NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ HỌ HOA TÁN (APIACEAE) .TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE ) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62 44 01 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC HÀ NỘI - 2017 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Viện Hoá học Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS TSKH Trần Văn Sung Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Trần Văn Lộc Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao sử dụng rộng rãi lĩnh vực y dược, nơng nghiệp đời sống Có nhiều loại thuốc phát triển dựa sở chuyển hóa hóa học từ hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú có nhiều ưu việc chữa trị bệnh thông thường bệnh hiểm nghèo Do đó, hướng nghiên cứu nhà khoa học nước ta giới quan tâm là: Từ hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học chúng để tìm hợp chất có hoạt tính tính chất ưu việt hợp chất ban đầu Cách tiếp cận có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp với thể sống thân thiện môi trường Trong số hợp chất thiên nhiên, hợp chất triterpene có khung ursane nhóm ursolic acid dẫn xuất ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày quan tâm nghiên cứu mặt hoá học dược lý học Trong hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, với tế bào bạch cầu lympho P-388 L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB khả ức chế phát triển khối u da chuột khẳng định Trong trình tìm hiểu thuốc cổ truyền Việt nam, thấy rau má có tên khoa học Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán (Apiaceae) có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane asiatic acid, asiaticosid, madecassic acid, madecassoside… với hàm lượng cao có hoạt tính độc với tế bào ung thư Để tận dụng nguồn nguyên liệu góp phần nghiên cứu, tìm kiếm chất có hoạt tính cao, chúng tơi đặt mục đích sử dụng triterpene tách từ rau má để chuyển hóa chúng tạo thành dãy dẫn xuất thăm dị hoạt tính kháng ung thư chất thu Từ lí trên, chúng tơi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học thăm dị hoạt tính sinh học triterpenoid từ rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)” Nhiệm vụ luận án Nghiên cứu chiết tách tinh chế thành phần hóa học rau má Centella asiatica (L.) Urban thu số vùng Việt Nam Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid madecassic acid phân lập từ rau má thành dẫn xuất chúng Thăm dị hoạt tính sinh học dẫn xuất tổng hợp để tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính chúng Những đóng góp luận án  Đã tiến hành định lượng hai hợp chất triterpene asiatic acid madecassic acid ba mẫu rau má thu Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam Định thành phố Hồ Chí Minh phương pháp sắc ký cột phương pháp HPLC Kết cho thấy hàm lượng hai triterpene mẫu rau má Sơn Tây cao nhất: asiatic acid 0,72%, madecassic acid 0,89% so với nguyên liệu khô Mẫu rau má lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất asiatic madecassic acid phục vụ cho chuyển hóa hóa học  Đã đánh giá hoạt tính bảo vệ gan asiatic acid chiết tách từ rau má mơ hình gây độc gan chuột paracetamol Kết cho thấy asiatic acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng  Đã tổng hợp 29 dẫn xuất asiatic acid biến đổi hóa học tạo amide vị trí C-28, chuyển hóa nhóm hydroxy vị trí C-2, C-3, C-23 Trong số chất tổng hợp có 25 hợp chất mới, chưa cơng bố tài liệu  Từ madecassic acid tổng hợp 17 dẫn xuất thông qua việc tạo amide vị trí C-28 acetyl hóa nhóm hydroxy C-2, C-3 C-23 madecassic acid  Các hợp chất tổng hợp (28 dẫn xuất asiatic acid 14 dẫn xuất madecassic), đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ba dịng tế bào ưng thư: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) Lu-1 (ung thư phổi) Hầu hết dẫn xuất tổng hợp có hoạt tính cao chất đầu Có nhiều chất có hoạt tính cao chất đầu từ 60 đến gần 100 lần ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm Kết hứa hẹn khả tìm chất có hoạt tính kháng ung thư cao, góp phần phát triển ngành hóa dược  Đã rút kết luận mối tương quan Hoạt tính-Cấu trúc dẫn xuất asiatic acid madecassic acid Amide hố nhóm 28-COOH làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ba dịng ung thư thử nghiệm, acetyl hóa nhóm 2-OH, 3OH 23-OH làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư Bố cục luận án Luận án gồm 136 trang gồm: Mở đầu (1 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang), Chương 2: Phương pháp nghiên cứu (3 trang), Chương 3: Thực nghiệm (38 trang), Chương 4: Kết thảo luận (46 trang), Kết luận kiến nghị (2 trang), Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang) Phần tài liệu tham khảo có 124 tài liệu lĩnh vực liên quan đến luận án, cập nhật đến năm 2017 Phần phụ lục gồm 149 trang gồm loại phổ chất phân lập từ rau má, dẫn xuất tổng hợp được, nghiên cứu, dự đốn hoạt tính sinh học số dẫn xuất tổng hợp mơ hình tế bào (docking phân tử), kết thử hoạt tính độc tế bào asiatic acid, madecassic acid dẫn xuất chúng II NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính cấp thiết thực tiễn, đối tượng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kết nghiên cứu thành phần hóa học rau má hoạt tính sinh học chúng 1.2 Một số kết nghiên cứu chiết tách triterpene triterpene glycoside từ rau má Centella asiatica (L.)Urban 1.3 Hoạt tính sinh học rau má 1.4 Hoạt tính sinh học asiatic acid, madecassic acid dẫn xuất 1.5 Một số chuyển hóa asiatic acid 1.6 Tình hình nghiên cứu nƣớc Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các phƣơng pháp chiết xuất phân lập chất Phối hợp phương pháp sắc ký: Sắc ký mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) loại pha tĩnh khác silica gel pha thường, sephadex LH-20… 2.2 Các phƣơng pháp phổ Cấu trúc hóa học hợp chất thiết lập dựa kiện phổ (IR, ESI-MS, 1D-, 2D-NMR), với việc phân tích, so sánh với tài liệu tham khảo 2.3 Các phƣơng pháp tổng hợp hữu Các phương pháp tổng hợp hữu sử dụng bao gồm: Phản ứng acetyl hóa nhóm hydroxyl với anhydride pyridine nhiệt độ phịng Nhóm caboxylic chuyển hóa thành acid chlorid với oxalyl chloride dung môi DCM Phản ứng amide hóa acid chlorid cách thêm amin tương ứng triethylamin (TEA) khuấy nhiệt độ phòng 20 Acetyl hóa amino OH mạch nhánh amide thu acetyl chloride (AcCl) xúc tác DMAP Thủy phân để loại bỏ nhóm chức acetyl KOH 4% MeOH Tạo acetonide vị trí 3-OH 23-OH asiatic acid phản ứng với 2,2dimethoxypropane, TsOH.H2O DMF để bảo vệ nhóm 3-OH 23-OH, sau thực phản ứng este hóa nhóm 2-OH, loại bỏ nhóm bảo vệ vị trí 3OH 23-OH phản ứng thủy phân acid HCl 90 oC 2.4 Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro Hoạt tính gây độc tế bào thực dựa phương pháp MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium) Giá trị thể hoạt tính IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% phát triển tế bào) Phép thử thực Phịng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học 2.