Nghiên cứu một số đặc tính của Enzym Lipase từ mủ đu đủ và ứng dụng vào quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN ĐÌNH HẢI NAM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đà Nẵng - Năm 2018 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Minh Nhật Phản biện 1: PGS.TS Trần Thị Xô Phản biện 2: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Luận văn bảo vệ Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Công nghệ sinh học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày 13 tháng 10 năm 2018 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Năm 1848, số loại enzym vô quan trọng lần khám phá nhà sinh lý học người Pháp Claude Bernard, enzym lipase [1] Trên thực tế, từ trước mốc thời gian này, nhân loại biết đến số cách ứng dụng lipase thông qua việc sử dụng dịch chiết từ tuyến tụy số loại động vật Kể từ đó, nhiều nhà khoa học giới bắt đầu trình tìm hiểu nghiên cứu loại enzym này, mở kỉ nguyên với ứng dụng rộng rãi toàn diện enzym lipase ngày Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) enzym thuộc lớp enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân (hydrolase) chất béo (triglycerides) thành glycerol axit béo tự Lipase có hoạt tính xúc tác chọn lọc cao, nhờ đặc tính mà lipase ngày ứng dụng phổ biến nhiều lĩnh vực: thực phẩm, hóa chất tẩy rửa, mỹ phẩm, tổng hợp chất hữu cơ, dược phẩm,… [2] Lipase tìm thấy nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động vật, côn trùng vi sinh vật Ở động vật, lipase tìm thấy tụy niêm mạc dày Ở trùng, lipase tìm thấy huyết nước bọt Ở thực vật, lipase diện phần lớn mô thực vật hạt kín [3] Phần lớn lipase nghiên cứu ứng dụng chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật [2] Lipase từ thực vật chiếm phần nhỏ công nghiệp sản xuất enzym với nhiều ưu điểm giá thành thấp, enzym cố định tự nhiên, dễ dàng chấp nhận sử dụng trực tiếp chất xúc tác sinh học dạng chế phẩm thô nên gần loại enzym quan tâm nghiên cứu phổ biến [4] Đu đủ thường biết đến với enzym papain – loại protease thương mại hóa từ lâu có nhiều ứng dụng thực tế Tuy vậy, lipase từ đu đủ nghiên cứu nhiều nơi giới sử dụng phổ biến ngành cơng nghiệp thực phẩm, cơng nghiệp tẩy rửa, hóa học y học Trong đó, đu đủ trồng phổ biến nhiều vùng nước ta chủ yếu để thu nhận papain từ phần protein có khả tan nước, nhiều enzym khác có mủ đu đủ, mà tiêu biểu lipase chưa tận dụng triệt để [5] Trong thời gian gần đây, ứng dụng quan trọng trội enzym lipase với ngành công nghệ thực phẩm biến đổi cấu trúc chất béo theo hướng mong muốn làm giàu, tách chiết axit béo thiết yếu – axit béo không no đa nối đôi Khoa học đại chứng minh axit béo không no chứa nhiều nối đôi (PUFAs) đóng vai trị quan trọng sức khỏe người Dầu cá từ lâu lại biết đến nguồn thiếu cung cấp axit béo không no chứa nhiều nối đôi (PUFA) Trong loại dầu cá biển cá hồi, cá thu, cá mịi, cá ngừ thường có chứa lượng n-3PUFA lớn, có hai loại đặc biệt quan tâm DHA (acid docosahexaenoic) EPA (acid eicosapentaenoic) Các nghiên cứu gần khẳng định hai loại axit béo có vai trị điều hịa ổn định mức độ cholesterol LDL (Low Density Lipoprotein) máu Vì vậy, việc bổ sung axít béo cách thích hợp giúp trì mức độ bình thường cholesterol thể, góp phần ngăn ngừa bệnh tim mạch nguy gây xơ vữa động