Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hydroxycitric acid trong lá, vỏ quả bứa và ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẶNG QUANG VINH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HOÁ HYDROXYCITRIC ACID TRONG LÁ, VỎ QUẢ BỨA VÀ ỨNG DỤNG TẠO SẢN PHẨM GIẢM BÉO Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Đà Nẵng – Năm 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG PGS.TS NGUYỄN THƯỞNG Phản biện 1: Phản biện 2: PGS.TS.Trần Văn Thắng PGS.TS Lê Tự Hải Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Lan Luận án ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận án tiến sỹ chuyên ngành Hóa hữu họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 20 tháng năm 2012 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết ñề tài Trên giới việc nghiên cứu bứa ñã ñược trọng từ lâu, tính ñến ñã có hàng trăm công trình nghiên cứu bứa bao gồm lĩnh vực chiết tách, xác ñịnh thành phần hoá học hợp chất hữu cơ, ứng dụng công nghệ thực phẩm, công nghệ dược phẩm, ñặc biệt loại chế phẩm giảm béo Tuy nhiên, chưa có công trình công bố nghiên cứu chuyển hoá HCA ứng dụng giảm béo cách chi tiết Cây bứa loại dễ trồng, phát triển tốt, cho suất cao có hầu hết ñịa bàn Miền Trung, Tây Nguyên Người Việt Nam ta dùng bứa làm ăn, dùng vỏ bứa ñể trị số bệnh da dùng búp non nhai ăn ñể chữa bệnh ñộng thai Cho ñến nước ta chưa có nghiên cứu mang tính thành phần, tính chất, khả chuyển hoá ứng dụng, công nghệ khai thác hợp chất hoá học có bứa Đây vấn ñề ñáng ñược quan tâm nghiên cứu nhằm góp phần quy hoạch, khai thác, chế biến ứng dụng sản phẩm bứa cách có hiệu quả, khoa học Với lí trên, chọn ñề tài nghiên cứu: "Nghiên cứu chiết tách, chuyển hoá hydroxycitric acid vỏ bứa ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo" làm luận án tiến sĩ chuyên ngành hóa hữu Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh hàm lượng, tính chất, khả chuyển hoá hydroxycitric acid vỏ bứa - Tạo chế phẩm phụ gia thực phẩm khảo nghiệm giảm béo - Đóng góp thêm thông tin, tư liệu khoa học bứa Footer Page of 126 Header Page of 126 Đối tượng phạm vị nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Lá, vỏ bứa xã Hòa Liên, h Hòa Vang, TP ĐN * Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu chiết tách dung môi nước dung môi hữu cơ, ñịnh tính ñịnh lượng acid có trong lá, vỏ bứa - Tinh chế, phân tích tiêu mẫu thí nghiệm, sản phẩm - Phản ứng chuyển hoá HCA thành muối kim loại nhóm I II (K, Ca) - Đánh giá khả hoạt tính sinh học sản phẩm sau chuyển hoá Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu lý thuyết kết hợp với thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài Định danh tên khoa học bứa vùng nguyên liệu, xác ñịnh acid hữu lá, vỏ bứa Chuyển hóa HCA lá, vỏ bứa thành dạng muối bền có hoạt tính sinh học Cung cấp thông tin khả chống béo phì chế phẩm chuyển hóa Cập nhật thông tin lá, vỏ bứa hợp chất HCA Tạo sở ban ñầu ñể nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa HCA từ bứa Việt Nam với quy mô công nghiệp ñể sản xuất thực phẩm chức giảm cân, thúc ñẩy phát triển ngành dược liệu nước Cấu trúc luận án Luận án gồm phần mở ñầu, kết luận kiến nghị, công trình ñã công bố, tài liệu tham khảo, phụ lục 03 chương CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 MỘT SỐ LOÀI BỨA TẠI VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI Footer Page of 126 Header Page of 126 1.1.1 Đặc ñiểm, phân bố bứa Ở nước ta có số loài bứa như: Bứa - Garcinia oblongifolia Champ Ex Benth (hình 1.1); Bứa - Garcinia harmandii Pierre; Bứa nhà - Garcinia cochinchinensis (Lour) Choisy; Tai Hình 1.1 Quả, lá, hoa bứa chua - Garcinia pedunculata Roxb (G cowa Roxb); Bứa ñồng - Garcinia schomburgkiana Pierre; Bứa lửa - Garcinaia fusca Pierre; Bứa Scheffer - Garcinaia schefferi Pierre; Bứa Planchon - Garcinaia planchonii Pierre; Bứa mủ vàng Garcinia xanthochymus Hook.f.ex