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan động vật thực nghiệm Hoạt tính bảo vệ gan thử nghiệm (in vivo) Phịng thí nghiệm thử hoạt tính Sinh học (Viện Hóa học) kết hợp với Phịng thử nghiệm Sinh học (Viện Công nghệ Sinh học) theo mơ hình chuột BALB/c gây độc gan paracetamol thơng qua việc nghiên cứu thay đổi số AST ALT enzyme chức gan, khối lượng gan, hàm lượng MDA (malon dialdehyde) gan 2.6 Nghiên cứu, dự đốn hoạt tính sinh học số dẫn xuất tổng hợp đƣợc hai loại enzyme SIRT1 17β-HSD1 (docking phân tử) Trong luận án chúng tơi hợp tác với nhóm nghiên cứu PGS.TS Lê Thị Lý để thực nghiên cứu docking phân tử 20 dẫn xuất asiatic acid 14 dẫn xuất madecassic acid tổng hợp hai loại enzyme Chƣơng THỰC NGHIỆM 3.1 Nguyên liệu Mẫu rau má Centella asiatica dùng nghiên cứu thu hái Sơn Tây (Hà Nội) tỉnh Nam Định vào tháng tư năm 2010, mẫu rau má Thành phố Hồ Chí Minh thu thập tháng năm 2013 Tên ThS sinh học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội xác định tên khoa học Các tiêu CRM1, CRM2 CRM3 lưu giữ Phịng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học 3.2 Phân lập chất 3.2.1 Phân lập thành phần hóa học rau má thu hái thành phố Hồ Chí Minh Rau má khơ 1200g RMHCM Cao chiết n- Hexane, 3×5L, 2h/ lần Bã n-Hexane, 29g CH2Cl2 , siêu âm 3×4L, 2h/ lần Cao chiết Bã CH2Cl2 , 33g n- BuOH, siêu âm 3×3L, 2h/ lần Cao chiết Bã n-BuOH, 50g Silica gel CH2Cl2/MeOH 95:5-70:30 stigmasterol (43) β-Sitosterol (44) asiatic acid (1) 185 mg madecassic acid (10) 168 mg Hỗn hợp stigmasterol glucoside βsitosterol glucoside (144) Madecassoside (14) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ rau má [C asiatica (L.) Urban] thu hái Thành phố Hồ Chí Minh Các số liệu phổ chất phân lập trình bày phần 3.2.1.2 3.2.2 Nghiên cứu định lƣợng thành phần triterpene acid mẫu rau má thu thập số tỉnh thuộc Bắc Nam Hàm lượng asiatic acid madecassic acid định lượng phương pháp HPLC phương pháp sắc ký cột để so sánh ba mẫu rau má thu Sơn Tây (Hà Nội), Nam Định Thành phố Hồ Chí Minh 3.2.2.1 Xác định hàm lượng asiatic acid phương pháp HPLC 3.2.2.2 Xác định hàm lượng asiatic acid madecassic acid sắc ký cột 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện chiết xuất đến hiệu thu hồi asiatic acid madecassic acid 3.2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 3.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ cồn 3.2.3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết 3.2.4 Phân lập asiatic acid madecassic acid từ rau má Centella asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế dẫn xuất 3.3 Tổng hợp dẫn xuất asiatic madecassic acid 3.3.1 Tổng hợp dẫn xuất asiatic acid 3.3.2 Tổng hợp dẫn xuất madecassic acid 3.4 Thăm dị hoạt tính sinh học số dẫn xuất tổng hợp đƣợc 3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 3.4.2 Hoạt tính bảo vệ gan động vật thực nghiệm (in vivo) Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập chất 4.1.1 Thành phần hóa học rau má thu hái thành phố Hồ Chí Minh Từ cao chiết n-BuOH rau má RMHCM, theo phương pháp phân lập Sơ đồ 3.1, có hợp chất phân lập gồm: Stigmasterol, β-Sitosterol, asiatic acid, madecassic acid, Hỗn hợp stigmasterol glucoside β-sitosterol glucoside (1:1) madecassoside 4.1.2 Định lƣợng asiatic acid madecassic acid rau má phƣơng pháp CC HPLC 4.2.3.1 Phương pháp HPLC Bảng 4.1: Tổng hàm lượng asiatic acid madecassic acid ba mẫu rau má Thành phần Asiatic acid Madecassic acid RMST 4,25 g RMND 4,20 g RMHCM 1,67 g % diện tích pic 33,81 % mẫu khơ 0,718 % diện tích pic 30,49 % mẫu khơ 0,615 % diện tích pic 28,92 % mẫu khô 0,241 41,93 0,891 43,02 0,865 28,61 0,239 4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng asiatic acid madecassic acid 4.3 Chuyển hóa hóa học asiatic acid madecassic acid 4.3.1 Chuyển hóa asiatic acid 4.3.1.1 Chuyển hóa hóa học nhóm COOH vị trí C-28 Như sơ đồ 4.1, asiatic acid chuyển hóa thành dẫn xuất amide phản ứng với hợp chất amin bậc bậc khác Sơ đồ 4.1: Tổng hợp dẫn xuất asiatic acid Các tác nhân điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%, b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) RNH2, DCM, rt, 24 h, (75-92%), d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%, e) KOH, MeOH, rt, 16 h, 72-80%, f) acetyl chloride, DMAP, rt, 85% Trong dãy phản ứng chuyển hóa asiatic acid (1) thành amide, nhóm OH vịng A trước hết bảo vệ với nhóm acetyl Asiatic acid xử lý với acetic anhydride pyridine tạo thành asiatic acid triacetate (145) với hiệu suất 80% Cấu trúc hợp chất 145 khẳng định qua phân tích phổ IR, ESI-MS 1D-NMR Phổ 1H- 13C-NMR hợp chất 145 cho thấy ngồi tín hiệu tương ứng hợp chất xuất tín hiệu nhóm acetyl CH3 H (ppm): 1,92 (3H, s, -CH3-CO), 1,96 (3H, s, -CH3-CO), 2,02 (3H, s, -CH3-CO) C (ppm): 170,83 (CH3CO-), 170,48 (CH3CO-), 170,37 (CH3CO-) Các tín hiệu H2β, H-3α H-23 dịch chuyển phía trường thấp δH (ppm) 3,51 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,78 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3α) 5,09 (1H, dt, J = 4,5, 10,5 Hz, H-2β) so với tín hiệu tương ứng [δH (ppm) 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-3α), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2β)] hợp chất Như