Xác định kiểu hình và kiểu gen của các vi khuẩn đường ruột tiết esbl phân lập được tại bệnh viện bạc liêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÀNH TÍN XÁC ĐỊNH KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GEN CỦA CÁC VI KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT TIẾT ESBL PHÂN LẬP ĐƢỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠC LIÊU Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8270601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN THANH BẢO TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Nguyễn Thanh Bảo, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Trong q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Đồng thời, tơi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Bộ môn xét nghiệm, Phòng sinh học phân tử, Ban giám đốc Bệnh viện đa khoa Bạc Liêu, phòng vi sinh Bệnh viện Bạc Liêu, tạo điều kiện giúp đỡ q trình làm việc để hồn thành luận văn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, tất số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố người khác Tác giả luận văn NGUYỄN THÀNH TÍN ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn 1.1.1 Vi khuẩn 1.1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu thường gặp 1.2 Khái quát lịch sử phân loại ESBL 1.2.1 Vài nét lịch sử phát ESBL 1.2.2 Đặc điểm phân loại ESBL 1.3 Các phương pháp phát kiểu hình ESBL 10 1.3.1 Phương pháp đĩa đơn 10 1.3.2 Phương pháp đĩa đôi 11 1.3.3 Phương pháp đĩa kết hợp 13 1.3.4 Phương pháp que E test 14 1.3.5 Phương pháp tìm ESBL (Bằng máy tự động vitek2 compact): 15 1.4 Phương pháp sinh học phân tử phát kiểu gene ESBL: 15 1.4.1 Tầm quan trọng việc phát ESBL: 17 1.4.2 Tình hình phân bố ESBL giới Việt Nam: 18 1.4.3 Tình hình kháng thuốc vi khuẩn đường ruột: 20 iii 1.4.4 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL: 21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 22 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 22 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 22 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: 22 2.2.2 Cỡ mẫu: 22 2.2.3 Biến số: 22 2.2.4 Phân tích xử lý số liệu: 23 2.3 Số chủng vi khuẩn đường ruột dùng để thực multiplex PCR: 23 2.4 Địa điểm thực thời gian nghiên cứu: 23 2.5 Một số kỹ thuật vi sinh lâm sàng: 23 2.5.1 Cách lấy bệnh phẩm máu: 23 2.5.2 Cách lấy bệnh phẩm nước tiểu: 24 2.5.3 Cách lấy bệnh phẩm đàm: 24 2.5.4 Cách lấy bệnh phẩm mủ (tổn thương phần mềm): 24 2.6 Vật liệu phương pháp nghiên cứu: 24 2.6.1 Vật liệu: 24 2.6.2 Phương pháp thực hiện: 26 2.7 Đạo đức nghiên cứu: 37 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Xác định tỷ lệ vi khuẩn đường ruột theo loại bệnh phẩm: 38 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn E coli, K pneumoniae K oxytoca sinh ESBL: 38 3.3 Kết khảo sát kiểu gene qui định ESBL 41 3.3.1 Kết thí nghiệm monoplex PCR 41 3.3.2 Kết khảo sát nhiệt độ lai tối ưu mồi: 42 iv 3.3.3 Hiệu phản ứng multiplex PCR: 44 3.4 Xác định kiểu gene thường gặp vi khuẩn đường ruột sinh ESBL: 48 3.4.1 Tỷ lệ phân bố kiểu gien sinh men ESBL 48 3.4.2 Tỷ lệ kiểu tổ hợp gene mã hóa men ESBL: 49 CHƢƠNG BÀN LUẬN 51 4.1 Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột loại bệnh phẩm: 51 4.2 Tỷ lệ E coli, K pneumoniae K oxytoca sinh ESBL: 55 4.3 Xác định kiểu gene: 62 4.3.1 Tối ưu hóa quy trình khảo sát kiểu gene: 62 4.3.2 Tỷ lệ gene sinh ESBL phát được: 63 4.4 Hạn chế đề tài 67 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Các quy trình ni cấy phân lập vi khuẩn Quy trình định danh thử nghiệm kháng sinh đồ máy VITEK2 COMPACT Bảo quản vận chuyển mẫu Tách chiết dna từ vi khuẩn phương pháp cột Kết giải trình tự sản phẩm nhân mồi dùng nghiên cứu Kết điện di mẫu nghiên cứu danh sách kết Multiplex PCR Danh sách đối tượng tham gia nghiên cứu bệnh viện đa khoa tỉnh Bạc Liêu v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT KS : Kháng sinh TNHH : Trách nhiệm hữu hạn VK : Vi khuẩn VKĐR : Vi khuẩn đường ruột TIẾNG ANH AES : Advanced Expert System AST Card : Antimicrobial Susceptibility Test Card A : Adenine BA : Blood Agar CFU : Colony Forming Unit CTX-M : Cefotaximase CARB : Carbapenem CLSI : Clinical and laboratory Standards institute (Viện chuẩn mực lâm sàng xét nghiệm) C : Cytosine DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxynucleotide EPEC : Enteropathogenic E coli (Gây bệnh đường ruột) ETEC : Enterotoxigenic E coli (Gây độc tố ruột) EIEC : Enteroinvasive E coli (Xâm nhập đường ruột) EHEC : Enterohemorrhagic E coli (gây xuất huyết ruột) EAEC : Enteroaggregative E coli (Bám dính đường ruột) ESBLs : Extended spectrum beta lactamases vi GN : Gram Negative GP : Gram Possitive G : Guanine H2S : Hydroge Sulfide LT : Heat Labile Toxin MIC : Minimum Inhibitory Concentration MC : Mac Conkey Agar PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonuclic acid SHV-1 : Sulfhydryl variable type SMART : Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trend ST : Heat Stable Toxin TEM : Temoneria TAE : Tris Acetate EDTA T : Thymine VP : Voges Proskauer vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại theo chức năng: Bảng 1.2: Kết kháng sinh đồ 11 Bảng 1.3: Tóm tắt phương pháp phát vi khuẩn sinh ESBL 17 Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng nghiên cứu 25 Bảng 3.1: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột theo loại bệnh phẩm 38 Bảng 3.2: Tỷ lệ E coli, K pneumoniae K oxytoca sinh ESBL 39 Bảng 3.3: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL bệnh phẩm máu 39 Bảng 3.4: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL bệnh phẩm nước tiểu 39 Bảng 3.5: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL bệnh phẩm đàm 40 Bảng 3.6: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL bệnh phẩm mủ 40 Bảng 3.7: Tỷ lệ phân bố kiểu gene sinh ESBL 48 Bảng 3.8: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL E coli 49 Bảng 3.9: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL K pneumoniae 49 Bảng 4.1: Tóm tắt vi khuẩn sinh ESBL nghiên cứu 60 Bảng 4.2: So sánh với nghiên cứu bệnh viện nước SMART vùng châu Á Thái Bình Dương 61 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa đôi 12 Hình 1.2: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa kết hợp 13 Hình 1.3: Minh họa xét nghiệm phương pháp E-test 15 Hình 2.1: Minh họa nguyên tắc PCR đơn mồi (monoplex) 31 Hình 3.1: Kết điện di sản phẩm monoplex PCR 41 Hình 3.2: Kết điện di khảo sát nhiệt độ lai mồi CTX-M-Group-1 CTX-M-Group-9 42 Hình 3.3: Kết điện di khảo sát nhiệt độ lai mồi TEM 16S rRNA 42 Hình 3.4: Kết điện di khảo sát nhiệt độ lai mồi SHV 43 Hình 3.5: Hiệu nhân phản ứng multiplex PCR 44 Hình 3.6: Kết tối ưu nồng độ mồi nhân gene TEM 45 Hình 3.7: Kết tối ưu nồng độ mồi nhân gene 16S rRNA 45 Hình 3.8: Kết tối ưu nồng độ Mg2+ 46 Hình 3.9: Kết tối ưu nồng độ men DNA polymerase 46 Hình 3.10: Kết đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex PCR 47 Hình 3.11: Kết đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 48 PHỤ LỤC BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU (nguyên tắc lớp) UN 3373 “Thông tư 43/2011/TT-BYT ban hành ngày 05/12/2011” - Từ khúm khuẩn môi trường thạch dinh dưỡng hay thạch máu nuôi cấy sau 24 giờ, dùng khuyên lấy khúm khuẩn cho vào tube giữ chủng chứa BHI + glycerol 20% - Các tube giữ chủng vi khuẩn đặt hộp có nắp kín, ghi nhãn bên hộp dán mép nắp thân hộp (lớp 1) - Các hộp giữ hộp giữ nhiệt lớp (loại hộp có vỏ cứng chịu va đập) có đá khơ CO2 giữ lạnh âm, đá khơ phải đủ để phủ kín xung quanh hộp đựng chủng, dán mép niêm phong hộp giữ nhiệt, dán nhãn bên - Nếu hộp giữ chủng đá khơ đựng hộp xốp sau dán nhãn dán mép hộp xốp, toàn hộp xốp đặt vào hộp khác (gỗ, kim loại…), dán nhãn, niêm phong cẩn thận (lớp 3) - Nhãn bên ghi rõ địa người gửi địa người nhận - Hộp hồn thành đóng gói gửi đến môn xét nghiệm khoa điều dưỡng kỹ thuật y học trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, khoảng thời gian tối đa 24 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC TÁCH CHIẾT DNA TỪ VI KHUẨN BẰNG PHƢƠNG PHÁP CỘT Gồm bƣớc sau: Hút 10µl protease cho vào Eppendorf 1.5 ml vơ khuẩn Hút thêm 200µl mẫu giữ chủng vào Eppendorf 1.5 ml (Một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi cấy sau 24 cho vào BHI+glycerol 20% để giữ chủng) Hút thêm 200µl dung dịch KTC1 (Lysis buffer), ủ 700C 20 phút Cho thêm vào 100µl KTC2 (Isopropanol) Rồi chuyển hết vào cột Eppendorf ly tâm 8000 vòng phút Đỗ bỏ phần dịch lọc qua cột, cho thêm vào 600µl dung dịch KTC3 (ethanol), ly tâm 8000 vịng vòng phút Đỗ bỏ phần dịch lọc qua cột, cho thêm 600µl dung dịch KTC4 (Ethanol), ly tâm 8000 vòng phút Đỗ bỏ phần dịch lọc qua cột, sau quay khơ 13000 vịng phút Bỏ cột vào Eppendorf 1.5 Thêm 50µl dung dịch KTC5 (TE), ủ 700C 20 phút, ly tâm 13000 vòng phút Thu dịch DNA tinh bảo quản Hình ảnh bước tách DNA phương pháp cột Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn  Đỗ gel agarose 4% - Cân 2.8 gram Agar tinh - Thêm vào 70ml TEA 1X, đun chảy, - Sau thêm vào 7ml Eco Dye DNA (nhuộm màu) với tỉ lệ 1/10 - Lắc đổ vào gel chờ 30 phút đặc - Giữ gel vừa đổ xong tủ lạnh 2-80C hay thực điện di Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC SẢN PHẨM NHÂN BẢN CỦA CÁC MỒI DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU Sản phẩm nhân CTX-M-G1 mồi ngƣợc mẫu số 27 Sản phẩm nhân CTX-M-G1 mồi xuôi mẫu số 27 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân TEM mồi ngƣợc mẫu số 27 Sản phẩm nhân TEM mồi xuôi mẫu số 27 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân CTX-M-G1 mồi ngƣợc mẫu số 29 Sản phẩm nhân CTX-M-G1 mồi xuôi mẫu số 29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân CTX-M-G9 mồi ngƣợc mẫu số 29 Sản phẩm nhân CTX-M-G9 mồi xuôi mẫu số 29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân SHV mồi ngƣợc mẫu số 29 Sản phẩm nhân SHV mồi xuôi mẫu số 29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân TEM mồi ngƣợc mẫu số 29 Sản phẩm nhân TEM mồi xuôi mẫu số 29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân SHV mồi ngƣợc mẫu số 18 Sản phẩm nhân SHV mồi xuôi mẫu số 18 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sản phẩm nhân 16r RNA mồi ngƣợc Sản phẩm nhân 16r RNA mồi xuôi Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐIỆN DI CỦA MẪU NGHIÊN CỨU Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM DANH SÁCH KẾT QUẢ MULTIPLEX PCR MẪU NGHIÊN CỨU STT Mã số Chủng VK ESBL TEM 17-910390 E coli dương - - - + 17-028257 K pneumoniae dương - + - + 17-922941 E coli dương - - - - 17-902306 E coli dương - - + - 17-092677 E coli dương - - + - 17-926755 E coli dương + - + - 17-910019 E coli dương + - + - 17-099889 E coli dương + - + - 17-934002 K pneumoniae dương + + - + 10 17-065422 E coli dương - - - - 11 17-001151 E coli dương + - - + 12 17-017716 E coli dương + - + - 13 17-932048 E coli dương + - + - 14 17-018923 K pneumoniae dương + - + - 15 17-019111 E coli dương - - + - 16 17-934499 E coli dương - - + + 17 17-929660 E coli dương + - + - 18 17-915323 K pneumoniae dương - + + - 19 17-936555 E coli dương - - + - 20 17-053881 E coli dương - - + + 21 17-019007 E coli dương + - + - 22 17-013354 E coli dương + - - + 23 17-026471 E coli dương - - - + 24 17-938993 K pneumoniae dương - + + - 25 17-057228 K pneumoniae dương + + - - 26 17-915797 E coli dương - - - + 27 17-935993 E coli dương + - + - 28 17-062682 E coli dương + - + - 29 17-013658 K pneumoniae dương + + + + 30 17-030697 K pneumoniae dương - + - + 31 17-916916 K pneumoniae dương + + - - 32 17-916819 K pneumoniae dương - + + - 33 17-906525 E coli dương + - - + Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn SHV CTX-M-G1 CTX-M-G9 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM STT Mã số Chủng VK ESBL TEM 34 17-918193 E coli dương + - + - 35 17-931123 E coli dương + - + - 36 17-940299 E coli dương - - + - 37 17-945100 E coli dương - - - + 38 17-939804 E coli dương + - + - 39 17-019787 E coli dương - - - - 40 17-006757 K pneumoniae dương + + + - 41 17-919221 K pneumoniae dương + - + - 42 17-906979 K pneumoniae dương - + + - 43 17-911010 K pneumoniae dương - - - - 44 17-59694 K pneumoniae dương - + - - 45 17-043067 K pneumoniae dương - + + - 46 17-923457 E coli dương - - - + 47 17-063676 K pneumoniae dương - + - - 48 17-942089 K pneumoniae dương + + - - 49 17-945890 K pneumoniae dương + + + + 50 18-900508 K pneumoniae dương - + + - 51 17-909867 K pneumoniae dương - + + - 52 17-005146 K pneumoniae dương + + + - 53 17-001759 K pneumoniae dương - + + - 54 18-005659 K pneumoniae dương - + - + 55 18-007386 K pneumoniae dương - + - + 56 18-009328 K pneumoniae dương + + - - 57 18-005400 K pneumoniae dương - + - + 58 17-032060 K pneumoniae dương + - + - 59 17-018800 K pneumoniae dương + - + - 60 17-942632 K pneumoniae dương + + + - Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn SHV CTX-M-G1 CTX-M-G9 ... kháng sinh Bệnh vi? ??n Bạc Liêu bệnh vi? ??n tuyến tỉnh, năm số lượng bệnh nhân nhập vi? ??n với tình trạng nhiễm trùng vi khuẩn tiết ESBL ngày nhiều Bạc Liêu chưa có nghiên cứu vi khuẩn tiết ESBL gen có... sau: Xác định tỷ lệ vi khuẩn đường ruột phân lập theo loại bệnh phẩm thường gặp (máu, đàm, nước tiểu, mủ dịch tổn thương phần mềm) phòng vi sinh Bệnh vi? ??n Bạc Liêu Xác định tỷ lệ vi khuẩn đường ruột. .. pneumoniae Klebsiella oxytoca tiết ESBL Xác định kiểu gene thường gặp vi khuẩn đường ruột tiết ESBL 3 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn: 1.1.1 Vi khuẩn: [9] Vi khuẩn (Bacteria) theo tiếng