J Anderson Một số loại bứa khác Ấn Độ như: Garcinia cambogia; Garcinia indica; Garcinia atroViridis 1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HYDROXYCITRIC ACID (HCA), CÁC MUỐI CỦA HCA TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 1.2.1 Kết nghiên cứu giới 1.2.1.1 Nguồn gốc (-)-HCA (-)-HCA ñược tìm thấy vỏ vài loài bứa, bao gồm tai chua (G cowa), G cambogia, G indica, G atroViridis Các loài mọc nhiều lục ñịa Ấn ñộ phía tây Sri Lanka 1.2.1.2 Hoá học (-)-HCA Sự khám phá (-)-HCA: Kurian Pandiya (1931); Screenivasan Venkataraman (1959) nhầm lẫn cho acid G cambogia tartaric acid citric acid Lewis cộng (1964) ñã xác ñịnh xác acid G cambogia dihydroxy tri-cacboxylic acid hay hydroxycitric acid Footer Page of 126 Header Page of 126 COOH COOH HO C H HO C COOH H C COOH H C OH HOOC C OH C COOH H H H (-)-hydroxycitric acid (I) (+)-hydroxycitric acid (II) COOH COOH HO C H HOOC C OH H C COOH H (+)-allo-hydroxycitric acid (III) OH H C HO C COOH H C COOH H (-)-allo-hydroxycitric acid (IV) Hình 1.8 Cấu trúc ñồng phân hydroxycitric acid Chiết tách: Lewis Neelakantan (1965) ñã chiết tách (-)-HCA từ vỏ G cambogia khô sử dụng phương pháp chưng ninh nồi áp suất (10 psi (lb/in.2) thời gian 15 phút với dung môi nước Moffett cộng (1996) phát triển chiết tách (-)-HCA nước, dịch chiết cho qua cột trao ñổi anion ñể hấp thụ (-)- HCA, ñược rửa với natri/kali hiñroxit ñể thu (-)-HCA Bhabani S Jena cộng (2002) ñã tiến hành chiết acid vỏ G cowa phương pháp chiết soxhlet với dung môi axeton metanol Nhận xét: Các phương pháp chiết tách ñược công bố nguyên tắc chung, chưa có nghiên cứu chi tiết trình chiết tách theo thời gian, tỷ lệ dung môi (R/L), ñiều kiện chiết tách khác Về phương pháp chiết tách dùng hai phương pháp gồm: Phương pháp chiết chưng ninh nồi áp suất với dung môi nước phương pháp chiết soxhlet với dung môi hữu axeton, metanol Hoá học lập thể: HCA có 02 trung tâm bất ñối; vậy, tồn 02 cặp ñồng phân lập thể 04 ñồng phân khác (Hình 1.8) Martius Maue ñã tổng hợp thành công 04 ñồng phân lập thể hydroxycitrate Glusker cộng ñã báo cáo cấu trúc cấu hình xác canxi hydroxycitrate (-)-HCA lacton Footer Page of 126 Header Page of 126 chụp X-quang tinh thể Stallings cộng báo cáo cấu trúc tinh thể muối etylen di amin cặp ñồng phân lập thể hydroxycitrate Tính chất (-)-HCA lacton: Đương lượng lacton 69, xác ñịnh chuẩn ñộ kiềm phân tích muối bạc Cấu trúc (-)-HCA lacton ñã ñược chứng minh phổ IR H-NMR (-)- HCA lacton thể rõ dải sóng phổ IR 3200, 1760, 1680 cm-1 Quang phổ 1H-NMR (-)-HCA lacton cho thấy 02 proton γ-cacbon, cho AB quartet δ 2,53 δ 2,74 với J = 17,1Hz, 01 proton α-cacbon cho thấy singlet δ 5,15 Định lượng (-)-HCA: Lowenstein Brunengraber (1981) ñã xác ñịnh lượng hydroxycitrate chứa G cambogia phương pháp sắt ký khí Jayaprakasha Sakariah (1998, 2000, 2002) ñã phát triển HPLC ñể xác ñịnh acid hữu G cambogia, mẫu chiết thương mại G cambogia, lá, vỏ G indica 1.2.1.3 Các muối kim loại (-)-HCA 1.2.1.3.1 Các loại muối kim loại (-)-HCA Ibnusaud cộng ñã tạo muối natri hydroxycitrate cách cho dịch chiết vỏ G cambogia tác dụng với NaOH 800C Singh cộng ñiều chế muối canxi (-)-HCA Ganga Raju ñã ñiều chế muối canxi kali (-)-HCA hay muối hai kim loại natri (-)-HCA hiệu chất bổ sung ăn kiêng sản phẩm thức ăn ñể giảm cân nặng 1.2.1.3.2 Nghiên cứu tạo muối kali hydroxycitrate Majeed cộng cách thức ñể ñiều chế muối HCK bền vững có hoạt tính sinh học 1.2.1.3.4 Nghiên cứu tạo muối canxi hydroxycitrate Footer Page of 126 Header Page of 126 Bhaskaran Mehta ñã công bố phương pháp hình thành muối canxi kali HCA hỗn hợp chúng 1.2.1.3.5 Một số nghiên cứu tạo muối kim loại (-)-HCA khác Balasubramanyam cộng ñưa phương pháp tạo thành cặp muối kim loại hòa tan nhóm IA IIA (-)-HCA Gokaraju cộng công bố dạng muối hai kim loại (-)-HCA với kim loại nhóm II Gokaraju cộng công bố công thức muối ba kim loại (-)-HCA