nhóm OH acetyl hóa Điều chứng minh thêm phổ FT-IR hợp chất 145 với đỉnh hấp phụ đặc trưng cho acetate 1746,26 1237,00, 1698,88 (-COOH) phổ khối ESI-MS ion dương m/z 615 [M+H]+ Dữ liệu phổ hợp chất 145 giống với tài liệu tham khảo [96] Hợp chất 145 chuyển hóa thành asiatic acid chloride triacetate (146) phản ứng với oxalyl chloride Sản phẩm trung gian này, không cần tách tinh chế, phản ứng với amin tương ứng có mặt triethylaminee làm xúc tác bắt acid HCl Các phản ứng thực nhiệt độ phòng với hiệu suất cao từ 75-92% so với nguyên liệu đầu 145 (Sơ đồ 1) Hợp chất 147 cho thấy phổ 1H-NMR có cụm pic xuất nhóm methylene mạch nhánh H (ppm): 2,69 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, 2H-7’) tín hiệu nhóm methylene mạch nhánh Các kết phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 727 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 hợp hợp chất 147 Như phản ứng amide hóa hợp chất 145 với 1,7-heptadiamin thành cơng Hợp chất 148 cho thấy phổ 1H-NMR có cụm pic xuất nhóm methylene mạch nhánh H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,12-3,14 (2H, m, 2H-9’) Cấu trúc hợp chất 148 khẳng định qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử m/z 755 [M+H]+ tương ứng với CTPT C47H74N2O7 hợp chất 148 phản ứng Hợp chất 149: phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton nhóm methylene mạch nhánh H (ppm): 2,94 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2H-1’), 3,14-3,11 (2H, m, 2H10’) Trên phổ 13C-NMR xuất tín hiệu C (ppm): 30,33-30,68 40,73-41,09 nhóm methylene mạch nhánh Kết khẳng định thêm qua phổ ESI-MS ion dương với pic ion giả phân tử m/z 769 [M+H]+, cho thấy hợp chất 149 phù hợp với CTPT C46H76N2O7 phương trình phản ứng Hợp chất 150: phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton nhóm methylene mạch nhánh H (ppm): 3,11-3,16 (1H, m, H-1’a), 3,53-3,63 (3H, m, H-1’b, 2H3’) Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 672 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H61NO8 Hợp chất 151 cho thấy đỉnh hấp thụ ν* (cm-1): 1742 1235 nhóm acetate nhiều đỉnh hấp thụ xung quanh vùng 3418 nhóm -NHNH2 Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C36H56N2O7 chứng minh phản ứng hợp chất 145 với hydrzine tạo thành sản phẩm mong muốn 151 Trên phổ 1H-NMR amide 152 quan sát thấy tín hiệu triplet δ (ppm): 6,48 (1H, t, J = 4,0 Hz, -NH-amide), đặc trưng cho liên kết amide Ngồi tín hiệu Tương tự cấu trúc hợp chất 157-161 khẳng định phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS công thức sơ đồ (Sơ đồ 4.1)  Phản ứng thủy phân nhóm acetyl vịng A Để so sánh hoạt tính sản phẩm amide có nhóm OH vịng A bị khóa nhóm aceyl nhóm OH tự do, số sản phẩm 147-156 lựa chọn để loại bỏ nhóm Acetyl phản ứng thủy phân dung dịch KOH nhiệt độ phòng, khuấy 16 Xử lý hỗn hợp sau phản ứng thường quy (phần thực nghiệm 3.3.1) thu sản phẩm tương ứng với hiệu suất cao từ 7280% Cấu trúc sản phẩm dãy 162-166 khẳng định thơng qua phân tích phổ ESI-MS 1H-NMR, 13C-NMR Hợp chất 162: Trong phổ 1H-NMR hợp chất 162 khơng cịn tín hiệu nhóm acetyl Ngồi ra, thấy có chuyển dịch hóa học nhóm methyl gắn dị tố oxy phía trường cao tạiH (ppm): 3,29 (1H, d, J = 10,0 Hz, H23a), 3,38 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 5,0, 10,0 Hz, H-2), 5,36 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-12) H (ppm): 2,86 (2H, t, J = 10,0 Hz, H-1’), 3,14 (2H, m, H-7’) Kết khẳng định thêm qua phổ 13C-NMR với vắng mặt tín hiệu nhóm acetyl carbonyl vùng 170 ppm nhóm methyl acetyl vùng trường cao Phổ khối ESIMS ion dương hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 601 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H64N2O5 hợp chất 162 Sơ đồ Hợp chất 163: Tương tự hợp chất 162, phổ 1H-NMR hợp chất 163 khơng cịn tín hiệu cộng hưởng nhóm acetyl vị trí C-2, C-3, C-23 Đồng thời tín hiệu nhóm oxy-methine bị đẩy phía trường cao xuất H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) 2,66 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9’) mạch nhánh Phù hợp với số liệu phổ 13C-NMR thấy vắng mặt tín hiệu nhóm acetyl carbonyl vùng C (ppm): 170 acetyl methyl vùng trường cao Các kết minh chứng thêm phổ ESI-MS ion dương hợp chất 163 với pic ion giả phân tử m/z 629 [M+H]+ phù hợp với CTPT C39H68N2O4 163 Sơ đồ Hợp chất 164: Cũng tương tự hợp chất 162, 163 phổ 1H-NMR hợp chất 164 khơng cịn tín hiệu cộng hưởng nhóm methyl acetyl Đồng thời tín hiệu nhóm oxy methyl dịch chuyển phía trường cao hơn, xuất H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,80 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,73 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) 2,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,13 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-10’) mạch nhánh Phổ 13C-NMR vắng mặt tín hiệu cộng hưởng nhóm acetyl vùng khoảng 170 ppm vùng trường cao Phổ khối ESI-MS ion dương 11 hợp chất cho kết phù hợp với pic ion giả phân tử m/z 643 [M+H]+ tương ứng với CTPT C40H70N2O4 164 Sơ đồ Cấu trúc hợp chất 165, 166 chứng minh tương tự thơng qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR chúng Hợp chất 167 Nhằm tạo dẫn xuất amide bậc asiatic acid, hợp chất 146 phản ứng với dung dịch amoniac đặc nhiệt độ phòng 20 Xử lý phản ứng phần thực nghiệm 3.3.1 thu hợp chất 167 với hiệu suất 88% Cấu trúc hợp chất 167 khẳng định sau: Phổ 1H-NMR hợp chất 167 có mặt nhóm –NH2-amide H (ppm): 5,48 (1H, br s, -NH2) and 5,83 (1H, br s, -NH2) Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất 167 phù hợp với tài liệu [97] Phổ 13C-NMR có tín hiệu nhóm chức – CONH2 C (ppm): 181,01 Trong phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất 167 có pic ion giả phân tử m/z 615 [M+2H]2+ phù hợp với CTPT C36H55NO7 Tương tự với dãy hợp chất 162-166, hợp chất 167 loại bỏ nhóm acetyl phản ứng với dung dịch KOH MeOH khuấy nhiệt độ phòng 16 Xử lý sản phẩm phản ứng phần thực nghiệm thu hợp chất 168 với hiệu suất 72% Trong phổ 1H-NMR hợp chất 168 khơng cịn xuất tín hiệu nhóm methyl singlet nhóm acetyl, đồng thời tín hiệu