mạch Ngồi ra, axit béo khơng no thành phần thiếu phần ăn trẻ em chúng có khả tăng cường thị giác phát triển trí não [6] Trong số loại cá người sử dụng làm thực phẩm, cá hồi (Salmon salar) biết đến thực phẩm giàu chất dinh dưỡng Đặc biệt, dầu cá hồi có chứa hàm lượng lớn loại axit béo chưa bão hòa, tiêu biểu DHA EPA [7] Thịt cá hồi có giá trị dinh dưỡng cao nên nhiều quốc gia quan tâm khai thác đánh bắt, có Việt Nam Tuy nhiên, sau chế biến để sử dụng phần thịt cá, nhiều phụ phẩm đầu cá, xương, vây bụng thịt thừa chưa tận dụng phục vụ cho người cách (chủ yếu chế biến làm thức ăn chăn nuôi) Điều gây nên lãng phí lớn giá trị dinh dưỡng phận khác cá không thua phần thịt cá Chính vậy, biết cách tận dụng nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ trình chế biến thủy sản để tạo chế phẩm giàu DHA EPA phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng người, định hướng mang lại nhiều ý nghĩa tích cực Đây chắn vấn đề trọng tương lai gần Điều đáng ý dầu cá tự nhiên, phần lớn axit béo nói chung hai axit béo thiết yếu nói riêng DHA EPA nằm dạng gốc acyl triacylglycerol (triglycerid) DHA EPA vốn axit béo thiết yếu, bên cạnh đó, có nhiều axit béo no không no nối đôi khác khơng có tác dụng tốt sức khỏe người Ý tưởng tìm cách loại bỏ loại axit béo khơng cần thiết để làm giàu hàm lượng DHA EPA dầu cá tự nhiên biết đến từ lâu có nhiều phương pháp khác để thực trình Trong số đó, phương pháp sử dụng enzym lipase thể nhiều ưu điểm trội so với phương pháp hóa học truyền thống trước Ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm định hướng ứng dụng quan trọng lipase, đặc biệt công nghệ sản xuất sản phẩm có chứa hàm lượng cao axit béo thiết yếu Tầm quan trọng axit béo chưa bão hòa (PUFA) chế độ dinh dưỡng thể việc giúp ngăn ngừa nhiều bệnh tật Điều khoa học chứng minh từ ba thập kỷ trước Đặc biệt, omega-3 (trong có DHA EPA) tham gia vào trình hình thành hoocmon - đóng vai trị quan trọng trình phát triển thể người Các axit béo thiết yếu xem thiếu cho phát triển trẻ em Trong công nghiệp chế biến chất béo trước đây, thông thường người ta sử dụng phương pháp hóa học để thủy phân dầu mỡ thành glycerol axit béo, sau sử dụng phương pháp vật lý để tinh Những năm gần đây, phương pháp làm giàu axit béo xúc tác enzym thường lựa chọn để thu nhận tinh axit béo không no nhiều nối đơi, chúng dễ bị oxy hóa phân hủy nhiệt độ cao trình chưng cất truyền thống Chính vậy, enzym lipase đóng vai trị quan trọng nhóm phương pháp Các phương pháp làm giàu DHA EPA lipase có ưu điểm vượt trội so với phương pháp vật lý hóa học truyền thống Bản chất phương pháp làm giàu DHA EPA dầu cá lipase dựa đặc điểm chọn lọc axit béo phân biệt lipase PUPA ω-3 có nối đơi gần nhóm carboxyl Đặc biệt, lipase cố định tái sử dụng mà không làm giảm đáng kể khả xúc tác Điều giúp ta thấy hướng ứng dụng tiềm loại enzym lĩnh vực xử lý dầu cá nhằm mục đích làm giàu axit béo thiết yếu Phần lớn lipase sử dụng nghiên cứu tính đến thời điểm có nguồn gốc chủ yếu từ vi sinh vật Cho đến nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu ứng dụng enzym lipase từ thực vật để làm giàu DHA EPA dầu cá Vì vậy, sử dụng enzym lipase từ thực vật (đu đủ) để thủy phân dầu cá hồi nhằm tạo nên sản phẩm giàu DHA EPA nói định hướng hứa hẹn cho kết