Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein của phụ phẩm cá hồi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA oOo NGUYỄN THÀNH PHƯƠNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN PEPTIDE THU NHẬN TỪ DỊCH THUỶ PHÂN PROTEIN CỦA PHỤ PHẨM CÁ HỒI Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số : 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, 01/2018 i &Ð1*75Ỵ1+ĈѬӦC HỒN THÀNH TҤI 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA –Ĉ+4*–TP.HCM Cán bӝ Kѭӟng dүn khoa hc: TS 9đẻ1+/ TM Cỏn b chm nhn xột 1: PGS TS: Hoàng Thӏ Kim Anh Cán bӝ chҩm nhұn xét 2: TS: Lê Thӏ Nga LuұQYăQWKҥFVƭÿѭӧc bҧo vӋ tҥL7UѭӡQJĈҥi hӑF%iFK.KRDĈ+4*7S+&0 1Jj\WKiQJQăP Thành phҫn HӝLÿӗQJÿiQKJLiOXұQYăQWKҥFVƭJӗm: (Ghi rõ hӑ, tên, hӑc hàm, hӑc vӏ cӫa HӝLÿӗng chҩm bҧo vӋ luұQYăQWKҥFVƭ Chӫ Tӏch: GS 76/r9ăQ9LӋt Mүn Phҧn biӋn 1: PSG.TS Hoàng Thӏ Kim Anh Phҧn biӋn 2: TS Lê Thӏ Nga Ӫy viên: TS: Tôn Nӳ Minh NguyӋt Ӫy viên, TKѭNê: TS Trҫn Thӏ Ngӑc Yên Xác nhұn cӫa Chӫ tӏch HӝLÿӗQJÿiQKJLiOXұQYăQYj7Uѭӣng Khoa quҧn lý chuyên ngành sau luұQYăQÿmÿѭӧc sӱa chӳa (nӃu có) CHӪ TӎCH HӜ,ĈӖNG 75ѬӢNG KHOA ĈҤI HӐC QUӔC GIA TP.HCM 75ѬӠ1*ĈҤI HӐC BÁCH KHOA CӜNG HÒA XÃ HӜI CHӪ 1*+Ƭ$9,ӊT NAM Ĉӝc lұp - Tӵ - Hҥnh phúc NHIӊM VӨ LUҰ19Ă17+Ҥ&6Ƭ +ӑWrQKӑFYLrQ1JX\ӉQ7KjQK3KѭѫQJ MSHV: 1570436 1Jj\WKiQJQăPVLQK06/06/1987 1ѫLVLQKNinh Thuұn Chuyên QJjQK&{QJQJKӋWKӵFSKҭP 0mVӕ I 7Ç1Ĉӄ TÀI: KHҦO SÁT HOҤT TÍNH KHÁNG OXY HĨA CӪ$&È&3+Ỉ1Ĉ2ҤN PEPTIDE THU NHҰN TӮ DӎCH THӪY PHÂN PROTEIN PHӨ PHҬM CÁ HӖI II NHIӊM VӨ VÀ NӜI DUNG: 1KLӋPYө : Khҧo sát hoҥt tính kháng oxy hóa cӫDFiFSKkQÿRҥn peptide thu nhұn tӯ dӏch thӫy phân protein phө phҭm cá Hӗi 1ӝLGXQJ: Khҧo sát thành phҫn hóa hӑc cӫa phө phҭm cá Hӗi KhҧRViWÿLӅu kiӋn thӫy phân nhҵm thu dӏch thӫy phân có hoҥt tính kháng oxy hóa cao nhҩt TӕLѭXKyDÿLӅu kiӋn thӫy phân nhҵm thu dӏch thӫy phân có hoҥt tính kháng oxy hóa cao nhҩt 7iFKSKkQÿRҥn dӏch thӫy phân khҧo sát hoҥt tính kháng oxy hóa cӫDFiFSKkQÿRҥn III NGÀY GIAO NHIӊM VӨ: 10-7-2017 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIӊM VӨ: 03-12-2017 IV CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN: TS : 9}ĈuQK/Ӌ Tâm Tp HCM, ngày 03 tháng 01 QăP18 CÁN BӜ +ѬӞNG DҮN CHӪ NHIӊM BӜ 0Ð1Ĉ¬27ҤO (Hӑ tên chӳ ký) (Hӑ tên chӳ ký) 75ѬӢNG KHOA (Hӑ tên chӳ ký) LỜI CẢM ƠN Sau học ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn tới quý thầy cô môn Công nghệ thực phẩm thầy cô giảng dạy em thời gian qua Thầy cô truyền đạt nhiều kiến thức chun mơn mà cịn có kiến thức xã hội Thầy cô nguồn cảm hứng để khơi dạy sáng tạo, mới, tạo môi trường động kỹ làm việc nhóm mà thầy có để dậy cho chúng em Em muốn cám ơn đặt biệt tới cô TS.Võ Đình Lệ Tâm, ln tận tình theo sát hướng dẫn giúp đỡ em để em hoàn thành luận văn cách tốt Qua em muốn cám ơn tới nhóm thí nghiệm Tâm hướng dẫn Các bạn người cộng tốt nhất, nhiệt tình giỏi kiến thức chun mơn Em xin chân thành cảm ơn q thầy phịng thí nghiệm, đặt biệt KS Nguyễn Thị Ngun giúp đỡ tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất… suốt thời gian thực luận văn Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Mặt dù có nhiều khó khăng thiếu xót nhờ có giúp đỡ thầy cơ, bạn, quan tâm từ gia đình em hồn thành luận văn cách tốt Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất thầy cô bạn bè TP Hồ Chí Minh, 25 tháng 12 năm 2017 Học