Samuel cộng ñã nghiên cứu muối phức tạp ba, bốn năm kim loại (-)-HCA, thành phần cấu tạo phương pháp tổng hợp chúng, với muối chứa kim loại khác ñược lựa chọn từ kẽm, magie, natri, kali canxi Nhận xét: Các tài liệu chuyển hoá ñã công bố ñưa quy trình chung (quy trình nguyên tắt) mà chưa ñưa ñiều kiện phản ứng cách chi tiết 1.2.1.4 Hoá sinh (-)-HCA Sự ức chế enzyme chia tách muối citrate (-)-HCA Enzyme chia tách citrate, ATP citrate lyase (ATP citrate oxaloaxetat lyase), xúc tác việc chia tách ngoại ty thể citrate thành oxaloaxetat axetyl-CoA Watson cộng ñã tìm thấy ức chế mạnh mẽ ATP citrate oxaloaxetat lyase (-)-HCA enzyme tinh chế từ gan chuột Cheema – Dhadli tìm thấy chế enzyme (-)-HCA tự (Ki = µM) lacton (-)-HCA (Ki = 50 – 100 µM) Sullivan cộng Stallings cộng ñã quan sát thấy ñồng phân HCA (-)-HCA chất gây ức chế tiềm ATP citrate lyase 1.2.1.5 Tác dụng (-)-HCA muối kim loại Clouatre cộng khẳng ñịnh muối Ca, Mg, K Na (-)-HCA có hiệu việc tăng chuyển hóa glucose Footer Page of 126 Header Page of 126 thể, giảm nồng ñộ ñường cao máu bệnh nhân bệnh tiểu ñường Gokaraju cộng mô tả việc sử dụng muối canxi, kẽm (-)-HCA nguồn bổ sung dinh dưỡng ăn uống Shrivastava cộng mô tả dược tính muối Mg (-)-HCA ñiều trị bệnh Nhận xét: Trên ñây có nhiều công trình công bố, chưa có công trình công bố cách chi tiết tác dụng dẫn xuất HCA ñộng vật Và chưa có công trình nghiên cứu ứng dụng trực tiếp HCA tự nhiên mà không cần phải chuyển hoá 1.2.2 Kết nghiên cứu nước Ở nước ta có số công trình nghiên cứu chiết tách xanthon dẫn xuất phenol từ số loài bứa: bứa Delpy; vỏ bứa cọng (Garcinia pedunculata); bứa núi; vỏ bứa Lanessan, Nguyễn Đình Hiệp ñã nghiên cứu Benzophenon có khả ức chế tế bào ung thư từ vỏ trái bứa nam (Garcinia cochinchinense) Năm 2004, Đỗ Thị Tuyên cộng ñã nghiên cứu ảnh hưởng cao chiết từ bứa (Garcinia cambogia) lên enzyme chống oxy hoá gan chuột bị nhiễm ñộc CCl4 mãn tính Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu acid hữu từ bứa ứng dụng 1.2.3 Nhận xét chung Trên giới việc nghiên cứu bứa ñã ñược trọng từ lâu, tính ñến ñã có hàng trăm công trình nghiên cứu bứa bao gồm lĩnh vực chiết tách, xác ñịnh thành phần hoá học hợp chất hữu cơ, ứng dụng công nghệ thực phẩm, công nghệ dược phẩm, ñặc biệt loại chế phẩm giảm béo Tuy nhiên, chưa có công trình công bố nghiên cứu chuyển hoá HCA cách chi Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 10 tiết Cho ñến nước ta chưa có nghiên cứu mang tính thành phần, tính chất, khả chuyển hoá ứng dụng, công nghệ khai thác hợp chất hoá học có bứa Đây vấn ñề ñáng ñược quan tâm nghiên cứu nhằm góp phần quy hoạch, khai thác, chế biến ứng dụng sản phẩm bứa cách có hiệu quả, khoa học CHƯƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Lá, Bứa ñược hái từ xã Hoà Liên – h Hoà Vang – TP ĐN 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp vật lý Nguyên liệu ñược kiểm tra ñộ ẩm, hàm lượng tro phương pháp trọng lượng Các chế phẩm HCCa, HCK sau chuyển hoá ñược kiểm tra bằng: phổ hồng ngoại (IR); sắc ký lỏng cao áp; quang phổ hấp thụ nguyên tử; cộng hưởng từ hạt nhân; ño ñộ quay cực; phổ khối lượng 2.2.2 Phương pháp hoá lý Sử dụng 03 phương pháp chiết tách ñể chiết tách HCA từ lá, vỏ bứa gồm: chiết chưng ninh nồi áp suất; chiết soxlet chiết lượng vi sóng Tổng lượng acid dịch chiết ñược xác ñịnh phương pháp chuẩn ñộ Dùng phương pháp chuyển hoá ñể tạo muối kali canxi (-)-HCA chiết tách từ lá, vỏ bứa Footer Page 10 of 126 Header Page 14 of 126 14 hàm lượng HCA vỏ bứa cao (15,17015,270%), Garcina cambogia (16-18%), Garcina india (10,2712,74%), Garcina cowa (10,209-12,695%) Kết bứa tươi lượng HCA cho kết trung bình (2,853-2,878%) so với kết Garcina india (4,10-4,64%), Garcina cowa (1,672%) không tìm thấy lượng citric acid Điều kiện sắc ký ñể xác ñịnh HCA máy HPLC Merck Hitachi D7000: cột sắc ký Lichrospher RP18 5µm x 4,6 mm x 250 mm; ñetectơ D7240 