nhóm oxymethine oxymethylene dịch chuyển phía trường cao xuất H (ppm): 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,72 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu nhóm acetyl (CH3CO-) Phổ khối ion âm ESI-MS hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 523 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H49NO4 hợp chất 168 Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất 168 phù hợp với tài liệu [97] Điều chứng tỏ phản ứng amide hóa triacetate asiatic acid thủy phân dẫn xuất amide để thu dẫn xuất 28-amide thực sơ đồ phản ứng Trong hướng nghiên cứu khác để đánh giá hoạt tính nhóm COOH (C28), amide 167 dehydrat hóa thành nitrile 169 có mặt acetyl chloride, DMAP DCM nhiệt độ phịng Acetyl chloride đóng vai trò loại nước Sản phẩm phản ứng acetic acid HCl DMAP có vai trị bắt acid HCl tạo thành phản ứng (vai trò xúc tác) Sau xử lý hỗn hợp phản ứng tinh chế sản phẩm thu dẫn xuất nitrile 169 Trên phổ hồng ngoại 169 thấy xuất tín hiệu 2228,9 cm-1 đặc trưng cho nhóm -CN Phổ H-NMR dung môi CDCl3 không thấy xuất tín hiệu proton amide bậc 5,83 5,47 ppm chất 168 Đặc biệt, phổ 13CNMR xuất tín hiệu 122,95 ppm đặc trưng cho nhóm -CN Điều chứng tỏ, phản ứng dehydrat hóa xẩy dễ dàng với hiệu suất cao 12 Hợp chất 169 thủy phân nhóm acetyl KOH MeOH nhiệt độ phịng 16 thu hợp chất 170 với hiệu suất 74% Phổ 1H-NMR hợp chất 170 không thấy xuất tín hiệu methyl singlet nhóm acetyl, đồng thời tín hiệu proton gắn với cacbon mang oxi xuất phía trường thấp so với hợp chất 169 H (ppm): 3,30 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,54 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-3), 3,74 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2) Phù hợp với kết trên, phổ 13C-NMR hợp chất 170 khơng cịn tín hiệu carbon nhóm acetyl vùng khoảng 170 ppm vùng trường cao nhóm methyl Tín hiệu nhóm – CN phổ 13C-NMR chất 170 xuất C: 126,41 ppm Phổ khối ESIMS ion âm có pic ion giả phân tử m/z 505 [M+HCl]- phù hợp với CTPT C30H47NO3 4.3.1.2 Chuyển hóa hóa học vịng A asiatic acid Sơ đồ 4.2: Tổng hợp dẫn xuất asiatic acid Các tác nhân điều kiện phản ứng: a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH.H2O, rt., h, 88%, b) succinic anhydride, DMAP, TEA, rt 12 h, 74%, c) (CH3CO)2O, pyridine, rt 12 h, 82%, d) 5% HCl, rt 4h, 90% Để nghiên cứu ảnh hưởng nhóm chức 2-, 3-, 23-hydroxyl đến hoạt tính sinh học asiatic acid, số phản ứng hóa học nhằm tạo dẫn xuất có thay đổi vòng A thực Sơ đồ Asiatic acid (1) phản ứng đóng vịng với 2,2-dimethoxypropane có xúc tác p-toluensulphonic acid (PTSA) nhiệt độ phòng Sau xử lý hỗn hợp phản ứng (xem phần thực nghiệm 3.3.1) thu hợp chất 3,23-dioxo 171 với hiệu suất cao (88%) Hợp chất 171 tác dụng với succinic anhydride triethylamine (TEA) dimethylaminopyridine (DMAP) nhiệt độ phịng 12 cho hợp chất 172 có nhóm chức succinate vị trí C-2 với hiệu suất 74% sau tinh chế Mặt khác, cho hợp chất 171 tác dụng với acetic anhydride pyridine nhiệt độ phòng 12 thu hợp chất 3,23-dioxo-2-acetate 173 với 13 hiệu suất 82% Thủy phân hợp chất 173 acid hydrochloric nhiệt độ phòng cho dẫn xuất 2-O-acetyl-3,23-dihydroxyasiatic acid (174) với hiệu suất cao (90%) Cấu trúc hợp chất 171-174 khẳng định thơng qua phân tích phổ MS NMR chúng Hợp chất 171: Hợp chất cho phổ 1H-NMR 13C-NMR tương tự phổ asiatic acid (1) ngoại trừ việc phổ 1H-NMR hợp chất 171 có thêm tín hiệu methyl singlet nhóm dimethyldioxo tạo thành xuất H (ppm): 1,42 (3H, s), 1,48 (3H, s), đồng thời tín hiệu cộng hưởng H-23a, H-23b dịch chuyển phía trường thấp so với xuất 3,50 ppm (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23a), 3,56 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-23b), so với 3,29 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,52 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b) ảnh hưởng nhóm dioxo tạo thành Đối với proton H-3α dịch chuyển phía trường thấp 0,04 ppm so với asiatic acid xuất H : 3,56 ppm Trong phổ 13C-NMR hợp chất 171 xuất thêm tín hiêu nguyên tử carbon bậc nhóm dioxo C : 100,72 ppm (C-31) Thơng qua hình thành ketal, tín hiệu C-3, C23 chuyển sang trường thấp xuất δC 83,03 73,66 ppm thay δC 69,68 66,31 asiatic acid (1) tín hiệu C-2 chuyển sang trường cao xuất δC 66,15 so với δC 78,17 ppm hợp chất Phổ NMR hợp chất 171 tương tự tài liệu tham khảo [94] Phù hợp với kết từ phổ 1H-NMR 13C-NMR, phổ khối ESI-MS ion âm hợp chất 171 cho pic ion giả phân tử m/z 527 [M-H]- ứng với CTPT C35H52O5 sơ đồ phản ứng Như phản ứng thực dự đốn Để có dẫn xuất succinate, cho có hoạt tính sinh học, hợp chất 171 phản ứng với anhydrit succinic DMAP TEA nhiệt độ phòng để tạo succinat 172 Hợp chất 172: Phổ 1H-NMR hợp chất 172 tương tự phổ hợp chất 171 có xuất thêm tín hiệu cộng hưởng phù hợp với nhóm succinate gắn vào, thể tín hiệu H (ppm): 2,57 - 2,71 (4H, m, H-35, H36) Trên phổ 13C-NMR hợp chất 172 có xuất thêm tín hiệu carbon cacboxylic C (ppm): 178,04 (C-37) 171,71 (C-34) nhóm succinat với tín hiệu nhóm methylene vùng trường cao trùng lặp với tín hiệu khung Phổ ESI-MS ion âm hợp chất 172 cho pic ion giả phân tử m/z 627 [M-H]- phù hợp với CTPT C37H56O8 Sơ đồ cho hợp chất 172 Điều chứng tỏ phản ứng tạo succinat thành công Hợp chất 173: Phổ 1H-NMR hợp chất 173 có thêm tín hiệu methyl singlet nhóm 2-O-acetyl xuất H (ppm): 2,01 so với phổ 1H-NMR hợp chất 171 Phổ 13C-NMR thêm tín hiệu cộng hưởng nhóm carbonyl C 170,62 ppm (CH3COO-) đồng thời xuất thêm tín hiệu –CH3 vùng 14 trường cao C (ppm): 21,15 Phổ khối ESI-MS ion âm m/z 569 [M-H]- phù hợp với CTPT C35H54O6 sơ đồ phản ứng 4.2 Hợp chất 174: Phổ 1H-NMR hợp chất 174 có thêm tín hiệu methyl singlet nhóm 2α-O-acetyl H (ppm): 2,07 (3H, s, CH3-CO) so với phổ 1H-NMR asiatic acid (1), đồng thời tín hiệu cộng hưởng H-2β bị dịch chuyển phía trường thấp xuất H (ppm): 5,03 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2β) asiatic acid ghi dung mơi H-2β xuất H (ppm): 3,71 (1H, dt, J = 4,5, 9,5 Hz, H-2), ΔH = 5,03-3,71= 1,32 ppm Phù hợp với dẫn xuất acetate C-2, phổ 13 C-NMR có xuất thêm tín hiệu thuộc nhóm acetyl