Nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1 tái tổ hợp biểu hiệu trong escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN THỊ NHÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5-1 TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Trần Thị Nhài NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5-1 TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM 1.1.1 Sơ lƣợc cấu trúc khả gây bệnh virus cúm 1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ 1.1.3 Cấu trúc, chức HA NA 1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên virus cúm A 11 1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 12 1.2 BIỂU HIỆN GEN 14 1.2.1 Hệ biểu E coli 14 1.2.2 Chủng biểu E coli BL21 15 1.2.3 Vector biểu pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin 16 2.1 VẬT LIỆU 17 2.1.1 Các chủng sinh vật plasmid 17 2.1.2 Hóa chất enzym 17 2.1.3 Máy móc thiết bị 17 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid enzym cắt giới hạn 20 2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid 21 2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt 21 2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E coli 22 2.2.5 Điện di DNA gel agarose 23 2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose 24 2.2.7 Điện di protein gel polyacrylamide 25 2.2.8 Biểu protein tái tổ hợp 26 2.2.9 Tinh chế sơ protein tái tổ hợp dung dịch đệm urê 27 2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên TrxHA5-1 27 2.2.11 Kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch gà 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1 33 3.1.1 Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu pET22trx 33 3.1.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l enzyme cắt giới hạn 34 3.2 BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E COLI BL21 36 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E COLI 37 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến biểu gen ha5-l 38 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến biểu gen ha5-l 38 3.3.3 Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp 39 3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 40 3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1 43 KẾT LUẬN 45 ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 52 MỞ ĐẦU Cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm, nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây Nhóm virus cúm A có 16 phân type hemagglutinin (HA) (từ H1 đến H16) phân type neuraminidase (NA) từ N1 đến N9) có khả tái tổ hợp để tạo nên nhiều phân type khác độc tính khả gây bệnh Trong chủng virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI High Pathogenic Avian Influenza) chủng gây dịch bệnh chủ yếu nhiều quốc gia giới, có Việt Nam Virus cúm gia cầm A/H5N1 lần phân lập từ người Hồng Kông vào năm 1997 sau có số vụ dịch bùng phát gia cầm Cho tới nay, chủng virus A/H5N1 thường xuyên thay đổi kháng nguyên bề mặt thông qua đột biến tái tổ hợp di truyền biến thể Vật chủ tự nhiên tất chủng virus cúm A/H5N1 chim hoang dã (chủ yếu vịt trời), nguyên nhân lan truyền virus tự nhiên khó kiểm sốt Virus cúm A có khả gia tăng biên độ vật chủ chúng trình lây truyền tự nhiên [20, 14] Nhờ đặc tính ln thay đổi kháng nguyên tự nhiên, virus cúm A biến đổi để xâm nhiễm nhiều lồi vật chủ trung gian khác gia cầm, số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” gà - gà, hay “ngoại loài” gà - lợn; gà - lợn - người Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 xuất 50 quốc gia khác châu Á, châu Âu, châu Phi có nguy lan rộng khắp giới Theo thơng báo WHO, tính đến tháng 01/2012 có tới 583 trường hợp mắc cúm A/H5N1, 344 trường hợp tử vong, 120 triệu gia cầm chết nhiễm virus bị tiêu hủy Virus lây lan nhanh có độc lực cao vật chủ khác Tiêm vaccine phòng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm coi cách phòng chống hiệu quả, đỡ tốn không ảnh hưởng nguy hại tới môi trường Các nhà khoa học giới nghiên cứu sản xuất loại vaccine cúm khác như: vaccine vô hoạt, vaccine nhược độc, vaccine đơn vị, vaccine DNA vaccine tái tổ hợp [27] Trong đó, vaccine vơ hoạt vaccine nhược độc sản xuất cách nuôi cấy virus phôi gà Các kết nghiên cứu công bố cho thấy phần lớn bảo hộ chống lại virus cúm A kết đáp ứng miễn dịch kháng lại protein HA [13] Do đó, việc dùng HA thành phần kháng nguyên vaccine hứa hẹn đem lại kết