Autosampler D7200, pha ñộng dung dịch acid photphoric 0,1 % với tốc ñộ dòng 1,0 ml/phút Acid chủ yếu ñược tìm thấy lá, vỏ bứa HPLC HCA, ñược thể sắc ký ñồ phụ lục Trên sắc ký ñồ, HCA cho pic ñơn tất mẫu chiết Xác ñịnh pic HCA dựa vào pic acid HCA chuẩn xuất thời gian lưu 3,802 phút Thời gian lưu HCA ñược tìm thấy tất mẫu 3,8 ± 0,14 phút 3.2.4 Kết luận Từ kết nghiên cứu nhận xét sau: Đã xác ñịnh ñược tổng lượng acid hữu acid hữu riêng biệt dịch chiết lá, vỏ bứa HCA acid hữu chủ yếu ñược tìm thấy dịch chiết lá, vỏ bứa Lượng HCA xác ñịnh ñược từ vỏ bứa Việt Nam cao (15,17-15,27%), cao 02 loài bứa Ấn Độ G indica G cowa Thay ñổi dung môi phương pháp chiết khác nhau, dung môi nước cho lượng HCA cao (15,28%), axeton (12,99%), metanol (9,50%) Phương pháp chiết lượng vi sóng với dung môi nước cho lượng HCA cao (15,28%) Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 15 3.3 NGHÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUY TRÌNH CHIẾT ACID HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA 3.3.1 Chiết tách lượng vi sóng Kết khảo sát trình chiết tách theo thời gian, cấp ñộ máy tỷ lệ rắn lỏng cho thấy: thời gian chiết xuất hiệu 25 phút; cấp ñộ máy thích hợp cấp (400W); tỷ lệ rắn lỏng thích hợp khoảng 10 g chất rắn 150 ml dung môi Tổng lượng acid ()- HCA chiết ñược cao ñiều kiện 18,59% 15,28% 3.3.2 Chiết tách chiết soxhlet với dung môi axeton metanol Chiết dung môi axeton cho kết tốt chiết dung môi metanol Khi tăng thời gian chiết tổng lượng acid tăng lên với thời gian chiết ñạt cho kết cao nhất, tiếp tục tăng thời gian chiết lượng acid tăng không ñáng kể, không tăng Tổng lượng acid thu ñược sử dụng dung môi axeton (13,71%), dung môi metanol (10,40%), với thời gian chiết 3.3.3 Chiết tách nồi áp suất với dung môi nước 3.3.3.1 Kết chiết xuất acid bứa: Với phương pháp chưng ninh bứa tươi nồi áp suất dung môi nước cho kết tốt thời gian chiết thể tích dung môi chiết 150 ml, tổng lượng acid thu ñược (2,258%) 3.3.3.2 Kết chiết xuất acid vỏ bứa khô: Với phương pháp chưng ninh nồi áp suất ñiều kiện 0,15MPa nhiệt ñộ 1270C, thời gian chiết tối ưu 90 phút tỉ lệ rắn/lỏng tối ưu 10g/200ml nước, tổng lượng acid (17,16%) 3.3.4 Kết luận Khảo sát 03 phương pháp chiết tách, kết phương pháp chiết sử dụng lượng vi sóng với thời gian chiết ngắn (25 phút) Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 16 cho kết HCA cao (15,28%) Do thời gian chiết ngắn nên phương pháp tiết kiệm lượng, ñây ưu ñiểm bật phương pháp so với phương pháp mà tác giả nước ñã công bố Điều kiện tối ưu ñể chiết HCA lớn lượng vi sóng là: thời gian chiết 25 phút, tỷ lệ rắn lỏng 150ml nước/10gam vỏ bứa khô, công suất lò vi sóng 400W Tổng lượng acid hữu chiết ñược 18,59%, HCA 15,28% Trong phương pháp chiết chưng ninh nồi áp suất yếu tố thời gian chiết, tỷ lệ rắn lỏng ñều ảnh hưởng ñến hiệu suất chiết tổng lượng acid Với thời gian chiết giờ, chiết với dung môi metanol lượng acid chiết ñược 10,49%, chiết với dung môi axeton lượng acid chiết ñược 13,71% 3.4 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN HOÁ TẠO MUỐI CỦA HCA 3.4.1 Tạo muối kali HCA 3.4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng lượng KOH 40% ñến trình chuyển hoá tạo muối kali HCA Điều kiện chuyển hóa tạo muối kali cho sản phẩm sấy khô sử dụng 7,0–10,0ml KOH ñậm ñặc (40%)/dịch chiết 100g vỏ bứa, hàm lượng HCK muối ñiều chế xác ñịnh HPLC 77,021% 3.4.1.2 Tinh chế muối HCK Rửa tinh chế muối HCK thô cách: tăng tỷ lệ cồn từ 60% ÷ 100% nước giảm 40% ÷ 0% Hàm lượng HCK muối sau tinh chế xác ñịnh HPLC 99,221% (các kết kiểm tra chất lượng, cấu trúc HCK sau tinh chế thể mục 3.5) Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 17 3.4.1.3 Hiệu suất tạo muối HCK Khối lượng muối HCK dạng rắn tinh thể tạo thành trung bình 13,523g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối 85,06 – 87,02% 3.4.2 Tạo muối canxi HCA 3.