Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển khoa học ứng dụng thành tựu kỹ thuật vào y học giúp khống chế nhiều loại bệnh bệnh nhiễm khuẩn có chiều hướng gia tăng Hàng năm, tỷ lệ mắc bệnh tử vong nguyên vi khuẩn cao, điển hình trường hợp nhiễm khuẩn vi khuẩn Gram âm Một nguyên Klebsiella pneumoniae Loài vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng nhiễm trùng huyết, viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh phổi mạn tính nhiễm khuẩn bệnh viện, bệnh nhân suy giảm miễn dịch gây tỷ lệ tử vong tương đối cao Việc phát minh kháng sinh làm thay đổi mang tính cách mạng điều trị bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên, thực tế việc sử dụng kháng sinh tràn lan thập kỷ vừa qua dẫn đến xuất nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh đa kháng kháng sinh, gây nên mối nguy toàn cầu đe dọa y học đại Trong số lồi vi khuẩn có khả kháng thuốc kháng sinh Klebsiella pneumoniae nhiều nghiên cứu đề cập đến Mức độ kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae thay đổi theo quốc gia khu vực địa lý Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê chương trình giám sát quốc gia tính kháng thuốc kháng sinh ASTS (Antibiotic Sensitivity Testing Study): tỷ lệ Klebsiella đề kháng kháng sinh thuộc phân nhóm cephalosporin 30% (năm 1999) tăng lên 50% (năm 2004) Trên 99% chủng vi khuẩn nhạy cảm với imipenem Việc xác định nguyên gây nhiễm khuẩn nói chung Klebsiella pneumoniae nói riêng xác định độ kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn việc làm cần thiết để giúp thầy thuốc lâm sàng có phương hướng sử dụng kháng sinh hợp lý, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong, giảm chi phí điều trị Bên cạnh nghiên cứu xác định tỷ lệ gây nhiễm khuẩn mức độ kháng thuốc kháng sinh Klebsiella pneumoniae từ năm 1980, người ta nghiên cứu số yếu tố độc lực độ bám dính, đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O vỏ capsule có liên quan đến bệnh sinh vi khuẩn Năm 2007, tác giả Fang C.T., Kuo-Ming Y cộng nghiên cứu bệnh sinh áp xe gan nhận thấy nguyên gây áp xe gan có liên quan đến vai trị Klebsiella pneumoniae thuộc serotype K1 K2 Serotype K2 thường gặp chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu nhiễm khuẩn huyết Nghiên cứu Wen-Liang Y cộng cho biết, chủng Klebsiella pneumoniae có kháng nguyên vỏ, mang gen magA, rmpA thường gây áp xe gan gen magA mang đặc trưng kiểu hình độ nhày vi khuẩn, làm tăng khả kháng thực bào khả gây bệnh vi khuẩn Gen rmpA biết đến với vai trò việc tổng hợp polysaccharide ngoại bào liên quan đến chất nhầy Klebsiella pneumoniae Ở Việt Nam, nghiên cứu nước đa số tập trung vào việc xác định kiểu hình mức độ kháng thuốc kháng sinh Klebsiella pneumoniae mà chưa có nghiên cứu tìm hiểu gen serotype loài vi khuẩn Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương hàng năm tiếp nhận số lượng lớn bệnh nhân vào viện với bệnh cảnh lâm sàng thường đa dạng nặng, có số lượng tương đối nhiều bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Klebsiella pneumoniae Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, với