viên thực Nguyễn Thành Phương iv TÓM TẮT Hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein phụ phẩm cá Hồi (Salmo salar) sử dụng chế phẩm enzyme khảo sát nghiên cứu Thành phần hóa học phụ phẩm cá Hồi (Salmo salar) gồm có độ ẩm khoảng 61,9%, hàm lượng protein khoảng 44,37%, hàm lượng lipid khoảng 45,4% hàm lượng tro khoảng 10,2% (tính theo hàm lượng chất khơ) Sau đó, điều kiện thủy phân khảo sát nhằm thu nhận dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxy hóa cao Kết cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân đạt giá trị cao sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme pH 7, nhiệt độ 50°C, tỉ lệ enzyme/cơ chất (E/S) 50U/g protein, thời gian thủy phân Tiếp theo, điều kiện thủy phân tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với yếu tố tỉ lệ enzyme/cơ chất (E/S) thời gian thủy phân theo phương pháp bắt gốc tự DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Sau tối ưu, dịch thủy phân có khả bắt 35,4% gốc DPPH, (cao 1,01 lần so với trước tối ưu hóa) tỉ lệ E/S 49,83 U/g protein, thời gian thủy phân 7,97 giờ, nhiệt độ 50°C, pH Cuối cùng, dịch thủy phân tách phân đoạn peptide sử dụng thiết bị ly tâm siêu lọc theo kích thước phân tử peptide 30 kDa, 10 kDa, kDa kDa Kết cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn < kDa cao nhất, giá trị IC50 cao 250 lần so với IC50 vitamin C, giá trị FRAP thấp 270 lần so với giá trị FRAP vitamin C Kết cho thấy tiềm sử dụng phụ phẩm cá Hồi nguồn protein tự nhiên nhằm thu nhận phân đoạn peptide có hoạt tính kháng oxy hóa v ABSTRACT The antioxidant activity of peptide fractions isolated from protein hydrolysate of salmon by – product (Salmo salar) using enzyme preparation was investigated in this study The chemical composition of the by – product includded moisture of 61.9%, the protein contnet of 44.4%, the lipid content of 45.4% and the mianeral content of 10.2% (on dry weight basis) After that, the hydrolysis condition was examined to obtain the proteolysate with highest antioxidant activity The result revealed reached the highest value when using Flavourzyme at pH 7, 500C, enzyme/subtrate (E/S) ratio of 50 U/g protein and hydrolysis time of hours (h) Then, the hydrolysis condition was optimized using reponse suface methodology (RSM) via enzyme/subtrate ratio and hydrolysis time using DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical scavenging assay (DPPH method) After optimization, the hydrolysate could scavenge 35.4% DPPH, higher 1.13% than before optimization with E/S ratio of 49.83 U/g protein, hydrolysis time of 7.97 hours, at 500C, pH Finally, the hydrolysate was fractionated using centrifugal ultrfiltration devices with molecular sizes of 30kDa, 10kDa, 3kDa and kDa The result showed that the < 1kDa peptide fractions showed highest antioxidant activity, with the IC50 250 – fold higher than that of vitamin C, FRAP value 270 – fold lower than that of vitamin C These findings indicated that the potential in using salmon by – product as a natural protein source to obtain the antioxidative peptide fractions vi LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v ABSTRACT vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi DANH MỤC BẢNG xii DANH MỤC HÌNH xiv Chương 1.1 TỔNG QUAN Giới thiệu cá Hồi 1.1.1 Cá Hồi 