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH ñến trình chuyển hoá tạo muối canxi HCA Dịch chiết sau làm ñược trung hoà acid cách cho thêm dung dịch CaCl2 Dung dịch thu ñược khuấy trộn khoảng 30–120 phút Khi thêm CaCl2 vào, lúc ñầu xuất kết tủa trắng, sau xuất ngày dày ñặc tạo thành bùn, pH hỗn hợp bùn thích hợp từ 9,5 ñến 11 Sử dụng dung dịch NaOH ñể chỉnh ñộ pH Phần kết tủa không tan muối HCCa, phần muối ñược sấy khô tủ sấy thời gian 24 giờ, muối HCCa có màu trắng xám 3.4.2.2 Hiệu suất tạo muối Khối lượng muối HCCa dạng rắn tạo thành trung bình 11,207 g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối 83,97 – 88,83% 3.4.3 Kết luận Đã xác ñịnh ñược ñiều kiện quy trình tạo muối HCK, HCCa Điều kiện thích hợp tạo muối HCK 7,0 – 10,0ml KOH ñậm ñặc (40%)/ dịch chiết từ 100g vỏ bứa khô ñiều kiện thích hợp tạo muối HCCa pH từ 9,5-11, pH ñược ñiều chỉnh dung dịch NaOH 10% Hệ dung môi thích hợp ñể tinh chế muối HCK hỗn hợp cồn/nước, nồng ñộ cồn tăng từ 60% ñến cồn tuyệt ñối Khối lượng muối HCK dạng rắn tinh thể tạo thành ổn ñịnh trung bình 13,523g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối 85,06 – 87,02% Khối lượng muối HCCa dạng rắn tạo thành ổn ñịnh trung bình Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 18 11,207 g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối 83,97 – 88,83% 3.5 KIỂM TRA CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT, HÀM LƯƠNG KIM LOẠI NẶNG VÀ VI SINH VẬT CỦA CHẾ PHẨM MUỐI HCCa, HCK 3.5.1 Kiểm tra sản phẩm muối HCK, HCCa HPLC Muối HCK a b Hình 3.18 Sắc kí ñồ HPLC sản phẩm muối HCK trước (a) sau tinh chế (b) Kết chạy HPLC muối HCK tạo thành ta thu ñược 04 pic với thời gian lưu khác (hình 3.18a), pic có thời gian lưu gần với thời gian lưu HCA chuẩn cường ñộ lớn nhất, xuất pic có thời gian lưu 3,70 phút gần với thời gian lưu HCA chuẩn 3,77 phút có diện tích lớn chiếm 77,021% Tuy nhiên, muối HCK lẫn nhiều tạp chất thể 03 pic lại ứng với thời gian lưu 2,25; 2,82 7,11 Ta tiến hành tinh chế muối HCK cách rửa với hỗn hợp cồn nước với tỷ lệ khác Kết tạp chất giảm, pic có thời gian lưu 7,11 biến 02 pic tạp chất có diện tích nhỏ pic có thời gian lưu 2,33 2,82 (hình 3.18b) Pic thể HCK có diện tích tăng ñạt ñộ tinh khiết 99,221% Hàm lượng muối HCK tạo ñược có ñộ tinh khiết cao so với kết công bố Majeed cộng (92,840%), thời gian lưu trùng khớp (3,722phút) Muối HCCa Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 19 Kết chạy HPLC muối HCCa tạo thành ta thu ñược 03 pic với thời gian lưu khác (hình 3.19a), pic có thời gian lưu gần với thời gian lưu HCA chuẩn (xuất pic có thời gian lưu 3,73 phút gần với thời gian lưu HCA chuẩn 3,77 phút) cường ñộ lớn có diện tích lớn chiếm 51,187% Tuy nhiên, muối HCCa lẫn nhiều tạp chất thể 02 pic lại ứng với thời gian lưu 2,23 2,78 Ta tiến hành tinh chế muối HCCa cách rửa nhiều lần với nước cất Kết tạp chất giảm, pic tạp chất có diện tích nhỏ pic có thời gian lưu 2,19 2,79 (hình 3.19b) Pic thể HCCa có diện tích tăng ñạt ñộ tinh khiết 97,077% a b Hình 3.19 Sắc kí ñồ HPLC sản phẩm muối HCCa trước (a) sau tinh chế (b) 3.5.2 Kiểm tra sản phẩm muối HCK, HCCa phổ IR Kết kiểm tra phổ IR muối HCK, HCCa HCCa chuẩn hình dáng tương tự (phổ IR muối HCCa HCCa chuẩn ñộ trùng lặp 98,69%) Như vậy, sơ kết luận muối ñược tạo thành có cấu trúc tương tự với HCCa chuẩn Bảng 3.25: Kết chụp phổ IR muối HCK, HCCa Pic ñặc trưng Muối HCCa chuẩn Muối HCK Muối HCCa Phổ dao ñộng nhóm -OH 3400,11 cm-1 3376,22 cm-1 3310 cm-1 Phổ dao ñộng nhóm -C=O 1599,04 cm-1 1592,53 cm-1 1582 cm-1 Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 20 3.5.4 Kiểm tra cấu trúc muối HCCa, HCK phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1' COO Ca OOC C C HO HO H H Muối HCCa C C COO COO HO HO 13 Ca Ca Phổ C-NMR muối HCCa C C COO COO Ha Ha Hb Hb chuẩn HCCa ñiều chế ñược thể 13 Hình 3.20 Cấu trúc muối HCCa hình 3.21a, 3.21b Phổ C-NMR HCCa chuẩn hình 