mong muốn góp phần đáp ứng yêu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán điều trị bệnh Klebsiella pneumoniae gây nên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA chủng Klebsiella pneumoniae phân lập Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (1/2007-12/2011), với mục tiêu: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae bệnh phẩm mức độ kháng kháng sinh chúng Xác định tỷ lệ mang gen magA, rmpA; Serotype số chủng Klebsiella pneumoniae phân lập theo bệnh phẩm CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Xác định phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae bệnh phẩm 3 Xác định mức độ kháng kháng sinh chủng Klebsiella pneumoniae phân lập mẫu bệnh phẩm Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella pneumoniae mang gen magA, rmpA phân lập Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella pneumoniae phân lập thuộc serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57 CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án gồm có 107 trang khơng kể phụ lục, gồm chương, 19 bảng, biểu đồ, hình, 114 tài liệu tham khảo Bố cục luận án gồm: Đặt vấn đề 03 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 27 trang; Chương 2: Đối tượng, vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 trang; Chương 3: Kết nghiên cứu 25 trang; Chương 4: Bàn luận 24 trang; Kết luận 02 trang; Kiến nghị 01 trang; Danh mục cơng trình nghiên cứu có liên quan 01 trang Tài liệu tham khảo (tổng số 114 tài liệu, 26 tài liệu tiếng Việt, 88 tài liệu tiếng Anh) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ PHÂN LOẠI KLEBSIELLA Klebsiella chi quan trọng thuộc họ vi khuẩn đường ruột, đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức Edwin Klebs (1834 - 1913) Klebsiella có hệ vi khuẩn bình thường ruột người trưởng thành, với số lượng nhỏ, gặp đường hô hấp Klebsiella thành viên hệ vi khuẩn bình thường nhiều lồi động vật phân bố rộng rãi ngồi mơi trường Trong số loài thuộc giống Klebsiella, Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) loài gây bệnh điển hình quan trọng Căn vào kháng nguyên O, K pneumoniae chia thành nhóm, nhóm O1 hay gặp Dựa vào cấu trúc vỏ K pneumoniae, người ta chia thành 77 serotype 1.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ KLEBSIELLA 1.2.1 Đặc điểm sinh học K pneumoniae 1.2.1.1 Hình thể K pneumoniae trực khuẩn Gram âm, tiêu nhuộm Gram, vi khuẩn thường đứng thành đơi K pneumoniae có kích thước 0,3 - x 0,6 - µm 1.2.1.2 Kháng ngun K pneumoniae có kháng nguyên O kháng nguyên K Kháng nguyên O chất LPS (lipopolysaccharide)- kháng nguyên thân vi khuẩn, mang tính đặc hiệu nhóm LPS phức hợp protein, poliosid lipid, protein làm cho phức hợp có tính kháng ngun, poliosid định tính đặc hiệu kháng ngun cịn lipid định tính độc Dựa vào kháng nguyên O, K pneumoniae chia thành nhóm Kháng nguyên K (bản chất polysaccharide) - kháng nguyên vỏ kháng nguyên bề mặt mang tính đặc hiệu type Kháng ngun K có tác dụng giúp vi khuẩn tránh tế bào thực bào Dựa vào kháng nguyên K người ta chia vi khuẩn thành 77 serotype 1.2.1.3 Các yếu tố độc lực K pneumoniae có đường hơ hấp đường tiêu hóa khoảng 5% người bình thường, lồi vi khuẩn thành viên hệ vi khuẩn bình thường nhiều lồi động vật phân bố rộng ngồi mơi trường K pneumoniae với nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền gây bệnh, bao gồm: yếu tố bám xâm nhập, vỏ, nội độc tố, độc tố ruột, khả cạnh tranh sử dụng sắt, bacteriocin 1.2.1.