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Tình hình ni, chế biến thị trường cá Hồi giới 1.1.5 Phụ phẩm chế biến cá Hồi 1.2 Dịch thuỷ phân protein 1.2.1 Tính chất dịch thuỷ phân protein 1.2.2 Hoạt tính dịch thuỷ phân 1.2.3 Các phương pháp thuỷ phân protein 1.2.4 Dịch thuỷ phân protein từ cá 1.2.5 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ cá 1.3 Peptide có hoạt tính sinh học 10 1.3.1 Peptide kháng oxy hóa 10 1.3.2 Peptide kháng vi sinh vật 11 1.3.3 Peptide liên kết Canxi 12 1.3.4 Peptide ức chế enzyme chuyển đổi Angiotensin-I 13 1.4 Enzym protease 14 vii 1.4.1 Giới thiệu 14 1.4.2 Phân loại 14 1.4.3 Cơ chế xúc tác Protease 16 1.5 Chất kháng oxy hoá 17 1.5.1 Giới thiệu 17 1.5.2 Một số phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hố 18 1.5.3 Dịch thuỷ phân peptide kháng oxy hoá 20 1.6 Thu nhận peptide 22 1.6.1 1.7 Phương pháp thu nhận phân đoạn peptide 22 Tổng quan tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá dịch thủy phân protein từ cá phân đoạn peptide 23 Chương 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 Nguyên liệu 27 2.1.1 Phụ phẩm cá hồi 27 2.1.2 Chế phẩm enzyme 27 2.1.3 Hoá chất khác 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 29 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 33 2.3.2 Phương pháp xác định thành phần hoá học nguyên liệu 33 2.3.3 Quy trình sản xuất dịch thuỷ phân từ phụ phẩm chế biến cá Hồi sử dụng chế phầm enzyme 34 2.3.4 Phương pháp thuỷ phân 36 viii 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá 36 2.3.6 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân 37 2.3.7 Phương pháp tách phân đoạn peptide dịch thuỷ phân 40 2.3.8 Phân tích thống kê 41 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42 3.1 Kết khảo sát thành phần hoá học phụ phẩm chế biến cá Hồi 42 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng loại enzyme thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hố dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự DPPH phương pháp FRAP 43 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính kháng oxy hố dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự DPPH phương pháp FRAP 45 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxy hoá dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự DPPH phương pháp FRAP 47 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ E/S đến hoạt tính kháng oxy hố dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự DPPH phương pháp FRAP 49 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hoá dịch thuỷ phân sử dụng phương pháp bắt gốc tự DPPH phương pháp FRAP 51 3.7 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân để thu dịch thủy phân có hoạt tính kháng oxi hóa cao 53 3.7.1 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa dịch thủy phân 53 3.7.2 3.8 Kết tách phân đoạn peptide dịch thủy phân 59 Chương 4.1 Thí nghiệm tối ưu hóa 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận 61 ix Chuẩn bị dung dịch FRAP cho lần phân tích, pha hỗn hợp theo tỷ lệ R2: R4: R5 = 10:1:1 (50mL: 5mL: 5mL) → dung dịch R6 giữ 37oC o Xây dựng đường chuẩn B1: Pha dung dịch chuẩn Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-teTramethylchroman-2carboxylic acid) giá trị nồng độ: 0; 100;150; 200; 250; 300 µM Nồng độ 100 150 200 250 300 (ống 