3.22a có 03 pic 39,920; 74,925; 77,716 kết tương ứng methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon (C-1, 1’) cacbon bậc (C-3, 3’) Các pic 162,862; 163,158; 174,158 cacbonyl cacbon (C-2, 2’; C-4, 4’ C-6, 6’) 03 nhóm cacboxylat muối HCCa chuẩn Đối với phổ 13C-NMR HCCa ñiều chế hình 3.21b có pic tương tự phổ 13CNMR HCCa chuẩn, cụ thể có 03 pic 39,921; 75,048; 77,607 kết tương ứng methylene cacbon (C-5, 5’), methine cacbon (C-1, 1’) cacbon bậc (C-3, 3’) Ở phổ 13C-NMR HCCa ñiều chế xuất 01 pic 162,527 cacbonyl cacbon (C-2, 2’; C-4, 4’ C-6, 6’) Điều giải thích ñộ phân giải máy nồng ñộ HCCa ñiều chế cao nên pic 163,158 bị trùng với pic 162,527; pic 174,158 có vùng nhô lên máy không báo kết 2' a 3' 4' 5' 6' bb Hình 3.21 Phổ 13C-NMR muối HCCa Phổ 1H-NMR muối HCCa chuẩn HCCa ñiều chế ñược thể hình 3.22a, 3.22b Tín hiệu phổ 1H-NMR proton methylen (Ha-5, 5’ Hb-5, 5’) xuất 2,95 3,02 Pic singlet 4,3 thể proton nhóm methine (H-1 H-1’) Phổ 1H-NMR HCCa ñiều chế Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 02 pic 2,9 3,0 pic siglet tù a b Hình 3.22 Phổ 1H-NMR muối HCCa Từ kết kiểm tra phổ 13C-NMR 1HNMR cho thấy sản phẩm muối HCCa ñiều chế COOK HO C có công thức cấu tạo phù hợp với công thức muối chuẩn hình 3.20 Muối HCK Hình 3.24 Phổ 13C-NMR muối HCK HO C Ha C H COOK COOK Hb Hình 3.23 Cấu trúc muối HCK Hình 3.25 Phổ 1H-NMR muối HCK Phổ 13C-NMR muối HCK hình 3.24 có 03 pic 42,249; 76,416; 78,859 kết tương ứng methylene cacbon (C5), methine cacbon (C-1) cacbon bậc (C-3) muối HCK Các pic 177,951; 180,073 cacbonyl cacbon (C-2; C-4 C6) 03 nhóm cacboxylat muối HCK Phổ 1H-NMR muối HCK ñược thể hình 3.25 Tín hiệu phổ 1H-NMR proton methylen (Ha-5, Hb-5) xuất 2,698 2,794 Pic singlet 4,699 thể proton nhóm methine (H-1) Từ kết kiểm tra phổ 13C-NMR 1H-NMR cho thấy sản Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 phẩm muối HCK ñiều chế có công thức cấu tạo phù hợp với công thức muối kali dự ñoán ban ñầu hình 3.23 3.5.4 Kiểm tra cấu trúc muối HCCa, HCK phổ khối lượng Kết phổ khối lượng muối HCCa chuẩn, HCCa HCK ñiều chế phân mảnh phức tạp chưa thể giải thích ñược Tuy nhiên, theo nguyên tắt chụp bàn tay ta thấy phổ khối lượng muối HCCa chuẩn HCCa ñiều chế hoàn toàn giống Một số mảnh muối HCK ñiều chế giống với muối HCCa chuẩn 3.5.5 Kiểm tra hàm lượng kali, canxi kim loại nặng sản phẩm muối HCK, HCCa Kết kiểm tra thành phần kim loại nặng sản phẩm muối HCK, HCCa ñạt tiêu chuẩn lương thực, thực phẩm Việt Nam Vì vậy, ứng dụng sản phẩm HCK, HCCa ñược tạo thành ñể làm thực phẩm Hàm lượng kali sản phẩm HCK thành phần kim loại chính, 320.000 mg/kg (chiếm 32%) Hàm lượng canxi sản phẩm HCCa thành phần kim loại chính, 201.000 mg/kg (tương ñương 20,1%) - Kết kiểm tra hàm lượng canxi muối HCCa ñiều chế (20,1%) phù hợp với hàm lượng canxi muối chuẩn (19,5%), phù hợp với công thức phân tử hình 3.20 Kết hàm lượng canxi (20,1%) cao so với kết công bố Bhasharan cộng (17,22%) - Kết kiểm tra hàm lượng kali muối HCK ñiều chế (32%) phù hợp với hàm lượng kali tính toán theo lý thiết dựa vào công thức (117,295/322,394 ≈ 36,29%) hình 3.23 Ngoài ra, so sánh với kết công bố Majeed cộng hàm lượng kali muối tạo thành phải không nhỏ 30% khối lượng khan, kết hàm lượng kali (32%) hoàn toàn phù hợp Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 23 3.5.6 Kiểm tra tiêu vi sinh vật muối HCK HCCa ñiều chế Kết phân tích tiêu vi sinh (tổng vi khuẩn hiếu khí, E coli, tổng bào tử nấm men - mốc) cho thấy mẫu muối HCK, HCCa thỏa mãn Tiêu chuẩn vi sinh cho phép thực phẩm Bộ Y tế Do ñó, ứng dụng sản phẩm HCK, HCCa ñược tạo thành ñể làm thực phẩm 3.5.7 Kiểm tra ñộ quay cực muối HCK HCCa Độ quay cực muối HCK trung bình (- 21,47o), kết phù hợp với công bố Majeed cộng (-18o÷-25o) muối HCCa (- 19,94o) 3.5.8 Kết luận Chế phẩm chuyển hóa tạo muối kali HCA kali (-)hydroxycitrate Chế phẩm chuyển hóa tạo muối Canxi HCA canxi (-)-hydroxycitrate Các muối tạo thành hoàn toàn tương thích với lí thuyết Hàm lượng kim loại nặng vi sinh vật chế phẩm HCK HCCa ñảm bảo ñạt tiêu chuẩn Việt Nam giới ñối với thực phẩm Chế phẩm HCK HCCa có ñộ tinh khiết cao sử dụng ñể làm thực phẩm chức chất chống béo phì 3.6 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SẢN PHẨM MUỐI HCCa VÀ HCK TRÊN CHUỘT 3.6.1 Độc tính cấp: LD50 HCK 8,717g/kg thể trọng chuột Với liều 23g HCCa/kg thể trọng chuột không xác ñịnh ñược LD50, HCCa có ñộ an toàn cao 3.6.2 Tác dụng hạ lipid + HCK liều 700 mg/kg thể trọng chuột có tác dụng ức chế tăng cholesterol toàn phần triglycerid gây Triton WR 1339 chuột nhắt trắng Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 24 + HCCa cho chuột uống với liều 700 mg 1500 mg/kg thể trọng chuột ñã tác dụng ức chế tăng cholesterol toàn phần triglycerid gây Triton WR 1339 chuột nhắt trắng 3.6.3 Tác dụng tăng lực: + HCK liều 700 mg/kg thể trọng chuột, uống ngày liên tục, có tác dụng làm tăng thời gian bơi chuột 36,9% (P > 0,05) 70,4% (P < 0,05) mô hình chuột bơi cưỡng + HCCa liều 1500 mg/kg thể trọng chuột, uống ngày liên tục, có tác dụng làm tăng thời gian bơi chuột 19,0% (P > 0,05) 39,3% (P > 0,05) mô hình chuột bơi cưỡng 3.6.4 Tác dụng chống béo phì - HCK liều 700 mg/kg thể trọng chuột, uống tuần có tác dụng làm giảm trọng lượng thể trọng lượng mô mỡ chuột ñược gây béo phì 10 tuần cách có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, HCK tác dụng làm giảm trọng lượng gan chuột - HCCa liều 1500 mg/kg thể trọng chuột, uống tuần làm giảm trọng lượng thể 5,26% (P>0,05), giảm trọng lượng gan 2,6% (P>0,05) mô mỡ 4,49% (P>0,05) chuột ñược gây béo phì 10 tuần - Cả lô uống HCK (700 mg/kg) HCCa (1500mg/kg) tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol toàn phần triglycerid huyết chuột ñược gây béo phì 10 tuần c Hàm lượng cholesterol, triglycerid chuột sau 10 tuần thí nghiệm - Cả lô chuột gây béo phì uống HCK (700 mg/kg) HCCa (1500mg/kg) tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol toàn phần triglycerid huyết chuột ñược gây béo phì tuần uống thuốc Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN Đã ñịnh danh ñược tên khoa học bứa xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Garcinia oblongifolia Champ Ex Benth thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) - Bứa Đã xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hái bứa tuần tuổi (khi bứa chín) Xác ñịnh ñược thành phần lá, vỏ bứa, cụ thể: Độ ẩm (70,90%) vỏ bứa tươi (84,34%); Hàm lượng tro (3,44%) vỏ bứa sấy khô (1,42%); Các kim loại nặng lá, vỏ bứa nằm giới hạn cho phép tiêu chuẩn thực phẩm Việt Nam quốc tế Đã nghiên cứu chiết tách HCA phương pháp khác kết luận ñược chiết hỗ trợ lượng vi sóng cho hiệu cao (15,28%) Đã xác ñịnh ñược tổng lượng acid hữu acid hữu riêng biệt dịch chiết lá, vỏ bứa Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ñã xác ñịnh ñược (-)-hydroxycitric acid thành phần acid chủ yếu có lá, vỏ bứa, hàm lượng HCA tìm thấy (2,86%), vỏ bứa khô (15,28%) Lượng HCA xác ñịnh ñược từ vỏ bứa Việt Nam cao (15,28%), cao 02 loài bứa Ấn Độ G indica G cowa Đã xây dựng quy trình chuyển hoá tạo muối kali canxi hydroxycitric acid Kiểm tra sản phẩm sau chuyển hoá phù hợp với lý thuyết, sản phẩm thu nhận muối canxi (-)-hydroxycitrate kali (-)-hydroxycitrate có ñộ tinh khiết cao: HCCa (97,077%) HCK (99,221%), tiêu hàm lượng kim loại, vi sinh vật ñảm bảo ñạt tiêu chuẩn Việt Nam quốc tế thực phẩm Chế phẩm HCK có LD50 (8,717g/kg), ngược lại HCCa không Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 có LD50 HCK có tác dụng tốt việc chống béo phì, hạ lipid tăng lực HCCa có tác dụng chống béo phì, tăng lực chưa có ý nghĩa thống kê B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần ñầu tiên Việt Nam có công trình cập nhật thông tin ñầy ñủ có hệ thống lá, vỏ bứa hợp chất HCA; Lần ñầu tiên sử dụng