khả quan, enzym từ thực vật có ưu riêng so với enzym từ nguồn khác Bên cạnh đó, Việt Nam đất nước có bờ biển dài với nguồn hải sản phong phú sở hữu diện tích đất nơng nghiệp rộng lớn – phù hợp với mục tiêu mà đề tài hướng đến tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có nhằm giảm giá thành sản phẩm Nhận thấy tiềm phát triển lớn nguồn lipase thực vật nói chung từ đu đủ nói riêng, với mục đích làm sáng tỏ đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ khả ứng dụng loại enzym công nghiệp thực phẩm, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu số đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ ứng dụng vào trình làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định số đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ, bao gồm: + Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym chất dầu cá hồi + Tính đặc hiệu enzym với axit béo no/không no - Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ nhằm mục đích làm giàu hàm lượng axit béo DHA EPA thông qua phương pháp khác Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu - Mủ đu đủ: thu từ số vườn đu đủ trồng huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam - Dầu cá hồi: dầu cá tách chiết từ lường cá hồi mua Công ty TNHH chế biến thực phẩm D&N, 01 Nguyễn Phục, Thọ Quang, Sơn Trà, Đà Nẵng 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu sử dụng phương pháp phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm - Kết nghiên cứu có ý nghĩa xác đối tượng enzym lipase thu nhận từ đu đủ trồng nhà vườn huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam cá hồi có nguồn gốc thành phố Đà Nẵng Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp thu nhận - Phương pháp thu nhận mủ đu đủ - Phương pháp thu nhận dầu cá hồi 4.2 Phương pháp hóa sinh - Phương pháp xác định số acid - Phương pháp xác định số xà phòng hóa - Phương pháp xác định hoạt độ lipase chất dầu cá hồi: + Phương pháp chuẩn độ + Phương pháp đo quang - Phương pháp xác định tính đặc hiệu lipase với loại axit béo - Phương pháp làm giàu DHA EPA dầu cá hồi xúc tác enzym lipase thô từ mủ đu đủ - Phương pháp xác định hàm lượng axit béo dầu cá Và số phương pháp thực nghiệm khác 4.3 Phương pháp thống kê xử lý số liệu ngh a h a học th c ti n đề tài nghiên cứu 5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Xác định số đặc tính enzym lipase thu từ mủ đu đủ Đại Lộc, Quảng Nam, có tính đặc hiệu loại enzym axit béo no không no (là kết chưa cơng bố trước đó) - Xác định số đặc tính dầu cá hồi - Đánh giá hiệu trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ nhằm mục đích làm giàu hàm lượng DHA EPA dầu cá 5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có rẻ tiền - Làm giàu hàm lượng DHA EPA dầu cá hồi để sản xuất sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng chăm sóc sức khỏe người tiêu dùng với giá trị cao - Tạo công ăn việc làm cho người nông dân ngư dân - Nguồn gốc enzym từ tự nhiên đảm bảo an toàn cho người sử dụng, thích hợp để ứng dụng ngành công nghệ thực phẩm Kết cấu luận văn Luận văn có bố cục cụ thể sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYM LIPASE 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Cấu trúc enzym 1.1.3 Đặc tính xúc tác 1.1.4 Cơ chế xúc tác 1.1.5 Tính