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh K pneumoniae Tạo enzym Tạo enzym làm biến đổi phá huỷ cấu trúc phân tử kháng sinh làm kháng sinh tác dụng Những enzym nằm thành tế bào, bảo vệ vững tế bào Làm giảm tính thấm màng nguyên tương Vi khuẩn giảm mức độ thấm thuốc qua thành tế bào giảm tính thấm màng nguyên tương làm hệ thống vận chuyển qua màng K pneumoniae có màng ngồi chống lại khả thấm kháng sinh ưa nước Tạo isoenzym Trong số chế kháng kháng sinh K pneumoniae, chế vi khuẩn sinh enzym, vi khuẩn sinh -lactamase phổ rộng cần đặc biệt quan tâm, vi khuẩn sinh ESBLs đề kháng tồn nhóm -lactam, cephalosporins - kháng sinh dùng phổ biến Bên cạnh đó, việc sản sinh enzym carbapenemases metallo-beta-lactamase K pneumoniae làm cho vi khuẩn đề kháng với tất kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, bao gồm carbapenem 1.2.2 Phân loại serotype gen độc lực K pneumoniae Các yếu tố liên quan đến độc lực K pneumoniae độ bám dính có fimbriae bám khơng có fimbriae bám, bacteriocin, đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O vỏ polysaccharide Những yếu tố độc lực K pneumoniae để gây bệnh nhiễm trùng như: serotype huyết thanh, kiểu hình hypermucoviscosity, lipopolysaccharide, đại thực bào có chứa sắt pili Mức độ độc lực K pneumoniae gây nhiễm khuẩn khác nhau, serotype chủng vi khuẩn K pneumoniae chia thành 77 serotype độc lực serotype vùng địa lý khác khác Trong số 77 serotype kháng nguyên vỏ K pneumoniae theo phân loại serotype K1, K2, K4 K5 chứng minh có độc lực cao gây nhiễm khuẩn thực nghiệm chuột, đồng thời gây nhiễm trùng nặng người động vật Serotype K1 thường gặp trường hợp viêm phổi áp xe gan, gây biến chứng nặng nề làm nhiễm khuẩn hệ thống thần kinh trung ương viêm màng não K pneumoniae có serotype K1 có K2 thường có kiểu hình hypermucoviscosity có khả sản sinh chất nhày làm tăng độ nhớt độ bám dính vi khuẩn mơi trường ni cấy, làm cho K pneumoniae tính độc lực cao so với serotype khác dẫn đến gây tử vong Các nghiên cứu gen K pneumoniae gồm có: cps (capsular polysaccharide synthesis), rmpA, (regulator mucoid phenotype A), magA (mucoviscosity associated gene A) Chức gen hoàn toàn khác nhau, gen cps thực việc tổng hợp polysaccharide Gen rmpA chịu trách nhiệm điều hoà tổng hợp polysaccharide ngoại bào sinh kiểu hình hypermucoviscosity Gen magA mã hóa protein màng 43 kD Gen magA nằm operon có liên quan đến serotype K1 hay operon có chứa gen magA có serotype K1 gen magA chống lại thực bào hay gây áp xe gan, viêm màng não Gen magA cịn đóng vai trò quan trọng nhiễm trùng Klebsiella nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi áp xe gan, đồng thời mang đặc trưng kiểu hình độ nhày loài vi khuẩn làm tăng khả chống lại tượng thực bào