khả quan Hệ biểu E coli có nhiều ưu điểm mơi trường ni cấy đơn giản, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh, khả biểu gen tái tổ hợp mạnh Hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l Cấu trúc gene E coli đặc điểm di truyền nghiên cứu đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trình nghiên cứu sản xuất Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu thực tế trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5-1 tái tổ hợp biểu Escherichia coli” Với mục đích sử dụng protein tái tổ hợp để nghiên cứu đánh giá khả phát triển vaccine tái tổ hợp đơn vị phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm Công việc tiến hành phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM 1.1.1 Sơ lƣợc cấu trúc khả gây bệnh virus cúm Họ Orthomyxoviridae phát bao gồm nhóm virus, là: nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C); nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác kháng nguyên bề mặt capsid, virus cúm A B Hemagglutinin (HA), virus cúm C Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), Thogotovirus Glycoprotein (GP) [18, 25] Cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm, nhóm virus cúm A gây nên Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA phân type NA, tái tổ hợp phân type HA NA, mặt lý thuyết, tạo nhiều phân type khác độc tính khả gây bệnh Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng dễ dàng đột biến gen/hệ gen (đặc biệt gen NA HA) trao đổi gen kháng nguyên với nhau, trình xâm nhiễm tồn lây truyền loài vật chủ Đặc tính cấu trúc chung tất nhóm virus họ Orthomyxoviridae hệ gen chúng chứa ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu ss(-) RNA (negative single stranded RNA) Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đơi có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da Phân tích thành phần hóa học virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 75% protein; 20 - 24% lipid - 8% carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc (envelope) lõi RNA sợi đơn âm [25] Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B) phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) virus cúm A A: Các dạng hình thái khác virus cúm A kính hiển vi điện tử; B: Mơ hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba đơn vị phức hợp enzyme polymerase virus) C: Cấu trúc phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge) Vỏ virus có chức bao bọc bảo vệ vật chất di truyền RNA virus, chất cấu tạo màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đặc hiệu hóa gắn protein màng virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhơ phân bố dày đặc, gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính - nm, kháng nguyên bề mặt vỏ virus, chất cấu tạo glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) dấu ấn khác virus [5, 44] Trong tỷ lệ phân tử NA HA 1/4, hai loại protein kháng nguyên có vai trị quan trọng q trình xâm nhiễm virus tế bào cảm nhiễm [25] Vật chất di truyền (còn gọi hệ gen) virus cúm A RNA sợi đơn âm gồm phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 PB2) nối với thành sợi bên vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng virus, phân đoạn M mã hóa cho protein M1 M2; phân đoạn NS mã hóa cho protein NS1 NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho protein PB1 PB1-F2 [18] Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm qua lớp biểu mô đường hô hấp gây bệnh chủ yếu đường hơ hấp Ngồi ra, chúng gây tổn thương nhiều quan khác thể động vật cảm nhiễm, virus gọi virus hướng đa phủ tạng [28, 38] Khả gây bệnh virus cúm A phụ thuộc vào độc lực tính thích nghi vật chủ chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh gây bệnh nhẹ giới hạn đường hô hấp chim hoang dã gia cầm nhiễm, số chủng cường độc (H5, H7 H1, H2, H3) gây bệnh nặng hầu hết quan thể, gây nên dịch cúm gia cầm người [33, 43] Hầu hết chủng virus cúm A nhân lên tốt phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, nhiên chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà sau vài giờ, hàm lượng virus thấp chưa nhân lên nhiều gây bệnh cúm thực nghiệm chuột lang, chuột Hamster, chồn đất [14, 17] Sau bị nhiễm virus cúm A, thể vật chủ sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus Tuy nhiên đáp ứng miễn dịch khơng có tác dụng bảo vệ cho lần nhiễm sau, virus cúm A ln có biến đổi kháng