C (ppm): 78,89 (C-2), 170,62 (CH3COO-) Phổ khối ESI-MS ion âm hợp chất 174 có chứa pic ion giả phân tử m/z 531 [M-H]- phù hợp với CTPT C32H50O6 Như cấu trúc hợp chất 174 khẳng định 4.3.2 Các dẫn xuất madecassic acid Sơ đồ 4.3: Tổng hợp dẫn xuất madecassic acid Các tác nhân điều kiện phản ứng: a) (CH3CO)2O, pyridine, rt., 12 h, 80%; b) oxalyl chloride, DCM, rt., 24 h, c) R1NH2, DCM, rt, 24 h; d) AcCl, DMAP, DCM, 2h, 75-80%; e) KOH, MeOH, rt, 16 h Madecassic acid (10) acetyl hóa với acetic anhydride pyridine nhiệt độ phòng 12 giờ, xử lý hỗn hợp sau phản ứng thường quy (xem phần thực nghiệm 3.2.2) cho madecassic acid 2,3,23-triacetate (175), hiệu suất 85% Trong phản ứng nhóm α-hydroxy vị trí C-6 khơng bị acetyl hóa che chắn khơng gian nhóm C-24, C-25, C-26 Điều chứng minh sau: Trong phổ 1H-NMR hợp chất 175 ta thấy xuất tín hiệu nhóm acetyl methyl đồng thời methyl proton C-2, C-3, C-23 dịch chuyển nhiều phía trường thấp xuất H (ppm): 3,72 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 5,01 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,24 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2) So với phổ madecassic acid (10) tín hiệu tương ứng xuất 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,76 (1H, dt, J = 4,5, 11,5 Hz, H-2), H-23b bị chồng lấp với tín 15 hiệu dung mơi methanol Trong tín hiệu H-6α hợp chất 175 không thay đổi xuất H (ppm): 4,34 (s), 10 tín hiệu 4,40 (br s) Điều chứng tỏ nhóm 6-β-OH khơng bị acetyl hóa Phù hợp với kết phổ hồng ngoại hợp chất 175 cho đỉnh hấp thụ nhóm hydroxy 3534 cm-1 bên cạnh đỉnh hấp thụ mạnh 1734 cm-1 1245 cm-1 nhóm acetate Phổ khối ion âm ESI-MS 175 cho pic ion giả phân tử m/z: 629 [M-H]- Hợp chất 175 cho tác dụng với oxalyl chloride DCM nhiệt độ phòng để tạo thành acid chloride 176 Hợp chất 176 không cần tách tinh chế cho phản ứng với amin tương ứng nhiệt độ phòng Sau xử lý hỗn hợp phản ứng phần thực nghiệm 3.3.2 thu amide tương ứng 177-185 Cấu trúc hóa học hợp chất 177-185 khẳng định thông qua phổ khối, phổ 1H- 13C-NMR chúng Hợp chất 177: Phổ 1H-NMR hợp chất 177 có chứa thêm tín hiệu mạch nhánh amide thơng qua tín hiệu cộng hưởng proton nhóm – CH2-OH H (ppm): 3,73 (4H, br s, H-2', -OH) tín hiệu proton nhóm –NCH2 3,53-3,56 (2H, br s, H-2'); tín hiệu khác trùng hợp với phổ 175 Ở phổ 13C-NMR hợp chất 177 có xuất thêm tín hiệu nhóm – CH2OH mạch nhánh C ppm = 61,53 (C-2'), 60,91 (C-2') Hợp chất 178: Trong phổ 1H-NMR hợp chất xuất tín hiệu nhóm –NH-CH2- H: (7,31 (t, J = 5,5 Hz, –NH) 7,39 (t, J = 5,5 Hz, –NH) đồng phân) bên cạnh tín hiệu 3,61 (2H, t, J = 6,0 Hz, H-3', -CH2-OH), 3,27-3,36 (1H, m, H-1', -CH2-NH-), 3,18-3,22 (1H, m, H-1', -CH2-NH-) Tín hiệu nhóm –CH2 cịn lại mạch nhánh xuất trùng với tín hiệu khung vùng trường cao Phổ 13C-NMR hợp chất xuất tín hiệu nhóm methylene xen lẫn với tín hiệu khác khung madecassic acid vùng trường cao tín hiệu -CH2-OH C: 61,52 (C-3') Phổ hồng ngoại hợp chất có chứa cụm tín hiệu mạnh nhóm –OH liên kết cầu hydro 3500 3379 cm-1 với đỉnh hấp thụ 1584 cm-1 Điều chứng tỏ hợp chất 178 tạo thành sơ đồ phản ứng Hợp chất 179: So với phổ 1H-NMR hợp chất 175 phổ 1H-NMR hợp chất 179 xuất thêm tín hiệu hai methyl doublet nhóm isopropyl chồng lấp với tín hiệu khung madecassic acid triacetate vùng H: 1,02 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,07 (3H, s) với tín hiệu khác mạch nhánh H: 5,59 (1H, d, J = 7,0 Hz, -NH), 3,84-3,88 (1H, m, H-1', -NHCH-(CH3)2) Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR hợp chất 179 có chứa tín hiệu cộng hưởng carbon tương ứng mạch nhánh Hợp chất 180: Phổ 1H-NMR hợp chất 180 thấy xuất thêm tín hiệu nhóm –NH2 amide H (ppm): 5,83 (1H, br s, -NH2) 6,34 (1H, br s, -NH2) so với hợp chất 175 Phổ hồng ngoại hợp chất 180 có đỉnh hấp thụ mạnh 3478 cm-1 (NH2) với đỉnh hấp thụ 1660 cm-1 (-CN) Trong phổ khối ESI-MS ion dương 16 hợp chất 180 có pic m/z 652 [M+Na]+ phù hợp với CTPT hợp chất 180 C36H55NO8 Như phản ứng xảy dự kiến Sơ đồ Hợp chất 181: Trong phổ 1H-NMR hợp chất 181 thấy xuất thêm tín hiệu cộng hưởng mạch nhánh H: 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,123,15 (2H, m, H-7’) Các tín hiệu proton lại mạch nhánh trùng lặp với proton khác khung vùng trường cao Phổ 13C-NMR chất có xuất tín hiệu nhóm –CH2 mạch nhánh chồng lấp với tín hiệu carbon khung Trong phổ khối ESI-MS ion dương thấy xuất mảnh ion m/z 743 [M+H]+ phù hợp với CTPT C43H70N2O7 hợp chất 181 Điều chứng minh phản ứng xảy dự kiến Hợp chất 182: Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất 182 có chứa pic ion giả phân tử m/z 771 [M+H]+ phù hợp với CTPT C45H74N2O8 hợp chất 182 Phù hợp với kết phổ 1H-NMR hợp chất 182 xuất cụm tín hiệu H: 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,20 (2H, m, H-9’) Các tín hiệu khác nhóm methylene mạch nhánh chồng lấp với tín hiệu khung madecassic acid vùng trường thấp Phổ 13C-NMR chất có xuất thêm tín hiệu nhóm methylene mạch nhánh xen lẫn vùng tín hiệu khung Như cấu trúc hợp chất 182 khẳng định Hợp chất 183: Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất 183 có chứa pic ion giả phân tử m/z 785 [M+H]+ phù hợp với CTPT C46H76N2O8 hợp chất 183 Phổ 1H-NMR chất có tín hiệu nhóm –CH2-NH2 H: 2,13-2,39 (1H, m, H-1’), 2,55-2,57 (1H, m, H-1’), 3,02-3,09 (2H, m, H-10’) Các tín hiệu proton nhóm CH2 khác chồng lấp với proton khung vùng trường cao Phổ 13C-NMR phù hợp với cấu trúc có chứa tín hiệu nhóm methylene xuất trùng với tín hiệu khác khung Điều chứng tỏ phản ứng tổng hợp 183 xảy dự kiến (Sơ đồ 3) Trên phổ 1H-NMR amide 184 quan sát thấy tín hiệu triplet δ (ppm): 5,41 (1H, t-like, -NH) đặc trưng cho liên kết amide Ngồi tín hiệu phổ 175, cịn quan sát thấy tín hiệu δ (ppm): 3,19-3,20 (1H, m, H-1’a), 3,29-3,30 (1H, m, H1’b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1’’) nhóm tín hiệu số tương tác đặc trưng cho độ dịch chuyển hóa học nhóm methylene glycine Trong phổ 13C-NMR có tín hiệu nhóm methylene gắn với -COOCH2CH3 mạch nhánh xuất C : 62,20 ppm (C-1’’) Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất cho pic ion giả