảng 9: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phâ º Nhiệt độ ( C) 40 45 50 55 60 Hoạt tính nhốt 40,65 ± 44,81 ± 44.,72 ± 51,00 ± 48,03 ± gốc tự DPPH 0,15 d c 0,41 c a 1,06 n b 1,86 1,33 theo phƣ ơng (%) pháp nhốt gốc tự DPPH Bảng 10: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính nhốt gốc tự DPPH dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 34,72 0,0000 Squares Between groups 182,208 45,5519 Within groups 13,1201 10 1,31201 Bảng 11: Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp khử sắt FRAP Nhiệt độ (0C) 40 45 50 55 60 µM trolox 110,25 ± 134,09 142,10 168,47 161,91 3,0d ±4,3c ± 2,2c ± 1,6a ± 2,8b Bảng 12: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính khử sắt FRAP dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square Squares 64 F-Ratio P-Value Between groups 6172,27 1543,07 Within groups 54,6667 10 5,46667 Total (Corr.) 6226,93 14 282,27 0,0000 Bảng 13: Kết khảo sát ảnh hƣởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH Tỉ lệ E/S 30 40 50 60 70 Hoạt tính nhốt gốc 49,87 ± 51,26 ± 52,70 ± 58,07 ± 56,30 ± tự DPPH (%) 0,46e 0,17d 0,84c 0,02a 0,25b (U/g protein) Bảng 14: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính nhốt gốc tự DPPH dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 98,12 0,0000 Squares Between groups 142,316 35,5791 Within groups 3,62607 10 0,362607 Total (Corr.) 145,942 14 Bảng 15: Kết khảo sát ảnh hƣởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp khử sắt FRAP Tỉ lệ E/S 30 40 50 60 70 163,78 ± 172,71 ± 180,39 ± 241,95 ± 190,61 3,0c 1,6c 1,6c 3,4a ± 4,3b (U/g protein) µM trolox 65 Bảng 16: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính khử sắt FRAP dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 350,46 0,0000 Squares Between groups 11308,3 2827,07 Within groups 80,6667 10 8,06667 Total (Corr.) 11388,9 14 Bảng 17: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp nhốt gốc tự DPPH Thời gian thủy phân Hoạt tính nhốt gốc tự 63,33 ± 67,32 ± 57,68 ± 56,02 ± 55,04 ± DPPH (%) 0,84b 0,28a 1,22bc 0,13c 0,06c (giờ) Bảng 18: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên hoạt tính nhốt gốc tự DPPH dịch thủy phân Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 331,171 82,7926 179,6 0,0000 Within groups 4,60987 10 0,460987 Total (Corr.) 335,78 14 Bảng 19: Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân theo phƣơng pháp khử sắt FRAP Thời gian thủy phân (giờ) µM trolox 237,25 ± 8,0 b 322,14 ± 11,0 66 a 226,15 ± 3,,1 b 195,91 ± 2,6 c 192,72 ± 9,3c Bảng 20: Kết phân tích thống kê ảnh hƣởng thời gian thủy phân lên hoạt tính khử sắt FRAP dịch thủy phân Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 140,58 0,0000 Squares Between groups 33140,4 8285,1 Within groups 589,333 10 58,9333 Total (Corr.) 33729,7 14 Bảng 21: Kết sàng lọc yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính nhốt gốc tự DPPH Biến thực pH Nhiệt độ (°C) Tỉ lệ E/S (U/g protein) Thời gian (giờ) 6,5 50 50 42,33 43,89 43,11 6,5 50 70 48,32 52,11 51,07 7,5 60 50 43,61 41,99 42,56 7,5 60 70 48,52 50,01 49,67 55 60 52,41 55,33 53,87 6,5 60 50 47,89 50,35 51,13 6,50 60 70 55,81 57,82 55,75 7,5 50 50 50,11 48,52 49,99 7,5 50 70 57,09 58,59 57,84 10 55 60 54,13 53,87 54,45 11 55 60 52,93 55,67 55,68 Thí nghiệm Hoạt tính nhốt gốc tự DPPH (%) Bảng 21: Kết tối ƣu yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính nhốt gốc tự DPPH 67 Biến thực Thí nghiệm Tỉ lệ E/S (U/g protein) Thời gian (giờ) 50 60,61 58,73 59,22 70 66,09 64,33 67,04 50 66,87 68,21 67,48 70 56,52 58,17 59,07 45,86 60,09 62,71 60,86 74,14 61,35 64,49 62,92 60 1,586 59,61 61,41 60,24 60 4,414 61,25 59,83 61,68 60 69,21 66,35 67,3 10 60 68,62 68,21 70,23 11 60 68,35 67,19 68,22 12 60 66,54 68,9 67,72 13 60 65,79 67,15 67,52 Hoạt tính nhốt gốc tự DPPH (%) Bảng 23: Kết hoạt IC50 phân đoạn peptide Phân đoạn >30 30-10 10-3 3-1 30 30-10 10-3 3-1