Gen magA gần xác định chủng K pneumoniae gây áp xe gan bệnh nhân không Đài Loan mà nước khác giới Chủng K pneumoniae mang gen magA độc lực tăng gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng nề, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao người bệnh Nghiên cứu K pneumoniae Đài Loan cho thấy, kết hợp gen magA với kiểu gen chất nhày có liên quan đến sinh bệnh học thể áp xe gan Ngồi magA rmpA đóng vai trị quan trọng biểu kiểu hình chất nhày 1.2.3 Khả gây bệnh K pneumoniae 1.2.3.1 Nhiễm khuẩn huyết 1.2.3.2 Viêm phổi 1.2.3.3 Áp xe gan 1.2.3.4 Viêm màng não 1.2.3.5 Một số bệnh khác 1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán K pneumoniae 1.2.4.1 Phương pháp hiển vi 1.2.4.2 Ni cấy phân lập K pneumoniae lồi vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ngộ, phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường thạch thường, thạch máu Nhiệt độ thích hợp từ 35 - 37oC, pH 7- 7,2 Kỹ thuật kháng sinh đồ: Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch; Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu – MIC; Phương pháp phát ESBLs 1.2.4.3 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) Đây kỹ thuật cho phép nhân đoạn ADN mong muốn từ hệ gen ADN sinh vật cặp mồi đặc hiệu 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ K PNEUMONIAE 1.3.1 Nghiên cứu giới K pneumoniae 1.3.1.1 Tình hình nhiễm khuẩn K pneumoniae K pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, Wen-Chien K cộng (CS) thực nghiên cứu rộng khắp thời gian năm (1/1996 - 12/1997), với mạng lưới liên kết 12 bệnh viện nhiều nước khác nhau, 440 bệnh nhân bị NKH K pneumoniae với 445 mẫu dương tính từ bệnh phẩm máu cho thấy tỷ lệ NKH mắc phải cộng đồng có khác biệt quốc gia: 68% Đài Loan, 43% Mỹ, 39% Úc, 34% Nam phi, 22% Châu Âu 17% Ác-hen-ti-na 1.3.1.2 Tình hình kháng kháng sinh K pneumoniae Theo NNISS (National Nosocomial Infections Surveillance System): kết so sánh năm 2003 với giai đoạn 1998 - 2002 cho thấy tỷ lệ kháng cepholosporin hệ K pneumoniae Mỹ tăng lên 47% Ở Pháp tỷ lệ K pneumoniae kháng ceftazidime 40% Tính chung toàn khu vực châu Âu, chủng K pneumoniae phân lập khoa Điều trị tích cực kháng ceftazidime với tỷ lệ 42% Năm 2011, nhà khoa học Trung Quốc báo cáo tỷ lệ nhiễm K pneumoniae trẻ sơ sinh châu Phi xác định tỷ lệ kháng kháng sinh K pneumoniae với ampicillin chloramphenicol chiếm 83,3%; tỷ lệ kháng cephalexin cefotaxim chiếm 50%; kháng ceftriaxon, ceftazidim cefoperazon với tỷ lệ (16,7%) 1.3.1.3 Tình hình nghiên cứu serotype gen K pneumoniae Serotype K1, K2 kết hợp kiểu hình chất nhầy yếu tố độc lực K pneumoniae đặc biệt serotype K1, K2 bảo vệ vi khuẩn tránh tượng thực bào bạch cầu đa nhân trung tính tránh tác động kháng sinh Nghiên cứu Kuo-Ming Y CS Singapore Đài Loan thời gian 2002 - 2004 với đối tượng bệnh nhân áp xe gan nhiễm K pneumoniae cấy từ bệnh phẩm mủ máu, cho thấy serotype K1 chiếm 46,6% K2 chiếm tỷ lệ 20,5% Trong 100% số chủng mang gen magA rmpA Ở hai trung tâm Y tế Đài Loan năm 2008 tác giả Yu W L nghiên cứu 50 chủng K pneumoniae phân lập từ bệnh nhân áp xe gan nguyên phát