ngun q trình lưu hành tự nhiên khơng có đáp ứng miễn dịch chéo chủng virus cúm A [38] Do đó, xuất biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng ngun khác với chủng virus trước đó, thể nhiễm khơng có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm Đây nguyên nhân làm cho gia cầm người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần năm đợt dịch cúm xảy sau thường nặng nề gây nên đại dịch cúm [12] Virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 nguyên nhân đại dịch cúm người trước thích nghi lây nhiễm người [18] Các chủng thường gây vụ dịch cúm tản phát hàng năm người trình tồn tại, chúng biến đổi kháng nguyên liên tục [16] Đây nguồn virus có khả trao đổi gen với chủng virus cúm lưu hành gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác người [10, 37, 38, 40] 1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, q trình xâm nhiễm nhân lên virus xảy chủ yếu tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa thể nhiễm [25, 28] có nét đặc trưng sau: Q trình xâm nhiễm virus cúm A mở đầu kết hợp HA thụ thể thích ứng bề mặt tế bào biểu mơ cuối giải phóng hệ gen virus vào bào tương tế bào nhiễm (Hình 1.2) Hình 1.2: Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ Quá trình nhân lên RNA virus cúm A xảy nhân tế bào, đặc điểm khác biệt so với virus khác (quá trình xảy nguyên sinh chất) cuối giải phóng hạt virus khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò enzyme NA Thời gian chu trình xâm nhiễm giải phóng hạt virus trung bình khoảng Sự tạo thành hạt virus không phá tan tế bào nhiễm, tế bào bị rối loạn hệ thống tổng hợp đại phân tử rơi vào trình chết theo chương trình làm tổn thương mơ thể vật chủ [35, 38] Sau giải phóng vào bào tương tế bào nhiễm, hệ gen virus sử dụng máy sinh học tế bào tổng hợp protein virus RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein – RNA virus vận chuyển vào nhân tế bào [4] Trong nhân tế bào RNA hệ gen virus tổng hợp nên sợi dương từ khuôn sợi âm hệ gen virus, từ sợi dương chúng tổng hợp nên RNA hệ gen virus nhờ RNA-polymerase Các sợi không Adenine hóa (gắn thêm Adenine - gắn mũ) đầu 5’- 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh vận chuyển bào tương tế bào Đồng thời, RNA thông tin virus chép nhờ hệ thống enzyme phân đoạn gen virus, enzyme PB2 gắn thêm 10 12 nucleotide Adenin đầu 5’-, sau vận chuyển bào tương dịch mã lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên protein virus (Hình 1.2) Các phân tử NA HA virus sau tổng hợp vận chuyển gắn lên mặt màng tế bào nhiễm nhờ máy Golgi, gọi tượng “nảy chồi” virus NP sau tổng hợp vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP virus Sau RNP virus hợp với vùng “nảy chồi” tạo thành “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ liên kết HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt liên kết giải phóng hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm tế bào khác [25, 26] 1.1.3 Cấu trúc, chức HA NA Hai protein HA NA protein bề mặt capsid, đặc trưng cho chất chủng virus cúm A [21, 25] Protein HA (hemagglutinin) Protein hemagglutinin glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả gây ngưng kết hồng cầu gà ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với HA phong tỏa ngưng kết đó, gọi kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody) Protein HA kháng nguyên bề mặt quan trọng virus cúm A, kích thích thể sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với type HA, coi protein vừa định tính kháng nguyên, vừa định độc lực virus, đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn xâm nhiễm virus thể nhiễm, sở điều chế vaccine phòng cúm [6, 17, 21, 24] Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm đơn phân (trimer), đơn phân (monomer) tạo thành từ hai đơn vị HA1 (36 dạng không tan thử nghiệm làm vaccine, protein vỏ virus gây bệnh Leukaemia typ người biểu tế bào côn trùng dạng không tan thử nghiệm làm vaccine Trong nghiên cứu mong muốn sản xuất protein tái tổ hợp dạng không tan, thuận lợi cho q trình tinh chế chúng có tính sinh miễn dịch cao dạng tan Để định hướng protein tổng hợp dạng không tan, nuôi cấy vi khuẩn cho sinh tổng hợp protein nhiệt độ 37oC kDa 116 66 TrxHA5-1 45 35 25 18,4 14,4 Hình 3.5: Protein từ chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen trxha5-1; 1: Protein không tan; 2: Protein dạng tan; 3: Thang protein