chất 1.1.5.1 Tính đặc hiệu 1.1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình xúc tác enzym 1.1.6 Ứng dụng enzym lipase 1.1.7 Ưu phản ứng xúc tác lipase 1.1.8 Nguồn gốc lipase 1.1.9 Lipase từ mủ đu đủ 1.1.9.1 Sơ lược lipase thực vật 1.1.9.2 Vài đặc điểm đu đủ 1.1.9.3 Mủ đu đủ lipase từ mủ đu đủ 1.2 DẦU CÁ VÀ NGUỒN DINH DƯỠNG TỪ DẦU CÁ 1.2.1 Dầu cá 1.2.2 Nguồn dinh dưỡng từ dầu cá: Omega-3 1.2.3 Dầu cá hồi – nguồn cung cấp DHA, EPA 1.3 ỨNG DỤNG LIPASE LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU CÁ Dựa hai phản ứng đặc trưng lipase phản ứng thủy phân (hydrolysis) ester hóa (esterification), có hai phương pháp làm giàu DHA, EPA tương ứng dùng phổ biến 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ 2.2.1.1 Thu nhận mủ đu đủ 2.2.1.2 Thu nhận enzym thô từ mủ đu đủ 2.2.1.3 Hiệu suất thu nhận 2.2.2 Phương pháp thu nhận dầu cá hồi 2.2.3 Phương pháp vật lý hóa lý 2.2.3.1 Xác định khối lượng mẫu 2.2.3.2 Xác định nhiệt độ 2.2.3.3 Xác định độ pH 2.2.3.4 Phương pháp sấy 2.2.4 Phương pháp hóa sinh 2.2.4.1 Phương pháp xác định số acid 2.2.4.2 Phương pháp xác định số xà phịng hóa 2.2.4.3 Phương pháp đo quang xác định hoạt độ lipase thô 2.2.4.4 Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ lipase chất dầu cá hồi 2.2.4.5 Phương pháp xác định tính đặc hiệu axit béo lipase chất - Phương pháp đo hoạt độ chuẩn độ 11 - Phương pháp so sánh hoạt độ đĩa thạch 2.2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng nhiệt độ pH đến hoạt độ lipase 2.2.4.7 Phương pháp thủy phân làm giàu DHA EPA dầu cá hồi enzym lipase - Hiệu suất thủy phân [23]: tính theo cơng thức: ( ) 2.2.4.8 Phương pháp ester hóa kết hợp phương pháp kết tinh với ure làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi enzym lipase - Dạng sản phẩm sau phản ứng: đánh giá thông qua hiệu suất ester hóa (%) - Hiệu suất thu hồi DHA, EPA sau phản ứng (DHA/EPA rec very): ( ) ( ) ( ) - Hiệu làm giàu DHA, EPA: ( ) ( ( ) ) ( ) ( ) 2.2.4.9 Phương pháp xác định hàm lượng axit béo dầu cá 2.2.5 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.6 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ 3.1.1 Đánh giá hiệu suất thu nhận 3.1.2 Đánh giá hoạt độ chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 3.1.2.1 Xác định thời gian đo hoạt độ Trong phản ứng xúc tác với enzym, hoạt độ enzym tăng dần theo thời gian, mức độ tăng khác Có khoảng thời gian xác định mà đó, mức độ thay đổi hoạt độ theo thời gian lớn Lúc này, vận tốc phản ứng cao nhất, mức hoạt độ đo thời điểm phản ánh xác hoạt lực enzym Tiến hành thí nghiệm đo hoạt độ mốc thời gian khác Kết biến thiên số acid theo thời gian thể đồ thị hình 3.2 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn thay đổi vận tốc phản ứng (∆V/t) theo thời gian 13 Kết luận: thời gian tối ưu để xác định hoạt lực enzym lipase từ mủ đu đủ chất dầu cá hồi 15 phút 3.1.2.2 Hoạt độ chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ 3.1.3 Nghiên cứu tính đặc hiệu chế phẩm lipase thơ từ mủ đu đủ 3.1.3.1 Xác định tính đặc hiệu phương pháp chuẩn độ Tiến hành xác định hoạt độ enzym lipase từ mủ đu đủ chất khác Kết thể biểu đồ hình 3.3: Dầu đậu nành Loại chất Hình 3.3 Hoạt độ lipase mủ đu đủ loại chất khác Thứ tự hoạt độ enzym chất khác nhau: Triglycerid axit bé bất bã hòa đa > Triglycerid axit bé bất bã hòa đơn > Triglycerid axit bé n Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu triglycerid có thành phần axit béo khơng no nhiều nối đôi phân tử 14 3.1.3.2 Xác định tính đặc hiệu phương pháp đĩa thạch Phương pháp đĩa thạch: phương pháp định tính, dễ quan sát, sử dụng để kiểm chứng lại hoạt độ enzym lipase từ mủ đu đủ - So với lipase khác: hoạt độ lipase đu đủ thể tốt (hình 3.4) (a) (b) (c) Hình 3.4 Hoạt độ chất dầu cá hồi hai loại lipase khác nhau; hình (a) lipase thương mại; hình (b) lipase thơ; hình (c) khơng dùng lipase - Quan sát hoạt động lipase hai chất triolein dầu cá hồi: hoạt độ lipase đu đủ thể cao chất dầu cá hồi (a) (b) Hình 3.5 Hoạt độ hai đĩa chất khác lipase từ mủ đu đủ; hình (a) chất triolein; hình (b) chất dầu cá hồi Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu triglycerid có thành phần axit béo không no nhiều nối đôi phân tử 15 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hoạt độ enzym lipase thô chất dầu cá hồi 3.1.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzym lipase thô từ mủ đu đủ Khảo sát hoạt độ enzym lipase từ mủ đu đủ chất dầu cá hồi mức nhiệt độ khác để tìm mức nhiệt độ tối ưu enzym Kết thể qua đồ thị hình 3.6 255,56a 198,89b 188,89 b 134,44c 134,45c 94,44c,d 81,11d o Nhiệt độ ( C) Hình 3.6 Đồ thị thể ảnh hưởng mức nhiệt độ khác đến hoạt độ enzym Kết luận: mức nhiệt độ tối ưu 45oC 16 3.1.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzym lipase thô từ mủ đu đủ Khảo sát hoạt độ enzym lipase từ mủ đu đủ chất dầu cá hồi mức pH khác để tìm mức pH tối ưu cho enzym Kết thể qua đồ thị hình 3.7 262,22a 231,11b 226,67b 224,45b 213,33b,c 207,78b,c 204,44b,c 193,33c,d 187,78c,d Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng mức pH khác đến hoạt độ enzym Kết luận: mức pH tối ưu 3.2 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIPASE MỦ ĐU ĐỦ ĐỂ LÀM GIÀU DHA VÀ EPA TRONG DẦU CÁ HỒI 3.2.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 3.2.1.1 Xác định số chất lượng dầu cá hồi thô Đã xác định số số chất lượng dầu cá hồi thô 17 3.2.1.2 Xác định thành phần axit béo có dầu cá hồi Đã xác định thành phần axit béo có dầu cá hồi, DHA chiếm 4,11% EPA chiếm 4,03% 3.2.2 Kết nghiên cứu ứng dụng enzym lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA Một xu hướng ứng dụng quan trọng enzyme lipase làm giàu axit béo omega-3 có lợi có sức khỏe (đặc biệt DHA EPA) từ nguồn nguyên liệu sẵn có (các loại dầu cá) Trong đề tài nghiên cứu này, lựa chọn dầu cá hồi nguồn nguyên liệu để thực trình làm giàu Trong phần trình bày đây, chúng tơi sử dụng hai đặc tính xúc tác lipase để phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm đặc tính xúc tác cho phản ứng ester hóa axit béo ancol (3.2.2.1); đặc tính xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo (3.2.2.2) Đây hai phản ứng có chiều nghịch [48], việc tận dụng đặc điểm xúc tác cho hai loại phản ứng khiến ứng dụng enzym lipase trở nên linh hoạt đa dạng 3.2.2.1 Làm giàu theo phương pháp tạo kết tinh với ure kết hợp ester hóa lipase từ mủ đu đủ Phương pháp d a tính xúc tác ch phản ứng ester hóa enzym lipase Quy trình phương pháp: Bước 1: Thực xà phịng hóa dầu cá dung dịch kiềm đặc nhằm thủy phân toàn axit béo có dầu cá, tách hỗn hợp axit béo khỏi hỗn hợp, sau axit hóa trở lại để thu axit béo dạng tự Bước 2: Tiến hành loại bỏ axit béo no khỏi hỗn hợp phương pháp kết tinh với ure Các axit béo không cần thiết phản ứng với ure tạo kết tủa Lọc bỏ kết tủa, thu hỗn hợp axit béo bất bão hịa (trong có DHA, EPA) 18 Bước 3: Thực phản ứng ester hóa hỗn hợp axit béo bất bão hòa đa với glycerol xúc tác enzym lipase từ mủ đu đủ Đánh giá hiệu phương pháp a) Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng DHA, EPA dạng tự dầu cá Đã xây dựng đồ thị đường chuẩn DHA EPA với hệ số tương quan cao, thích hợp để đánh giá hàm lượng DHA, EPA tự mẫu phương pháp HPLC b) Nghiên cứu xác định điều kiện kết tủa axit béo dầu cá ure Mơ hình thực nghiệm bậc tâm trực giao Box-Wilson lựa chọn nhằm tìm kiếm yếu tố ảnh hưởng phù hợp, cho khối lượng kết tủa thu lớn Hàm mục tiêu là: khối lượng kết tủa sau phản ứng với ure (để loại bỏ nhiều loại axit béo no không no nối đôi) Hai yếu tố ảnh hưởng lựa chọn là: - Z1: Tỉ lệ ure : axit béo - Z2: Thời gian phản ứng Tiến hành thí nghiệm theo quy hoạch đề ra, phân tích liệu tìm phương trình hồi quy thể ảnh hưởng yếu tố đến mục tiêu sau: Y=2.1347 - 0.4667.x1 + 0.1332 Phương trình hồi quy đánh giá phù hợp Dựa vào phương trình hồi quy, tìm giá trị hai biến ảnh hưởng cho giá trị hàm mục tiêu lớn nhất; tỉ lệ ure : axit béo = 3:1 thời gian phản ứng c) Đánh giá hiệu phương pháp - Thực quy trình làm giàu với điều kiện tối ưu, xác định hàm lượng DHA thời điểm khác để tính tốn 19 - Lúc đầu, 50 g dầu cá đem tiến hành trình làm giàu, với 4,11% DHA 4,03% EPA (phần 3.2.1.2), từ tính khối lượng DHA EPA thực tế mẫu ban đầu 2,055 g 2,015 g - Đến giai đoạn kết thúc trình ure loại bỏ axit béo no (kết thúc bước 2), thể tích mẫu thu 9,2 ml với khối lượng 8,9 g Lúc này, tiến hành chạy HPLC đo nồng độ DHA mẫu 0,44M Dễ dàng tính khối lượng DHA có mẫu là: mDHA = nDHA MDHA = CDHA VddDHA MDHA = 0,44 9,2 10-3 328,5 = 1,33 g Tương tự tính được: mEPA = nEPA MEPA = CEPA VddEPA MEPA = 0,176 9,2 10-3 302,45 = 0,49 g (Trong đó: m khối lượng chất, n số mol chất, M khối lượng mol chất (phân tử lượng), C nồng độ chất Vdd thể tích dung dịch) - Hiệu suất thu hồi DHA (DHA rec very) sau trình sau: ( ) - Hiệu suất trình ester hóa l ại axit bé (hiệu suất bước 3) vào nồng độ DHA EPA trước sau phản ứng ester hóa: ( ) ( ) Tỉ lệ 75,5% 65,34% tỉ lệ chuyển hóa tốt kiểu phản ứng - Tỉ lệ phần trăm DHA tr ng hỗn hợp cuối sau ester hóa: ( ) Tỉ lệ tăng cao đến 9,1%, tương ứng với mức làm giàu 1,84 lần loại bỏ glycerol dư sau phản ứng ester hóa 20 3.2.2.2 Làm giàu theo hương pháp thủy phân xúc tác lipase từ mủ đu đủ Phương pháp d a tính xúc tác ch phản ứng thủy phân enzym lipase - Hiệu suất trình thủy phân (DH – degree of hydrolysis) dùng để đánh giá trình thủy phân - Khi thực phản ứng thủy phân dầu cá enzym lipase, cần mức độ thủy phân (DH) phản ứng đạt khoảng 50% đạt yêu cầu a) Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Tiến hành phản ứng thủy phân với tỉ lệ enzym/cơ chất khác nhau, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% Đo hiệu suất thủy phân tương ứng Kết thu hình 3.18 54,11f 52,50e 51,98e 50,71d 49,26c 46,05b 42,33a Tỉ lệ enzym/cơ chất (%) Hình 3.18 Biểu đồ thể ảnh hưởng mức tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 21 Kết luận: tỉ lệ enzym/cơ chất phù hợp 4% với mức hiệu suất thủy phân tương ứng 50,71% b) Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân Tiến hành phản ứng thủy phân mốc thời gian khác nhau; giờ, giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 Đo hiệu suất thủy phân tương ứng Kết thu hình 3.20 f 54,53f 54,50 51,42e 50,21 47,82 e d 45,24c 43,08b 38,24a Hình 3.20 Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất thủy phân Kết luận: 20 khoảng thời gian tối ưu để thực phản ứng thủy phân dầu cá hồi xúc tác enzym lipase từ mủ đu đủ, với mức hiệu suất thủy phân tương ứng 50,21% 22 c) Đánh giá hiệu phương pháp - Dựa hàm lượng DHA, EPA trước sau phản ứng thủy phân, kết luận enzym lipase từ mủ đu đủ enzym đặc hiệu với DHA - Hiệu suất thủy phân DHA: 3.2.2.3 Đánh giá hai phương pháp làm giàu Trình bày, so sánh số ưu, nhược điểm hai phương pháp làm giàu 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã nghiên cứu số đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ: - Hiệu suất thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ 19,31% - Thời gian tối ưu để xác định hoạt độ 15 phút, với mức hoạt độ tương ứng chất dầu cá hồi 232,41U/g - Enzym có tính đặc hiệu chất béo axit béo không no, nhiều nối đôi - Xác định mức nhiệt độ pH hoạt động tối ưu cho enzym lipase chất dầu cá hồi 45oC Đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi: - Xác định số đặc điểm dầu cá hồi, bao gồm số chất lượng thành phần axit béo dầu cá - Làm giàu phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa: xác định tỉ lệ ure : axit béo thời gian tối ưu phản ứng kết tinh với ure 3/1 Mức độ làm giàu DHA sản phẩm 1,84 lần so với dầu cá ban đầu, hiệu suất thu hồi axit béo 64,88% Tỉ lệ DHA, EPA chuyển thành dạng glycerid đạt 75,50% 65,34% - Làm giàu phương pháp thủy phân: xác định mức tỉ lệ enzym/cơ chất thời gian để hiệu suất phản ứng đạt 50% 4% 20 Hiệu suất thủy phân DHA đạt 63,30% Kiến nghị: Nghiên cứu bổ sung thêm số đặc tính khác enzym lipase từ mủ đu đủ, hoàn thiện kết có Nghiên cứu phương pháp tối ưu loại bỏ glycerol cách làm giàu theo phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa 24 Tiếp tục quy trình tách làm giàu DHA cách làm giàu theo phương pháp thủy phân Tối ưu thêm thông số khác hai phương pháp làm giàu có nhằm nâng cao hiệu so với Tiến hành nghiên cứu phương pháp làm giàu dựa phản ứng transester hóa Đánh giá chất lượng sản phẩm thu sau trình làm giàu với mục tiêu sử dụng làm thực phẩm Có thể tiến hành nghiên cứu quy mơ lớn hơn, đẩy nhanh q trình ứng dụng thực tế ... từ mủ đu đủ khả ứng dụng loại enzym công nghiệp thực phẩm, lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc tính enzym lipase từ mủ đu đủ ứng dụng vào trình làm giàu DHA, EPA dầu cá hồi? ?? Mục tiêu nghiên cứu. .. mủ đu đủ 1.2 DẦU CÁ VÀ NGUỒN DINH DƯỠNG TỪ DẦU CÁ 1.2.1 Dầu cá 1.2.2 Nguồn dinh dưỡng từ dầu cá: Omega-3 1.2.3 Dầu cá hồi – nguồn cung cấp DHA, EPA 1.3 ỨNG DỤNG LIPASE LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU... độ enzym Kết luận: mức pH tối ưu 3.2 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIPASE MỦ ĐU ĐỦ ĐỂ LÀM GIÀU DHA VÀ EPA TRONG DẦU CÁ HỒI 3.2.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 3.2.1.1 Xác định số chất lượng dầu cá hồi