lượng vi sóng ñể chiết HCA, tiết kiệm thời gian nhiệt lượng hiệu chiết ñảm bảo; Xác ñịnh ñiều kiện cụ thể ñể xác ñịnh acid hữu vỏ bứa cách riêng biệt; Xác ñịnh ñiều kiện chuyển hóa cụ thể tạo muối HCK HCCa, ñánh giá chất lượng xác ñịnh cấu trúc muối tạo thành; Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm chức giảm béo ñánh giá dược lý 02 chế phẩm muối HCK HCCa, kết HCK cho kết tốt C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Chế phẩm giảm béo HCK cho kết tốt chống béo phì, tăng lực hạ lipid Cần nghiên cứu sản xuất HCK với quy mô công nghiệp ñể làm thực phẩm chức giảm béo Chế phẩm HCK có ñộ hút ẩm cao, nên cần nghiên cứu tạo muối kép kali canxi với kim loại khác, Mg, Na, … ñể tạo sản phẩm có ñộ hút ẩm thấp, ñễ bảo quản tác dụng chống béo phì không thay ñổi Nghiên cứu ñiều kiện sinh trưởng, phát triển bứa từ ñó ñưa vào trồng làm nguyên liệu ñể sản xuất thực phẩm giảm cân chứa HCA qui mô công nghiệp Việt Nam Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 27 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN CỦA TÁC GIẢ [1] Đào Hùng Cường, Đặng Quang Vinh (2007), “Xác ñịnh axit hữu từ lá, vỏ bứa sắc ký lỏng cao áp”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 3(20), tr 137-143 [2] Đào Hùng Cường, Đặng Quang Vinh (2007), “Axit hydroxy xitric từ bứa (Garcinia)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, (127), tr 25-29 [3] Đặng Quang Vinh (2007), Luận văn thạc sĩ khoa học: Nghiên cứu chiết tách xác ñịnh hàm lượng axit hydroxyl xitric lá, vỏ bứa, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Đà Nẵng [4] Đặng Quang Vinh, Huỳnh Sang, Đào Hùng Cường (2009), “Chiết tách axit (-)-hydroxy xitric từ vỏ bứa dung dịch NH3”, Tạp chí Hoá học Ứng dụng, 20(104), tr 45-48 [5] Đặng Quang Vinh, Đoàn Thị Kim Anh, Đào Hùng Cường, Nguyễn Thưởng (2009), “Nghiên cứu ứng dụng lá, vỏ bứa làm gia vị mì ăn liền”, Tạp chí Hoá học Ứng dụng, 16(100), tr 43-47 [6] Đặng Quang Vinh, Đào Hùng Cường, Đoàn Thị Kim Anh, Huỳnh Sang, Nguyễn Thưởng (2009), “Nghiên cứu chuyển hoá tạo muối kali axit hydroxy xitric từ vỏ bứa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 6(35), tr 78-84 [7] Đặng Quang Vinh (2009), Báo cáo kết Đề tài khoa học công nghệ cấp sở: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hoá ứng dụng axit hydroxy xitric vỏ bứa, Đề tài khoa học công nghệ cấp sở-Đại học Đà Nẵng, Mã số: SĐH09-03-01-NCS [8] Đặng Quang Vinh, Nguyễn Thưởng, Đào Hùng Cường, Nguyễn Minh Khởi, Đỗ Thị Phương, Đoàn Thị Kim Anh (2011), “Nghiên cứu Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 28 số tác dụng bước ñầu dược lý muối canxi kali hydroxy xitrat chuột nhắt trắng”, Tạp chí Dược liệu, 03-2011 (16), tr.161-165 [9] Dang Quang Vinh, Dao Hung Cuong (2008), “Researching on extracting and estimating the composition and transfer reaction the hydroxycitric acid in the leaves, rinds, fruits of Garcinia oblongifolia Champ Ex Benth.”, VAST-Proceeding, p 503-511 [10] Dang Quang Vinh, Dao Hung Cuong, Nguyen Thuong (2011), “Extracting (-)-hydroxycitric acid from dried rinds of Garcinia oblongifolia Champ ex Benth by using microwave”, Journal of the Korean Chemical Society, 55(6), p 983-987 Footer Page 28 of 126 ... chiết tách, chuyển hoá hydroxycitric acid vỏ bứa ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo" làm luận án tiến sĩ chuyên ngành hóa hữu Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh hàm lượng, tính chất, khả chuyển hoá hydroxycitric. .. Đối tượng nghiên cứu: - Lá, vỏ bứa xã Hòa Liên, h Hòa Vang, TP ĐN * Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu chiết tách dung môi nước dung môi hữu cơ, ñịnh tính ñịnh lượng acid có trong lá, vỏ bứa - Tinh... có bứa Đây vấn ñề ñáng ñược quan tâm nghiên cứu nhằm góp phần quy hoạch, khai thác, chế biến ứng dụng sản phẩm bứa cách có hiệu quả, khoa học Với lí trên, chọn ñề tài nghiên cứu: "Nghiên cứu chiết