0) (ống 1) (ống 2) (ống 3) (ống 4) (ống 5) Trolox µL 30 45 60 75 90 Ethanol µL 150 120 105 90 75 60 B2: Thêm 2850 µL dd FRAP, để 30 phút, nhiệt độ phòng B3: Voxtex B4: Đo quang bước sóng 593 nm, (mẫu blank ethanol) Xác định hoạt tính chống oxy hóa mẫu B1: Pha loãng mẫu nước cất cho độ giảm hấp thu lọt vào đường chuẩn B2: Thực tương tự thay 150 µL dd chuẩn mẫu pha loãng B3: Đo độ hấp thu 593 nm - Tính kết Dựa vào đường chuẩn để tính tốn đương lượng mol Trolox Kết biểu diễn theo nồng độ trolox (µM) A.4 Phương pháp xác định ẩm (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Tủ sấy o Cốc cân - Tiến hành thí nghiệm 74 Xác định khối lượng khô tuyệt đối cốc cân: sấy cốc cân 1050C Tại thời điểm sấy cuối cùng, đậy nắp cốc cân chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phịng, sau tiến hành cân (trước cân mở nắp cốc cân để làm cân áp suất đậy lại ngay) Cân 2g mẫu thử vào cốc cân, mở nắp cho vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 1050C mẫu thử đạt khối lượng không đổi Mẫu thử coi đạt khối lượng không đổi, chênh lệch lần cân liên tiếp khơng lớn 0,05% mẫu thử có khối lượng cân ban đầu 2g - Cơng thức tính tốn Trong đó: m1 khối lượng mẫu thử trước sấy, tính gam; m2 khối lượng mẫu thử sau sấy, tính gam A.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein (Phương pháp Kjeldahl) (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Bình Kjeldahl o Bộ vô o Tủ Hotte o Bộ cất đạm - Hoá chất o H2SO4 đậm đặc o Xúc tác H2O2/H2SO4 o NaOH 40% o Dung dịch NaOH 0,1N, dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N o Thuốc thử phenolphthalein - Cách tiến hành Vơ hố mẫu: Tiến hành tủ Hotte 75 Cân 0,5g mẫu cho vào bình Kjeldahl Thêm vào từ từ 10mL H2SO4 đậm đặc Sau thêm chất xúc tác H2O2/H2SO4, đun nhẹ hỗn hợp để tránh sôi trào đun mạnh hỗn hợp hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng Trong trình đun thình thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu ngun liệu thí nghiệm chưa bị phân huỷ sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng Cất đạm Sau vơ hóa kết thúc, mẫu đem cất đạm máy cất bán tự động Gerhardt Chuyển toàn mẫu sau vơ hố xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100, thêm nước cất vạch định mức Lúc nhiệt toả mạnh nước bay phần Làm nguội điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đổ erlen để dễ lắc trộn dung dịch mẫu đồng Chuẩn bị máy: cắm điện, bật máy, hình lên chữ “H”, mở vòi nước - Làm lạnh, chờ đến hình chữ “P”, máy sẵn sàng làm việc - Cho 20 mL acid boric 2% vào bình tam giác 100 mL, thêm giọt thuốc thử, lắp - Vào vị trí hứng mẫu máy Chú ý nhúng ngập ống vào dung dịch - Lắp ống Kjeldahl chứa mẫu vơ hóa vào hệthống - Cài đặt chương trình cho máy nhưsau: - Nhấn RESET - Nhấn PROGRAM - Step 1: 01 (ứng với 10 mL NaOH 40%) - Nhấn PROGRAM - Step 2: 05 (ứng với thời gian phản ứng giây) - Nhấn PROGRAM - Step 3: 300 (ứng với thời gian sục nước phút) - Nhấn PROGRAM - Step 4: 60 (ứng với hiệu suất làm việc máy) 76 - Nhấn PROGRAM để hình với chữ “P” - Cho máy chạy cách nhấn nút RUN - Kết thúc lần thí nghiệm hình lên chữ “End”, ta thay ống phản ứng tiếp tục nhấn RUN - Công thức tính tốn Hàm lượng nitơ tổng: Trong đó: o N: hàm lượng nitơ tính phần trăm khối lượng o a: số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N đem hấp thu NH3 o b: số mL NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ o m: khối lượng mẫu vô hố, g o V: tổng thể tích định mức dung dịch vơ hố (100 mL) o v: thể tích dung dịch vơ hố dùng chưng cất (10 mL) o 0,0014: lương gam nito ứng với mL H2SO4 0,1N o K: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N Hàm lượng protein thô : Protein (%) = Nitơ (%) × 6,25 A.6 Phương pháp xác định hàm lượng tro (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Chén nung sứ o Đèn cồn hay bếp điện o Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (500 – 6000C) o Cân phân tích o Bình hút ẩm - Hoá chất o HNO3 đậm đặc H2O2 - Tiến hành 77 Nung chén rửa tới 500 – 600oC đến trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001g Cho vào chén khoảng 5g mẫu Cân tất cân phân tích Cho tất vào lị nung tăng nhiệt độ từ từ đến 500 – 6000C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thường 6-8 Trong trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc H2O2 nung cho trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân khối lượng khơng đổi Kết hai lần nung cân liên tiếp khơng cách q 0,0005g cho mẫu - Tính kết Trong : o G khối lượng chén nung, g o G1 khối lượng chén nung tro tổng số, g o m khối lượng mẫu thử, g A.7 Phương pháp xác định hàm lượng béo (AOAC, 2000) - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu o Bộ trích ly soxhlet o Tủ sấy o Bình hút ẩm - Hố chất o Dumg mơi Hexan - Tiến hành thí nghiệm Sấy khơ ngun liệu đến khối lượng khơng đổi Cân xác 5g ngun liệu nghiền nhỏ, cho vào bao giấy sấy khô biết khối lượng Đặt bao giấy vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung mơi chảy xuống bình cầu lượng phễu cịn đủ ngập mẫu Dùng bơng làm nút đầu ống sinh 78 hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Mở cơng tắc đèn bắt đầu trích lipid Điều chỉnh nhiệt độ trích cho chu kỳ hồn lưu dung mơi đạt từ đến lần Chiết trích ly hồn tồn hết chất béo Thử cách lấy vài giọt dung môi cuối ống xiphong nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay không để lại vết dầu loang kết thúc Cho dung mơi chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra, đặt tủ hotte cho bay hết dung môi nhiệt độ thường cho vào tủ sấy, sấy 100-1050C 1,5 Để nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lượng - Cơng thức tính Trong : o M1 : khối lượng bao giấy mẫu ban đầu, g o M2 : khối lượng bao giấy mẫu sau trích lipid sấy khơ, g o m : khối lượng mẫu ban đầu, g A.8 Xác định hoạt độ chế phẩm enzyme Định nghĩa: đơn vị hoạt tính Enzyme lượng enzyme xúc tác chuyển hóa µmol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn Phương pháp: sử dụng phương pháp Sigma-Aldrich St Louis Nguyên tắc: Cho enzyme thủy phân tác dụng với chất casein, sản phẩm tạo thành đoạn peptide ngắn, acid amin Trong loại acid amin L- Tyrosine chiếm đa số Xác định L-Tyrosine phản ứng màu với thuốc thử Foline, từ xác định hoạt tính enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme theo phương pháp Sigma-Aldrich St Louis lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm pH= 7,5, T = 37 , thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Foline, cho độ hấp thu bước sóng 660nm tương ứng với mM L- Tyrosine đường chuẩn 79 Để xác định hoạt tính chế phẩm enzyme: - Cơ chất: dung dịch L- Tyrosine 1.1 mM; - Điều kiện tiêu chuẩn: pH= 7,5; T = 37 Hóa chất- thuốc thử - Đệm K2HPO4 50mM, pH= 7,5; T= 37 - Casein 0,65% (w/v) - Dung dịch TCA 110mM - Thuốc thử Foline & Ciocalteau (tỷ lệ thuốc thử: nước cất= 1:4) - Dung dịch Na2CO3 50mM - Dung dịch đệm acetate 10mM, pH= 7,5; T= 37 - Dung dịch L- Tyrosine 1,1mM Dung dịch enzyme phân tích: pha lỗng nồng độ 8000-10000 (tùy loại chế phẩm enzyme) lần dung dịch đệm acetate 1mM Tiến hành xác định - Xây dựng đường chuẩn : thực theo bảng Ống nghiệm Blank Thể tích L- Tyrosine, mL 0,05 0,1 0,2 0,4 H2O, mL 1,95 1,9 1,8 1,6 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Ủ 30 phút 37°C So màu bước sóng 660nm 80 - Đối với mẫu thử Mẫu thử theo bảng Ống nghiệm Mẫu Blank Dung dịch Casein 0,65%, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 Hóa chất Trộn đều, ủ 37°C, thời gian 10 phút Dung dịch TCA 0,11M, mL 5,0 5,0 Dung dịch Enzyme phân tích, mL 1,0 Trộn đều, ủ 37°C, thời gian 30 phút Lọc giấy lọc thu dịch lọc Dịch lọc 2,0 2,0 Dung dịch Na2CO3, mL 5,0 5,0 Thuốc thử Foline, mL 1,0 1,0 Ủ 30 phút 37°C So màu bước sóng 660nm Tính tốn kết - Hoạt tính Enzyme tính theo cơng thức sau: U/g = Trong đó: - : nồng độ Tyrosine suy từ đường chuẩn, mM : tổng thể tích phản ứng, 11 mL 81 - : thể tích dịch lọc sử dụng để tiến hành xác định, mL - : thể tích enzyme sử dụng, mL - t : thời gian để phản ứng xảy ra, 10 phút Kết hoạt độ: - Chế phẩm enzyme Alcalase: 1226,37 U/mL 82 PHỤ LỤC B: CÁC BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH Bảng 1: Kết khảo sát ảnh hưởng loại enzyme lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân Loại enzyme Neutrase Protamex Corolase Alcalase Flavourzyme 23,7 ±0,9d 32,4 ±0,4c 32,2 ±0,5c 33,6 ±0,7b 35,2 ±0,2a Hoạt tính bắt gốc tự DPPH (%) Bảng 2: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng loại enzyme lên hoạt tính bắt tự DPPH dịch thuỷ phân Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 239,702 59,9255 Within groups 3,577 10 0,35775 Total (Corr.) 243,279 14 167,51 Bảng 3: Kết khảo sát ảnh hưởng loại enzyme lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân Loại enzyme Alcalase Corolase protamex neutrase Flavourzyme 19,7 ±0,9e 27,5 ±0,4d 44,9 ±0,5c 54,5 ±0,7b 112,3 ±0,2a Hoạt tính FRAP (μM Trolox) 83 Bảng 4: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng loại enzyme lên hoạt tính FRAP dịch thủy phân Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 16102,8 4025,7 14130,55 Within groups 2,8 10 0,284893 Total (Corr.) 16105,6 14 Bảng 5: Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH• dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme pH Hoạt tính bắt gốc tự DPPH (%) 27,1 ±0,9e 5,5 30,21±0,8d 6,5 32,3 ±0,6c 33,6 ±0,5b 34,8±0,2a Bảng 6: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng pH lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 110,482 27,6204 Within groups 3,9698 10 0,39698 Total (Corr.) 114,451 14 69,58 Bảng 7: Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme pH Hoạt tính FRAP (μM Trolox) 70,7 ±0,5d 5,5 82,8±1,0c 84 83,4 ±0,5c 6,5 94,6 ±0,8 b 113,9±0,9a Bảng 8: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng pH lên hoạt tính khử sắt (III) (FRAP) dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Alcalase Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 3191,5 797,876 Within groups 5,54667 10 0,554667 Total (Corr.) 3197,05 14 1438,48 Bảng 9: Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Nhiệt độ (°C) 40 Hoạt tính bắt gốc tự DPPH (%) 24,8±1,0d 45 50 26,0±1,1c 55 35,6 ±0,8a 35,0±0,7a 60 30,2 ±0,9 b Bảng 10: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 275,14 68,7851 Within groups 6,774 10 0,6774 Total (Corr.) 281,914 14 101,54 Bảng 11: Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Nhiệt độ (°C) 40 e Hoạt tính FRAP 48,2 ±0,8 45 50 65,1 ±0,5 c 110,4 ±0,5a 85 55 85,3 ±0,6b 60 55,3 ±0,8d (μM Trolox) Bảng 12: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 7612,27 1903,07 4673,12 Within groups 4,07237 10 0,407237 Total (Corr.) 7616,34 14 Bảng 13: Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Tỉ lệ E/S Hoạt tính bắt gốc tự DPPH (%) 30 40 50 60 70 30,5 ±0,5bc 30,9 ±0,1b 35,4 ±0,4a 34,3±0,4a 29,0 ±1,2c Bảng 14: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 71,157 17,7893 Within groups 1,4034 10 0,14034 Total (Corr.) 72,5604 14 86 126,76 Bảng 15: Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Tỉ lệ E/S Hoạt 30 40 50 60 70 92,1 ±0,8b 105,6 ±2,1a 69,5 ±1,8c 35,2 ±1,0d tính FRAP (μM 92,1±1,2b Trolox) Bảng 16: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng tỉ lệ E/S lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 9174,2 2293,55 Within groups 21,6715 10 2,16715 Total (Corr.) 9195,87 14 1058,33 Bảng 17: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Thời gian (h) 10 Hoạt tính bắt gốc tự 22,9±0,6d 30,7 ±0,9b 35,0 ±0,5a 30,2 ±0,9b 27,0 ±0,8c DPPH (%) Bảng 18: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng thời gian thủy phân lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0000 Between groups 245,664 61,4159 Within groups 5,6232 10 0,56232 Total (Corr.) 251,287 14 87 109,22 Bảng 19: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Thời gian (h) Hoạt tính FRAP (μM 67,7±4,9c 88,7 ±3,9b 108,6 ±5,7a 94,4 ±6,0b 10 88,2 ±6,2b Trolox) Bảng 20: Kết phân tích thống kê ảnh hưởng thời gian thủy phân lên hoạt tính FRAP dịch thuỷ phân chế phẩm enzyme Flavourzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0,0001 Between groups 2602,9 650,726 Within groups 294,688 10 29,4688 Total (Corr.) 2897,59 14 22,08 Bảng 21: Kết khảo sát hoạt tính bắt gốc tự DPPH phân đoạn peptide từ dịch thuỷ phân theo IC50 chế phẩm enzyme Flavourzyme Phân Lần Lần đoạn (µg/mL) Lần Lần Trung bình Sai số Sai số (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 4387 4364 4367,7 4396,3 47,9 1,1 3962,6 4020,5 4113,0 4042,1 4034,6 62,1 1,5 3359,9 3373,1 3385,6 3439,4 3389,5 34,9 1,0 1-3kDa 2255,1 2243,5 2177,0 2183,5 2214,8 40,2 1,8 30kDa 4466,6 1030kDa 310kDa 88 (%) ... sánh hoạt tính kháng oxy hố vitamin C Vitamin C khảo sát hoạt tính kháng oxy hố để so sánh với hoạt tính kháng oxy hố phân đoạn dịch thu? ?? phân 31 Khảo sát thành phần hoá học phụ phẩm cá hồi Protein. .. giả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá dịch thu? ?? phân protein phụ phẩm cá Địa Trung Hải (cá Mòi, cá Thu ngựa, cá Tráp, cá Bogue cá Nhám mèo) Kết cho thấy DH dịch thu? ?? phân từ loài cá khoảng từ 13,2... [41] 1.5.3 Dịch thu? ?? phân peptide kháng oxy hoá Bảng 1.9 Hoạt tính kháng oxy hố số dịch thu? ?? phân protein Nguồn Phương pháp thủy Hoạt tính kháng oxy hoá Tài liệu phân dịch thu? ?? phân tham khảo Ở 300μg/ml,