phân tử m/z 716 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H61NO10 Trên phổ 1H-NMR amide 185 ngồi tín hiệu 175, quan sát thấy xuất tín hiệu singlet proton vòng imidazole δ (ppm): 7,04 (1H, s, H-4’), 7,52 (1H, s, H-2’), 8,24 (1H, s, H-5’) Phổ 13C-NMR có chứa tín hiệu mạch nhánh imidazole δ (ppm): 138,05 (C-2’), 129,87 (C-5’), 119,37 (C-4’) Hợp chất 186-191: Từ hợp chất 177-183 thủy phân dung dịch KOH MeOH nhiệt độ phòng 16 Xử lý hỗn hợp phản ứng 17 phần thực nghiệm 3.3.2 Sau tinh chế sản phẩm thu hợp chất 186-191 với hiệu suất từ 75-90% Cấu trúc hợp chất 186-191 khẳng định phân tích phổ IR, MS, NMR chúng Hợp chất 186: Phổ khối ESI-MS hợp chất 186 có pic ion giả phân tử m/z 592 [M+H]+ phù hợp với CTPT C34H57NO7 hợp chất 186 Phổ 1H-NMR hợp chất khơng thấy có mặt nhóm methyl singlet acetyl quanh vùng H khoảng ppm Thêm vào phổ 1H-NMR có pic proton gắn với carbon mang oxy vị trí C-2, C-3, C-23, C-6 xuất H (ppm): 4,00-4,04 (3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17 (1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H6), 4,31 (1H, br s, H-3) ngồi cịn thấy tín hiệu cộng hưởng nhóm –OH H 4,72 (2H, br s, -OH) 4,03 (1H, br s) bên cạnh tín hiệu xuất H từ 3,10–3,11 (2H, m, H-1’), 3,19-3,20 (2H, m, H-1’), 3,47-3,49 (4H, m, H2’) Phù hợp với kết trên, phổ 13C-NMR hợp chất khơng chứa tín hiệu cộng hưởng nhóm acetyl carbonyl quanh vùng 170 ppm tín hiệu acetyl methyl vùng trường cao Các kết phù hợp với sản phẩm tạo thành theo Sơ đồ Hợp chất 187: Trên phổ hồng ngoại (FT-IR) hợp chất 187 có chứa đỉnh hấp thụ mạnh nhóm –OH liên kết cầu hydro từ 3500-3379 cm-1, đỉnh hấp thụ nhóm chức acetate không xuất phổ IR Trong phổ 1HNMR không xuất tín hiệu methyl singlet H khoảng ppm đồng thời xuất tín hiệu 7,28 (t, J = 5,5 Hz, -NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH), tín hiệu H-2, H-3, H-23a H-23b dịch chuyển phía trường cao xuất H: 3,32-3,33 (H-3’ chồng lấp), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,593,63 (3H, m, H-3, H-23b, H-3’), 3,73-3,76 (1H, m, H-2) Điều chứng tỏ phản ứng thủy phân xảy hoàn toàn Hợp chất 188: Phổ 1H-NMR hợp chất 188 có chứa tín hiệu proton gắn với carbon mang oxi chuyển dịch phía trường cao xuất H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2) tín hiệu H-6α khơng thay đổi xuất H: 4,40 ppm (1H, s) Phổ 13C-NMR hợp chất khơng có tín hiệu cộng hưởng nhóm acetyl carbonyl vùng khoảng 170 ppm, nhóm acetyl methyl vùng trường cao Chứng tỏ hợp chất 188 tạo thành Phổ ESI-MS ion dương cho mảnh ion m/z 488 (100, [M+3-H2O]3+) Phổ hồng ngoại cho thấy cụm đỉnh hấp thụ nhóm hydroxyl liên kết cầu hydro vùng 3500-3245 cm-1 Như cấu trúc hợp chất khẳng định phù hợp với CTPT C30H49NO5 Hợp chất 189: Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất có pic ion giả phân tử m/z 617 (100, [M+H]+) phù hợp với CTPT C37H64N2O5 Phổ H-NMR có tín hiệu nhóm –NH2 H: 7,14 (t, J = 5,5 Hz, – NH) 7,20 (t, J = 5,5 Hz, – NH) tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy bị dịch 18 chuyển phía trường cao xuất H (ppm): 3,30 (H-3 trùng với dung môi) 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,74 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), tín hiệu methylene mạch nhánh xuất khoảng từ H (ppm): 2,95 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,12-3,19 (2H, m, H-7’) Phổ 13C-NMR hợp chất không chứa tín hiệu acetyl carbonyl vùng C khoảng 170 ppm, acetyl methyl vùng trường cao khoảng 17-19 ppm Điều chứng tỏ hợp chất 189 hình thành sơ đồ phản ứng Hợp chất 190: Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất 190 có pic ion giả phân tử m/z 645 ([M+H]+) phù hợp với CTPT C39H68N2O5 Phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy rõ ràng tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy xuất H (ppm): 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6) với tín hiệu mạch nhánh H: 2,76 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1’), 3,093,18 (2H, m, H-9’) Các tín hiệu nhóm methylene mạch nhánh cịn lại chồng lấp với tín hiệu khung Phổ 13C-NMR cho thấy khơng cịn tín hiệu acetyl carbonyl quanh vùng C: 170 ppm acetyl methyl quanh vùng từ 19.07-19.32 ppm Như hợp chất 190 tạo thành sơ đồ phản ứng Hợp chất 191: Phổ khối ESI-MS ion dương hợp chất 191 cho pic ion giả phân tử m/z 659 [M+H]+ phù hợp với CTPT C40H70N2O5 hợp chất 191 Trên phổ 1H-NMR hợp chất cho thấy tín hiệu proton gắn với carbon mang oxy H (ppm): 3,33 (H-3, trùng dung môi), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6) Các nhóm –CH2 mạch nhánh xuất H (ppm): 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1’), 3,09-3,19 (2H, m, H-10’) Các tín hiệu methylene cịn lại mạch nhánh xuất vùng trường cao chồng lấp với tín hiệu khung madecassic acid Phổ 13C-NMR cho kết phù hợp với cấu trúc hợp chất 191 Các liệu cấu trúc chứng tỏ phản ứng thủy phân 183 tạo thành 191 xảy hoàn tồn 4.4 Thử hoạt tính sinh học 4.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 4.4.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dẫn xuất asiatic acid Asiatic acid (1) phân lập từ rau má Việt Nam với 28 dẫn xuất tổng hợp được, gồm dẫn xuất triacetyl 145, hợp chất 147-160, 162-165 171-174 thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người KB (ung thư biểu mô, human epidermoid carcinoma), HepG2 (ung thư gan, hepatocellular carcinoma) and Lu (ung thư phổi, lung cancer), với đối chứng dương ellipticine Trừ dẫn xuất triacetyl 145, 167, 168, 171, tất 25 hợp chất tổng hợp hợp chất 19 Kết thử nghiệm hoạt tính khả quan Cụ thể sau: hợp chất (152, 154, 155, 157, 158, 159, 160, 167) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh (IC50 < µM) dịng tế bào thử nghiệm hợp chất, gồm 151, 152, 153, 155, 158, 159, 160 167 thể hoạt tính mạnh (IC50 < 10 µM) dịng tế bào thử nghiệm Các hợp chất có hoạt tính mạnh gồm 155, 160 167 với giá trị IC50 dòng tế bào KB, Hep G2 Lu 155: 1,31, 1,33, 0,85; 160: 1,11, 1,09, 1,27 167: 0,67, 0,82, 9,30 µM, giá trị IC50 tương ứng dẫn xuất 145 36,32, 39,77, 89,32 hợp chất đối chứng dương ellipticine 1,42, 1,83 2,15 µM Hai hợp