chuẩn (Fermentas) Kế t quả phân tích pha protein tan khơng tan hình 3.5 cho thấ y , hầ u hế t protein tái tổ hơ ̣p TrxHA 5-1 đươ ̣c tổ ng hơ ̣p nằ m pha khơng tan Ngồi ra, có lượng nhỏ protein tổng hợp dạng tan có kích thước tương đương TrxHA5-1 chúng tơi chưa khẳng định protein TrxHA5-1 hay protein vi khuẩn hàm lượng khơng nhiều 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E COLI Quá trình tổng hợp protein ngoại lai tế bào vi khuẩn E.coli chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố Để thu lượng lớn protein lần nuôi cấy cần phải tiến hành tối ưu điều kiện ni cấy như: nhiệt độ, thời gian nồng độ chất cảm ứng 37 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến biểu gen ha5-l Nhiệt độ thường có ảnh hưởng lớn trình sinh tổng hợp hình thành cấu trúc protein tái tổ hợp Trong thí nghiệm này, để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ với q trình tổng hợp protein TrxHA5-1, chúng tơi tiến hành nuôi cấy cảm ứng nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C Sau nuôi cấy cảm ứng, tế bào thu lại kiểm tra mức độ biểu protein cách điện di gel polyacrylamide 12% có SDS Kết trình bày hình 3.6 5,9 kb kDa 116 66 TrxHA5-1 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 cảm ứng 0,5 mM IPTG nhiệt độ khác nhau; 1-4 : Nhiệt độ cảm ứng tương ứng 22 oC, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn (Fermentas) Quan sát kết điện di kiểm tra, ta thấy lượng protein tái tổ hợp TrxHA5-l tổng hợp nhiệt độ khác khác nhau, đó, băng protein TrxHA5-l biểu đậm 30°C Như 30oC protein ngoại lai tổng hợp nhiều Với kết này, lựa chọn 30°C cho nghiên cứu 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến biểu gen ha5-l IPTG chất cảm ứng đắt tiền nồng độ cao gây độc cho tế bào, nồng độ thấp protein ngoại lai thường tổng hợp Vì thế, để lựa chọn nồng độ IPTG thích hợp cho q trình ni cấy với mục đích thu 38 lượng lớn protein tiết kiệm chi phí sản xuất, chúng tơi tiến hành khảo sát khả biểu protein tái tổ hợp TrxHA5-l nồng độ cảm ứng khác (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; mM) protein dạng không tan kiểm tra điện di gel gel polyacrylamide Kết (Hình 3.7) cho thấy, nồng độ IPTG ảnh hưởng không nhiều tới trình biểu protein ngoại lai, nhiên nồng độ q protein tái tổ hợp tổng hợp với lượng tương đối nhỏ 11 22 33 44 5 6 kDa 116 66 45 5,9 kb TrxHA5-1 35 25 18.4 14.4 Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 cảm ứng nồng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nồng độ chất cảm ứng IPTG tương ứng 0,1mM, 0,5mM, mM, 1,5 mM: mM; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas) Như để đảm bảo thu lượng lớn protein, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất lựa chọn nồng độ IPTG 0,5 mM để biểu protein tái tổ hợp 3.3.3 Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp Thơng thường, tế bào sinh trưởng đến nồng độ định dừng lại Nếu thu tế bào muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lượng protein tái tổ hợp tế bào giảm Trong thí nghiệm này, tiến hành thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lượng TrxHA5-1 pha không tan 39 kDa 116 66 45 TrxHA5-1 35 25 18.4 14.4 Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E.coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 cảm ứng 0,5 mM IPTG thời gian thu mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu sau cảm ứng tương ứng 1, 2, 3, 4, giờ; 6: Thang protein chuẩn (Fermentas) Kết (Hình 3.8) cho thấy tế bào bắt đầu sinh tổng hợp protein từ đầu tăng dần theo thời gian (từ đến giờ) Sau nuôi cấy cảm ứng, tế bào môi trường sinh trưởng đạt đến mức tối đa đạt đến pha cân Lúc trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 diễn mạnh gần đạt đỉnh điểm Như vậy, khả sinh tổng hợp protein tái tổ hợp TrxHA5-1 phụ thuộc vào pha sinh trưởng tế bào Lượng protein thu cao sau nuôi cấy cảm ứng Kết luận: từ kết thu điều kiện tối ưu, lựa chọn điều kiện nuôi cấy để đạt lượng lớn protein tái tổ hợp 30°C, nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM thời gian sau nuôi cấy cảm ứng 3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 Để kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp sử dụng mục đích chế tạo vaccine, cần phải thu protein dạng tinh Vì vậy, tiến hành nuôi cấy cảm ứng thu lượng lớn protein để chuẩn bị cho bước tinh chế Để thu protein dạng tinh sạch, người ta thường dựa vào đặc điểm tương đồng tính chất khác vốn có Căn vào nhiều đặc tính 40 khác hình dạng, kích thước, điện tích, tính ưa nước, khả tan không tan Trong số trường hợp, để dễ dàng cho việc tinh chế, người ta biểu protein dạng dung hợp với peptide có lực với ion kim ví dụ His-tag, có lực với kháng thể Myc-tag, Trong nghiên cứu này, gen ha5-1 dung hợp với đoạn gen mã hóa cho amino acid Histidine phía đầu N đầu C HA5-1 Vì vậy, dựa vào đặc tính để tinh chế protein tái tổ hợp Tuy nhiên, phần lớn TrxHA5-1 tổng hợp E coli dạng khơng tan nên protein phân tách dễ dàng với protein tan tế bào cách ly tâm thu cặn sau cặn chứa TrxHA5-1 pha lại đệm urê M DTT 10 mM Quy trình tinh chế protein trình bày phần phương pháp Để tinh chế protein tái tổ hợp, trước hết tế bào phá siêu âm, sau ly tâm loại bỏ pha tan nước Để loại bỏ protein tan nước khác, tủa tiếp tục rửa lại lần nước rửa đệm B1, sau tủa hòa tan dung dịch B2 chứa urê M để thu nhận TrxHA5-1 Chúng thử nghiệm hòa tan tủa protein đệm urê M đệm hầu hết protein không tan khác bị tan nồng độ urê M nồng độ thích hợp cho việc làm tan protein tốt Ở nồng độ này, phần nhỏ protein khơng tan có lẫn mẫu loại bỏ kDa 116 66 TrxHA5-1 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế gel polyacrylamide; 1- Protein tổng số E coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang protein chuẩn; 3: phân đoạn chứa Trx-HA5-1 hòa tan urê M 41 Kết (Hình 3.9, đường chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu sau loại bỏ pha tan sạch, thể băng protein có kích thước khoảng 57,5 kDa đậm nhiều so với protein ban đầu Tuy nhiên, mẫu cịn lẫn số băng protein có kích thước xấp xỉ 40, 45 kDa Các protein protein vi khuẩn protein TrxHA5-1 bị phân cắt bị đứt gãy tạo Đối với protein tái tổ hợp sử dụng vaccine, điểm quan trọng phải có tính kháng ngun giống với tính kháng ngun protein tự nhiên Vì lý này, protein sau tinh chế tiến hành thử khả đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 thu từ thỏ kỹ thuật Western blot Trong thí nghiệm này, protein tái tổ hợp TrxHA5-l cố định màng PVDF, sau đó, ủ màng với kháng thể tự nhiên kháng HA5 thu từ thỏ nhiễm virút cúm H5N1 Tiếp tục ủ màng với kháng thể cộng hợp kháng thể nhận biết kháng thể tự nhiên kháng HA5 Ngoài ra, kháng thể cộng hợp gắn enzyme peroxidase (horse radish peroxidase- HRS) Do đó, thơng qua phản ứng màu enzyme, phát phức hợp kháng nguyên kháng thể nói Kết kiểm tra tính kháng ngun protein thể hình 3.10 kDa 116 66 TrxHA5-1 kDa 116 66 45 TrxHA5-1 35 35 25 25 18.4 18.4 14.4 14.4 A B Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên protein TrxHA5-1 tái tổ hợp; (A) Phân tích protein gel điện di polyacrylamide; (B): Phân tích khả bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng lại HA5 virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA5-1 sau tinh chế; - Thang protein chuẩn; - Protein tổng số E coli BL21 mang plasmid pETT22Trx 42 Quan sát màng PVDF, hình 3.10 (B) ta thấy đường chạy số protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn E coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy xuất băng màu có kích thước tương ứng với gen TrxHA5-l Trong đường chạy số xuất băng protein rõ nét, kích thước khoảng 57,5 kDa có khả kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 Điều chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l tổng hợp E coli với trình tự amino acid xác chứa định kháng nguyên nằm tiểu phần ha5-1 Đúng dự đốn phần trên, protein có kích thước khoảng 45 40 kDa có lẫn sản phẩm TrxHA5-1 tinh sản phẩm TrxHA5-1 bị đứt gãy bị phân cắt Vì phần bị phân cắt vùng epitope liên kết đặc hiệu với kháng thể nên lai Western blot, đoạn peptide liên kết tốt với kháng thể kháng HA 3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1 Một yêu cầu hàng đầu vaccine khả sinh đáp ứng miễn dịch tốt Chúng kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp TrxHA5-1 thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (haemagglutination inhibition-HI) kháng thể sinh sau gây miễn dịch cho gà với kháng nguyên TrxHA5-1 Protein TrxHA5-1 sau tinh chế trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt dùng để nhỏ mũi (gà tuần tuổi) Lượng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm nhỏ mũi 100 µg Sau gây miễn dịch lần 14 ngày, gà gây miễn dịch lần Huyết gà sau tiêm nhỏ mũi, mắt thu lại sau tuần tuần Theo nguyên lý phản ứng HI, kháng nguyên tái