Trong K1 (n=26; 52%), K2 (n=10; 20%) rmpA chiếm 90% 1.3.2 Nghiên cứu nước K pneumoniae Phạm Thị Hằng cộng nghiên cứu Bệnh Viện Nhi Trung ương (2005) cho biết: kiểu đa kháng kháng sinh 132 chủng K pneumoniae gây nhiễm khuẩn huyết bệnh nhi (trên tháng tuổi), kiểu kháng từ kháng sinh trở lên chiếm 80% Tại Bệnh viện Nhi Đồng (2007), K pneumoniae kháng trimethoprim/sulfamethoxazol (74%), cefuroxime (71,2%), cefotaxime (65,3%), gentamycine (63,6%), ceftazidime (53,1%), netilmycine (43,52%), amikacin (42,9%) Theo Phạm Hùng Vân nhóm nghiên cứu MIDAS nghiên cứu đa trung tâm tình hình kháng imipenem meropenem trực khuẩn Gram âm 16 bệnh viện Việt Nam (5/2008 - 11/2009), tỷ lệ K pneumoniae kháng imipenem 3,2% kháng meropenem 1,2% Tóm lại, đa số kết nghiên cứu tác giả giới cho thấy K pneumoniae thực tác nhân gây bệnh quan trọng Loài vi khuẩn ngày gia tăng tỷ lệ đề kháng với kháng sinh thường dùng lâm sàng Các tác giả nghiên cứu gen phân bố serotype chủng K pneumoniae, nhiên đa số nghiên cứu khía cạnh dừng lại phạm vi vài quốc gia với số mẫu nghiên cứu chưa lớn Đây lý mà Đơn vị nghiên cứu Lâm sàng - Đại học Oxford hợp tác khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương nghiên cứu phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA chủng K pneumoniae phân lập theo mẫu bệnh phẩm CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG Đối tượng nghiên cứu gồm 537 chủng vi khuẩn K pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân bị nhiễm khuẩn K pneumoniae nằm điều trị Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, đó: - 166 chủng vi khuẩn K pneumoniae hồi cứu từ (1/2007 đến 12/2008) lưu giữ tủ lạnh âm 200C - 371 chủng vi khuẩn K pneumoniae tiến cứu từ (1/2009-12/2011) phân lập từ mẫu bệnh phẩm 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng - Chủng vi khuẩn K pneumoniae phân lập định danh từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân - Chủng vi khuẩn K pneumoniae lưu giữ khoa xét nghiệm 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ Không phân lập vi khuẩn K pneumoniae từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nằm điều trị Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ 1/2009 đến 12/2011 Các chủng phân lập lần từ bệnh nhân 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Địa điểm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng năm 2007 đến tháng 12 năm 2011 2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.3.1 Môi trường, sinh phẩm thiết bị sử dụng để nuôi cấy, định danh K pneumoniae làm kháng sinh đồ 2.3.1.1 Môi trường - sinh phẩm * Môi trường cấy máu: chai cấy máu Becton Dickinson - Mỹ * Môi trường phân lập xác định K pneumoniae + Thạch máu (Blood agar) hãng Oxoid – Anh; + Thạch Sô-cô-la hãng Oxoid – Anh; + Thạch Uri-Select hãng Oxoid – Anh; + Thạch Mueller - Hinton Bio-Merieux; + Thạch mềm hãng Oxoid – Anh * Kít định danh K pneumonia: API 20E card Gram (-) Bio-Merieux – Pháp 10 * Khoanh giấy kháng sinh để làm kháng sinh đồ hãng Oxoid – Anh Card kháng sinh đồ Gram (-) mã số 411924 BioMerieux - Pháp 2.3.1.2 Các chủng chuẩn quốc tế để kiểm tra chất lượng * Escherichia coli ATCC 25922 * Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 * Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 2.3.1.3 Trang thiết bị + Máy cấy máu tự động BACTEC 9050- 9120 Becton Dickinson - Mỹ; + Máy định danh vi khuẩn tự động VITEK - Compact BioMerieux - Pháp; + Tủ ấm Memmert (INB 500-E5050872) tủ ấm CO2 Advatage - Lab (05-91845) - Đức; + Tủ an toàn sinh học Telstar Bio-II-A - Mỹ; 2.3.2 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ thiết bị dùng PCR 2.3.2.1 Sinh phẩm, hóa chất + dNTP’s hãng Roche - Mỹ; + MgCl2 hãng Qiagen - Đức; + Nước khử ion hãng Sigma - Mỹ; + Hostar taq ADN polymerase hãng Qiagen - Đức; + K1, K2, K5, K20, K54, K57, magA, rmpA, Sigma- Mỹ Gen Chiều dài Mồi Trình tự magA 1282 magA-F GGTGCTCTTTACATCATTGC magA-R GCAATGGCCATTTGCGTTAG 535 rmpA-F ACTGGGCTACCTCTGCTTCA rmpA rmpA-R CTTGCATGAGCCATCTTTCA K1 1045 K1- F GTAGGTATTGCAAGCCATGC K1- R GCCCAGGTTAATGAATCCGT K2 1120 K2 – F GGAGCCATTTGAATTCGGTG K2 – R TCCCTAGCACTGGCTTAAGT K5 280 K5 – F TGGTAGTGATGCTCGCGA K5 – R CCTGAACCCACCCCAATC K20 741 K20-F CGGTGCTACAGTGCATCATT 11 K20-R GTTATACGATGCTCAGTCGC K54 880 K54-F CATTAGCTCAGTGGTTGGCT K54-R GCTTGACAAACACCATAGCAG K57 1181 K57-F CGACAAATCTCTCCTGACGA K57-R CGCGACAAACATAACACTCG + Thạch Agarose dùng điện di gel hãng invitrogen - Mỹ; + Ethidium bromide dùng để nhuộm gel hãng Sigma- Mỹ; + ADN ladder- Sm 1283 hãng Fermentas - Mỹ; + TBE 10X hãng BD - Mỹ; + TAE (Tris Acetate EDTA) hãng Sigma - Mỹ; + PBS (Phosphate buffer Saline) hãng Sigma - Mỹ 2.3.2.2 Thiết bị - Dụng cụ + Máy ly tâm hãng Eppendorf, Đức; + Máy PCR Eppendorf - MasterCycler grandient, Đức; + Máy điện di mini hãng Bio-Rad, Pháp; + Máy đọc gel Geldoc hãng Bio-Rad, Pháp; + Máy chụp ảnh gel hãng Bio-Rad, Pháp + Dụng cụ, bao gồm: - Pipet eppendorf Đức Gilson, Nhật Bản loại 10 µl, 20 µl, 200 µl 1000 µl; - Týp vô trùng eppendorf loại 1,5ml; - Týp phản ứng huỳnh quang loại 0,2ml; - Týp trắng khơng có huỳnh quang loại 0,2ml; 2.4 PHƯƠNG PHÁP, KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mơ tả cắt ngang có phân tích, phương pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 2.4.2 Kỹ thuật ni cấy K pneumoniae 2.4.2.1 Kỹ thuật cấy máu 2.4.2.2 Kỹ thuật cấy dịch não tủy 2.4.2.3 Kỹ thuật cấy đờm 2.4.2.4 Kỹ thuật cấy dịch rửa phế quản 12 2.4.2.5 Kỹ thuật cấy dịch màng phổi, dịch màng bụng 2.4.2.6 Kỹ thuật cấy dịch mủ 2.4.2.7 Kỹ thuật cấy nước tiểu 2.4.2.8 Kỹ thuật cấy dịch họng 2.4.3 Kỹ thuật phân lập K pneumoniae 2.4.3.1 Theo dõi chai cấy máu 2.4.3.2 Phân lập, định danh K pneumoniae + Lấy chai máu dương tính ra, dùng kim tiêm vơ trùng hút hỗn dịch tương đương 0,5 ml, cấy phân vùng vào môi trường thạch máu, thạch Sô-cô-la Để đĩa thạch máu để tủ ấm 370C qua đêm + Các loại bệnh phẩm nuôi cấy môi trường khác lấy khỏi tủ ấm Quan sát hình dạng, màu sắc, số lượng khuẩn lạc, tiến hành nhuộm Gram Nếu trực khuẩn Gram âm tiếp tục tiến hành thử nghiệm sau: - Oxydase: âm tính; - Cấy chuyển khuẩn lạc vào ống thạch mềm để tủ ấm 37 0C qua đêm; - Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học định danh API 