chất (169 157) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào ung thư KB HepG2 với giá trị IC50 là: 154 (1,95 8,50 µM), 157 (0,70 0,70 µM) Một hợp chất (148) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào ung thư KB (IC50 8,74 µM) Các hợp chất cịn lại coi có hoạt tính trung bình, khơng mạnh khơng đáng kể (IC50 > 10 µM) Hai hợp chất 165 162 khơng thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào thử nghiệm nghiên cứu Các kết trình bày Bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro dẫn xuất tổng hợp asiatic acid Hợp chất IC50 (µM) KB HepG2 61,9 65,57 36,32 39,77 145 23,70 81,25 147 148 8,74 32,12 149 4,16 12,74 150 23,67 21,58 151 4,03 3,06 152 1,39 1,99 153 4,89 6,52 154 1,95 8,50 155 1,31 1,33 n.a n.a 156 157 0,70 0,70 158 1,78 1,54 159 1,34 1,17 1,42 1,83 Ellipticine *n.a: khơng có hoạt tính *n.d: khơng thử Hợp chất Lu 120,3 89,32 69,49 42,04 8,84 74,68 3,85 4,14 8,05 86,31 0,85 n.a 37,39 2,33 2,51 2,15 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 IC50 (µM) KB 1,11 n.d n.a 122,10 35,93 n.a n.a 0,67 3,51 29,18 38,93 33,86 94,62 20,46 50,94 HepG2 1,09 n.d n.a 186,80 192,22 n.a n.a 0,82 2,75 31,48 42,22 109,13 203,82 28,40 144,36 Lu 1,27 n.d n.a 103,02 80,40 n.a n.a 9,30 17,54 33,29 42,62 142,41 125,78 34,05 151,85 Các kết thử nghiệm hoạt tính nêu cho phép đưa nhận xét sau: 20 Trong hầu hết trường hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH hợp chất triacetyl asiatic acid (145) thành dẫn xuất amide làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ba dòng ung thư thử nghiệm (147-155, trừ hợp chất 156) Acetyl hóa nhóm OH NH mạch nhánh amide C-28 làm tăng hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (157-160) Thủy phân nhóm acetyl vị trí C-2α, C-3β, C-23 vịng A làm giảm mạnh hoạt tính gây độc tế bào ba dịng tế bào ung thư thử nghiệm (162-165) Chuyển hóa nhóm amide C-28 thành nhóm nitrile khơng làm tăng đáng kể hoạt tính gây độc tế bào (169 170) Khi nhóm 28-COOH giữ ngun việc chuyển hóa nhóm OH vịng A khơng có tác động đáng kể đến hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (171-174) Jing cs tổng hợp 15 dẫn xuất asiatic acid với amino acid amino acid ester xác định hoạt tính chống khối u hoạt tính chống tạo mạch (antiangiogenic activity) chúng Các tác giả dùng asiatic acid làm chất đầu, tiến hành phản ứng acetyl hóa với acetic anhydride/pyridine, sau cho phản ứng tiếp với oxalyl chloride, thu acyl chloride Phản ứng acyl chloride thu với amino acid methyl ester hydrochloride cho amide tương ứng với hiệu suất cao Cũng theo đường này, Li J-F cs (2015) điều chế loạt dẫn xuất aniline với 11-oxoasiatic acid 2,3,23-triacetyl-11-oxoasiatic acid với hiệu suất cao Các tác giả nhận thấy dẫn xuất 2,3,23-triacetyl asiatic acid amino acid methyl ester thu có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhiều so với hợp chất 2,3,23-trihydroxyl tương ứng so với thân asiatic acid Các kết thử nghiệm hoạt tính chúng tơi hồn tồn phù hợp với kết công bố 4.4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư dẫn xuất madecassic acid Trong tổng số 17 dẫn xuất madecassic acid tổng hợp thông qua việc tạo liên kết amide vị trí C-28 có 13 dẫn xuất thăm dị hoạt tính kháng ung thư ba dòng tế bào ung thư thực nghiệm là: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu-1) Ellipticine dùng làm chất đối chứng dương Các kết hoạt tính kháng tế bào ung thư tổng kết lại sau: Tất dẫn xuất thử nghiệm cho hoạt tính kháng một, hai ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm cao hơn, chí vài hợp chất cao gấp gần trăm lần madecassic acid (thể giá trị IC50) Cụ thể sau: Hợp chất 179 có giá trị IC50 1,28, 1,30 0,83 µM dòng tế bào ung thư KB, HepG2 Lu-1 so với giá trị IC50 hợp chất 175 (2α,3β,23triacetoxy madecassic acid) 43,81, 121,44 127,75 tương ứng Hợp chất 184 có giá trị IC50 0,85, 1,12 2,01 µM dòng tế bào ung thư tương ứng 21 Hợp chất 185 có giá trị IC50 1,25, 1,62, 2,01 µM dịng tế bào ung thư tương ứng Các kết cụ thể trình bày Bảng 4.4 Tương tự dẫn xuất asiatic acid, thủy phân nhóm chức acetate vị trí C-2, C-3, C-23 dẫn xuất 28-amide hoạt tính kháng tế bào ung thư thực nghiệm giảm so với dẫn xuất 2,3,23-acetyl Tuy nhiên, hoạt tính chúng cịn mạnh hoạt tính madecassic acid (trường hợp hợp chất 188, 190, 191) Kết luận chung: Vị trí C-28 C-2, C-3, C-23 madecassic acid có vai trị quan trọng hoạt tính kháng tế bào ung thư madecassic acid Các dẫn xuất 28-amide 2α,3β,23-triacetyl madecassic acid có hoạt tính mạnh madecassic acid nhiều Bảng 4.4: Hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất madecassic acid IC50 (µM) HepG2 178,77 Hợp chất 10 KB 157,30 175 43,81 121,44 Lu-1 160,52 127,75 177 n.d n.d n.d 178 79,46 186,32 186,32 179 1,28 1,30 0,83 180 5,41 10,68 11,92 181 3,13 4,00 3,92 182 2,66 3,06 3,70 183 1,70 2.07 2.61 184 0,85 1.12 2.01 185 1,25 1,62 2,01 186 n.d n.d n.d 187 n.d n.d n.d 188 48,11 53.20 44.81 189 33,25 175.80 190.94 190 14,75 74.07 15.90 191 7,31 8,00 5,86 Ellipticine 1,42 1,83 2,15 n.d: không thử Các kết thử nghiệm hoạt tính nêu cho phép đưa nhận xét sau: Trong hầu hết trường hợp, chuyển hóa nhóm 28-COOH thành amide làm tăng hoạt tính gây độc tế bào (hợp chất 179-185, trừ hợp chất 178) Thủy phân nhóm acetyl vịng A làm giảm mạnh hoạt tính gây độc tế bào (hợp chất 188-189) 22 Qua kết thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro dẫn xuất madecassic acid thấy: Trong 12 hợp chất tổng hợp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người KB (ung thư biểu mô, human epidermoid carcinoma), HepG2 (ung thư gan, hepatocellular carcinoma) Lu (ung thư phổi, lung cancer), chứng dương ellipticine số hợp chất thử nghiệm (179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 191) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào thử nghiệm KB, HepG2 Lu 11 hợp chất (179-185, 188-191) có hoạt tính mạnh rõ rệt so với madecassic acid (10) dẫn xuất 2,3,23-triacetyl (175) Acetyl hóa nhóm 2,3,23-trihydroxy hoặc/và acetyl hóa mạch nhánh amide C-28 làm tăng đáng kể hoạt tính so với hợp chất