tổ hợp kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể giống với kháng thể kháng lại HA virus cúm tự nhiên kháng thể lấy từ gà gây miễn dịch liên kết với 43 kháng nguyên virus bị phân cắt (splited virus) làm phong bế vùng gắn với thụ thể hồng cầu gà Do đó, cho tế bào hồng cầu gà vào, hồng cầu bị sa lắng đáy giếng chữ U Vì vậy, kháng thể có hiệu giá cao khả gây sa lắng hồng cầu lớn, có nghĩa có khả ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu Hiệu giá HI (log2) 3,5 Tuần Tuần Tuần 2,5 Tuần Tuần 1,5 0,5 PBS PBS Dịch lênlên men tiêm Dịch men TrxHA5-1, TrxHA1E, tiêm TrxHA5-1, TrxHA1E,nhỏ nhỏ chủng đốiđối chứng mắt, mũi chủng chứng mắt mũi Hình 3.11: Khả sinh đáp ứng miễn dịch TrxHA5-1 gà Kết hình 3.11 cho thấy, lô đối chứng, gà gây miễn dịch với PBS không tạo kháng thể kháng lại TrxHA5-1, lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI mức thấp Điều giải thích protein chủng đối chứng có lẽ gây đáp ứng miễn dịch làm tăng bổ thể bổ thể có ảnh hưởng lên hiệu giá HI Tuy nhiên, hiệu giá thấp so với lô gây miễn dịch với TrxHA5-1 nên không ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Hiệu giá kháng thể gà tiêm nhỏ mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ đến tuần thứ đạt giá trị lớn sau 3, tuần, sang tuần thứ hiệu giá kháng thể lô tiêm giảm xuống nhanh lô nhỏ mắt, mũi hiệu giá có xu hướng giảm trì mức cao so với lô tiêm Như vậy, sơ thấy độ dài miễn dịch kháng nguyên đưa vào đường nhỏ mắt, mũi tốt đường tiêm 44 KẾT LUẬN Với kết thu trên, đến số kết luận sau: - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l biểu tốt tế bào E coli BL21 điều kiến promoter T7 chất cảm ứng IPTG có mơi trường - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l tổng hợp tốt điều kiện lên men 30°C, 0,5 mM IPTG thời gian thu mẫu sau cảm ứng - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l tinh chế thành cơng siêu âm hịa tủa urê M - Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên tính sinh miễn dịch gà Tuy nhiên hiệu giá kháng thể thu sau gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 thấp Hiệu giá tối đa thu gây miễn dịch đường tiêm 2,7 log2, gây miễn dịch qua đường nhỏ mắt, mũi 2,2 log 45 ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu đáp ứng miễn dịch cao gà với hiệu giá HI ngang với vaccine thương phẩm 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71 Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006) Nong Lam University Ho Chi Minh City Tiếng Anh Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP 603-616, Review Baigent S J., McCauley J W (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”, Virus Res 79(1-2), PP 177-185 Basler C F (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W and Subbarao K (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123 Bosch F X., Garten W., Klenk H D., Rott R (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology 113, pp 725-735 Bublot M., Pritchard N., Swayne D E., Selleck P., Karaca K., Suarez D L., Audonnet J C., Mickle T R (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza” Ann N Y Acad Sci, pp 193-201 Castrucci M R., Kawaoka Y (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764 47 Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457 10 Chen L M., Davis C T., Zhou H., Cox N J., Donis R O (2008), “Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses” PLoS Pathog 4(5), e1000072 11 Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P (2007), “A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421 12 Doherty P C., Turner S J., Webby R G., Thomas P G (2006), “Influenza and the challenge for immunology”, Nat Immunol 7(5), pp 449-55, Review 13 Ellebedy A H., Webby R.J (2009), Influenza vaccines, Vaccine 27, D65-D68 14 Fouchier R A., Smith D J (2010), “Use of antigenic cartography in vaccine seed strain selection”, Avian diseases, PP 220-223 15.Glick B.R and Pasternak J.J (2003), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC 16 Hilleman M (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), PP 3068-3087 17 Horimoto T., Kawaoka Y (2001) “Pandemic threat posed by avian influenza A viruses”, Clin Microbiol Rev 14(1), PP 129-149 18 Ito T., Couceiro J N., Kelm S., Baum L G., Krauss S., Castrucci M R., Donatelli I., Kida H., Paulson J C., Webster R G and Kawaoka Y (1998), “Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol 72, PP 7367-7373 19 Kamp B S., Hoffmann C., Preiser W (2006), Influenza report 20 Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G (2006), “Hijacking of the host-cell response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP 111-120, Review 48 21 Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R A., Osterhaus A D., Payungporn S., Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005), “Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280 22 Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M (1999), "Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses", Infect Dis 179, PP 55-60 23 Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J (2006), “Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 2803-2815 24 Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R (1999), “The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155 25 Murphy B R., Webster R G (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 1397-1445 26 Nayak D., Hui E., Barman S (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res 106(2), PP 147-165 27 Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y (2003), “Reverse genetics for the control of avian influenza”, Avian disease 47, PP 882-887 28 Nicholson K G., Wood J M., Zambon M (2003), “Influenza” Lancet 362 (93970), PP 1733-1745 29 OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals 30 Robertson B H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J C (1979), “Structure of the membrane protein of influenza virus Isolation and characterization of cyanogens bromide cleavage products”, J Viro, 30(3), PP 759-766 49 31 Suarez D L., Schultz-Cherry S (2000), “Immunology of avian influenza virus”, Dev Comp Immunol 24, PP 269-283 32 Subbarao K., Luke C (2007), “H5N1 viruses and vaccines” PLoS Pathog 3(3): e40, Review 33 Suzuki Y (2005), “Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses” Biol Pharm Bull 28(3), PP 399-408, Review 34 Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe Thomas and Wolff Mark (2006), “Safety and Immunogenicity of anInactivated Subvirion Influenza A (H5N1) Vaccine” ,NEJM, PP 1343-1351 35 Uiprasertkul M., Kitphati R., Puthavathana P., Kriwong R., Kongchanagul A., Ungchusak K., Angkasekwinai S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N, Auewarakul P (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis 13(5), PP 708-712 36 Wagner R., Matrosovich M., Klenk H (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections ”, Med Virol 12(3), PP 159-166 37 Weber T P., Stilianakis N I (2007), “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds”, Emerg Infect Dis 13(8), PP 1139-1143, Review 38 Webster R G (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, PP 436-441 39 Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N N., Govorkova E A., Ellis T M., Dyrting K C., Sit T., Perez D.R., Shortridge K.F (2002), “Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China”, J Virol 76(1), PP 118-126 40 Weiss R.A (2003), Cross-species infections Curr Top Microbiol Immunol 278, PP 47-71 41 WHO (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, NEJM, 1374 42 Wu C., Cheng X., He J., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X (2008), “A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1”, J Virol Methods 148(1-2), PP 81-88 50 43 Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M Q., Nidom C A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y., Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y., Hay A., Haire L F., Stevens D J., Russell R J., Gamblin S J., Skehel J J., Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382 44 Zhou J J., Fu J., Fang D Y., Yan H J., Tian J., Zhou J M., Tao J P., Liang Y., Jiang L F (2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 1515-1521 51 ... tài: ? ?Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5- 1 tái tổ hợp biểu Escherichia coli? ?? Với mục đích sử dụng protein tái tổ hợp để nghiên cứu đánh giá khả phát... - Trần Thị Nhài NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5- 1 TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... Trxha5 -1 Kiểm tra tính kháng nguyên Trxha5 -1 Kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp Hình 3 .1: Sơ đồ biểu đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5- 1 E .Coli 32 3 .1 THIẾT