20E, để tủ ấm 370C qua đêm Sau đọc kết với phần mềm cài sẵn máy vi tính; - Hoặc sử dụng card định danh vi khuẩn Gram âm máy định danh tự động Vitek 2.4.4 Kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc K pneumoniae 2.4.4.1 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) * Nguyên lý: chủng vi khuẩn khác có mức độ nhậy cảm với loại kháng sinh khác nhau, biểu khác đường kính vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh có tiếp xúc vi khuẩn với kháng sinh 2.4.4.2 Phương pháp xác định nồng độ (MIC) kháng sinh với K pneumoniae Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC vi khuẩn với kháng sinh máy tự động VITEK - Compact dựa nguyên lý: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp 13 phát triển vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay suy giảm cường độ ánh sáng) ánh sáng qua giếng 2.4.4.3 Phương pháp phát ESBLs * Nguyên lý: Quan sát tượng kháng hay giảm nhạy cảm trực khuẩn đường ruột cephalosporin (thử nghiệm sàng lọc) - Thử nghiệm cộng lực cephalosporin hệ 3,4 clavulanat, có cộng lực dương ESBL dương tính Khi thấy tượng giảm mức độ nhạy cảm với kháng sinh theo tiêu chuẩn đây: Cefotaxim (CTX) < 27 mm Ceftriaxon (CRO) < 25 mm Ceftazidim (CAZ) < 22 mm Cefpodoxim (CEF) < 17 mm Aztreonam (ATM) < 27 mm Nếu vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh kháng sinh mở rộng phía khoanh AMC (vịng vơ khuẩn méo mó hình elip xuất vùng vô khuẩn khoanh kháng sinh khoanh AMC) vi khuẩn sinh ESBLs 2.4.5 Kỹ thuật PCR 2.4.5.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 2.4.5.2 Tách chiết ADN từ chủng vi khuẩn K pneumoniae 2.4.5.3 Chuẩn bị cho phản ứng PCR 2.4.5.4 Tiến hành phản ứng PCR + Quy trình chạy PCR với cặp mồi magA, rmpA serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57 dựa nghiên cứu Kuo-Ming Y Sylvain B đồng thời chúng tơi tiến hành tối ưu hóa quy trình đế có nồng độ chất thích hợp cho phản ứng PCR Quy trình tối ưu hóa phản ứng PCR bao gồm sau: 14 - Tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi: Sử dụng Gradient nhiệt độ để xác định nhiệt độ tối ưu thích hợp phản ứng - Tối ưu hóa nồng độ thành phần phản ứng PCR để không xuất dimer thừa - Tối ưu nồng độ ion Mg2+ xúc tác cho enzyme Taq polymease nhằm có sản phẩm PCR lớn 15 2.4.6 Sơ đồ nghiên cứu Chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm lưu giữ khoa Mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm máu Các loại dịch, đờm, nước tiểu, mủ Cấy vào chai CM Plus Aerobic/F Âm tính Để tủ ấm ủ 37 độ C Cấy vào TM, Sô cô la, uri-Select Đặt vào máy BACTEC 9050 Máy báo Âm Cấy TM Để tủ ấm ủ 37 độ C Có mọc VK Máy báo dương Có mọc VK Nhuộm Gram Không mọc VK Cấy vào TM Âm tính Để tủ ấm ủ 37 độ C Trực khuẩn Gram (-) Nhuộm Gram Oxydaza (-) Trực khuẩn Gram (-) Phân lập định danh lại SVHH, API 20E card Gram (-) Oxydaza (-) Phân lập định danh lại SVHH, API 20E card Gram (-) Klebsiella pneumoniae Làm KSĐ Chạy PCR phát magA, rmpA, K1, K2 16 2.5 Xử lý số liệu * Các số liệu xử lý phần mềm Stata 12.0, SAS 9.2 SPSS 19, so sánh phân tích kết * Test X2 sử dụng để đánh giá khác biệt hai tỷ lệ Giá trị p