có nhóm OH hoặc/và NH2 tự tương ứng 4.4.2 Hoạt tính bảo vệ gan động vật thực nghiệm (in vivo) Asiatic acid chiết tách từ rau má thể tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây độc gan paracetamol Sự sai khác giá trị lô thử mẫu so với lô đối chứng bệnh lý có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) AST, ALT khối lượng gan chuột Kết trình bày bảng 4.5, 4.6, 4.7 sau: Bảng 4.5: Sự thay đổi số AST ( UI/ L) ALT (UI/L) lơ thí nghiệm Lô TN Lô Lô Lô Lô Lô Chỉ tiêu AST 84,25 ±9,53 508,25 ±6,99 272,83 ±15,31 320,50±14,97 337,00±19,44 ALT 47,52 ±11,77 325,25 ±4,92 201,35±8,42 232,75±12,45 242,50±13,38 Kết bảng 4.5 cho thấy asiatic acid liều 20 mg/kgP/ ngày liều mg/ kgP/ngày có tác dụng bảo vệ gan Sự sai khác so với lơ đối chứng có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Bảng 4.6: Khối lượng gan chuột (g/10g thể) lơ thí nghiệm Lơ Lô Lô Lô Lô 0,86±0,17 1,55±0,17 0,92±0,11 1,18±0,17 1,18±0,15 Kết bảng 4.6 cho thấy lô đối chứng bệnh lý (Lô 2) khối lượng gan lớn nhất.Ở lô sử dụng chất bảo vệ (lô 3, 4, 5) khối lượng gan nhỏ Sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng bệnh lý (P < 0,05) Kết kiểm tra trực quan tổn thương gan cho thấy: lô đối chứng bệnh lý gan nhạt màu, nhu mô gan to, rõ, lô khác gan bình thường, nhu mơ gan đồng Bảng 4.7: Hàm lượng MDA (nmol/ml đồng thể) gan chuột thí nghiệm Lô TN Lô Lô Lô Lô Lô MDA 304,77±6,66 420,31±27,36 330,27±7,45 397,78±24,78 400,69±8,15 Kết bảng 4.7 cho thấy hàm lượng MDA lơ có sử dụng chất bảo vệ thấp lô đối chứng bệnh lý 23 4.5 Nghiên cứu, dự đốn hoạt tính sinh học số dẫn xuất tổng hợp mơ hình tế bào (docking phân tử) SIRT (Sirtuin 1, NAD-dependent deacetylase sirtuin type 1) 17β-HSD1 (17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1) hai enzyme có liên quan đến số trình xúc tiến ung thư Khả tương tác lý thuyết chất tổng hợp với hai enzyme tính tốn phương pháp docking phân tử phân tích pharmacophore Kết docking phân tử cho thấy lượng liên kết chất với SIRT1 (ID: 4151) nằm khoảng từ -6,6 đến -8,5 Kcal/mol (asiatic acid: -7,7 Kcal/mol) lượng liên kết với 17β-HSD1 (ID: 3KLM) nằm khoảng từ -8,2 đến -10,1 Kcal/mol (asiatic acid: -8,6 Kcal/mol) Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tiến hành xác định hàm lượng hai hợp chất triterpene asiatic acid madecassic acid ba mẫu rau má thu Sơn Tây (Hà Nội), tỉnh Nam Định thành phố Hồ Chí Minh phương pháp sắc ký cột phương pháp HPLC Kết cho thấy hàm lượng hai triterpene mẫu rau má Sơn Tây cao nhất: asiatic acid 0,72%, madecassic acid 0,89% so với nguyên liệu khô Rau má thu Sơn Tây lựa chọn làm nguyên liệu để chiết suất asiatic madecassic acid phục vụ cho chuyển hóa hóa học Đã tổng hợp khẳng định cấu trúc 29 dẫn xuất asiatic acid thông qua việc tạo amide vị trí C-28 chuyển hóa nhóm hydroxy vị trí C-2, C-3, C-23 Trong số hợp chất tổng hợp có 25 hợp chất mới, chưa cơng bố tài liệu (chất 147-166, 169-170, 172-174) Từ madecassic acid tổng hợp 17 dẫn xuất thông qua việc tạo amide vị trí C-28 acetyl hóa nhóm hydroxy C-2, C-3 C-23 madecassic acid (chất 175-191) Cấu trúc tất dẫn xuất tổng hợp khẳng định thông qua phân tích phổ FT-IR, MS NMR chiều hai chiều chúng Đã thăm dò hoạt tính bảo vệ gan asiatic acid chiết tách từ rau má mơ hình gây độc gan chuột paracetamol Kết cho thấy asiatic acid có hoạt tính bảo vệ gan có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng Đã thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư ba dòng KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) Lu-1 (ung thư phổi) 28 dẫn xuất asiatic acid 14 dẫn xuất madecassic acid tổng hợp Hầu hết dẫn xuất tổng hợp có hoạt tính cao đáng kể so với hợp chất đầu Có nhiều hợp chất có hoạt tính cao hợp chất đầu từ 60 đến gần 100 lần ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm Kết hứa hẹn khả tìm hợp chất có hoạt tính kháng ung thư cao, góp phần phát triển ngành Hóa dược 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn xuất tổng hợp dòng tế bào khác động vật thực nghiệm 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran Thi, Thanh Nguyen Tuan, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of asiatic acid derivatives and their cytotoxic activity, 2017, thảo gởi Natural product research Loc Tran Van, Quynh Nhu Vo Thi, Chien Tran Van, Phuong Thao Tran Thi, Thu Ha Le Thi, Sung Tran Van, Synthesis of madecassic acid derivatives and their cytotoxic activity, 2017, thảo gởi Zeitschrift für Naturforschung B Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Lộc, Hoạt tính bảo vệ gan axit asiatic tách từ rau má Centella asiatica (L.) Urban, 2016, Tạp chí Hóa học, T 54 (5), 540-541 Vo Thi Quynh Nhu, Tran Thi Phuong Thao, Tran Van Sung, Tran Van Loc, Screening for the main triterpenic acids in Centella asiatica samples from north and south of Vietnam, Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 2016, T 54 (4), 416-418 Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Trần Văn Lộc, Trần Thị Phương Thảo, Nguyễn Tuấn Thành, Lê Thị Thu Hà, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học rau má Centella asiatica (L.) Urban thu hái thành phố Hồ Chí Minh, 2016, Tạp chí Hóa học, T 54 (3), 373-376 Trần Văn Lộc, Võ Thị Quỳnh Nhƣ, Lê Thị Thu Hà, Nguyễn Minh Thư, Trần Văn Sung , Tổng hợp số dẫn xuất axit madecassic phân lập từ rau má (Centella asiatica (L.) Urban) Việt Nam, 2014, Tạp chí Hóa học, T 52 (4), 508-513 25 ... phần hóa học rau má hoạt tính sinh học chúng 1.2 Một số kết nghiên cứu chiết tách triterpene triterpene glycoside từ rau má Centella asiatica (L.)Urban 1.3 Hoạt tính sinh học rau má 1.4 Hoạt tính. .. dãy dẫn xuất thăm dị hoạt tính kháng ung thư chất thu Từ lí trên, chúng tơi đề xuất đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học thăm dị hoạt tính sinh học triterpenoid từ rau má [Centella... (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)? ?? Nhiệm vụ luận án Nghiên cứu chiết tách tinh chế thành phần hóa học rau má Centella asiatica (L.) Urban thu số vùng Việt Nam Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic