Tình trạng đột biến gen PROS1 và các yếu tố liên quan trên bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu vô căn

Các bất thường di truyền của các yếu tố ly giải huyết khối như protein C, protein S và antithrombin đóng vai trò sinh bệnh học chủ đạo trong bệnh lý thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch ở người châu Á. Thông qua nghiên cứu này, bài viết tiến hành khảo sát các bất thường của gen PROS1 và sự thay đổi nồng độ protein S trên bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) vô căn người Việt Nam.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN PROS1 VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU VÔ CĂN Đỗ Đức Minh1 TÓM TẮT Mục tiêu: Các bất thường di truyền yếu tố ly giải huyết khối protein C, protein S antithrombin đóng vai trị sinh bệnh học chủ đạo bệnh lý thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch người châu Á Thông qua nghiên cứu này, tiến hành khảo sát bất thường gen PROS1 thay đổi nồng độ protein S bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) vô người Việt Nam Đối tượng phương pháp: 50 bệnh nhân HKTMS vô tham gia nghiên cứu giải trình tự vùng khởi động, tồn exon mã hoá vùng intron lân cận gen PROS1 đồng thời với định lượng nồng độ protein S huyết tương Kết quả: Chúng phát đột biến gen PROS1 bệnh nhân tham gia nghiên cứu Các đột biến trải dài tồn gen với đột biến vơ nghĩa đột biến sai nghĩa Trong số đột biến này, có đột biến lần đầu mơ tả có liên quan đến HKTMS Kết luận: Đột biến gen PROS1 phát 16% bệnh nhân HKTMS vô tham gia nghiên cứu liên quan chặt chẽ với tình trạng giảm protein S huyết tương Từ khóa: huyết khối tĩnh mạch sâu, gen PROS1, protein S ABSTRACT PROS1 GENETIC MUTATIONS AND ASSOCIATED FACTORS IN PATIENTS WITH IDIOPATHIC VENOUS THROMBOSIS Do Duc Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 158-162 Background: Hereditary disorders of hemolytic factors such as protein C, protein S and antithrombin are major pathophysiologic alteration in venous thrombo-embolism of Asian populations The aim of this study was to investigate PROS1 genetic mutations and plasma protein S concentration in Vietnamese patients diagnosed with idiopathic deep venous thrombosis Objectives and methods: Promoter, all coding exon and flanking intron regions of PROS1 gene were sequenced and plasma protein S concentration was assessed in 50 Vietnamese patients diagnosed with idiopathic deep venous thrombosis Results: Mutations of PROS1 were detected in eight out of 50 participants All the mutations including four missense and four nonsense mutations diffused along the gene Among detectable mutations, four of them were novel Conclusion: Mutations of PROS1 were identified in 18% Vietnamese patients diagnosed with idiopathic deep venous thrombosis and the mutational status was associated with protein S level Keywords: venous thrombosis, PROS1 gene, mutation, protein S Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932 999989 158 Email: ducminh@ump.edu.vn Chun Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Các nghiên cứu bệnh lý huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) nước châu Á cho thấy có nhiều đặc điểm khác biệt bệnh lý so với nước phương Tây Đầu tiên, tần suất HKTMS dân số Trung Quốc Hàn Quốc thấp từ 5-6 lần so với nước phương Tây(1) Hơn nữa, bệnh nhân châu Á điều trị với warfarin cho thấy nguy biến chứng chảy máu cao so với người da trắng dù có số INR tương đồng(2,3) Vì bệnh lý có nhiều yếu tố ngun nhân, khoảng 30% số ca HKTMS cho bất thường liên quan đến trình ly giải huyết khối Ở người da trắng, trạng thái tăng đông di truyền phổ biến yếu tố V Leiden biến thể G20210A gen prothrombin với tần suất 18,8% 7,1% bệnh nhân HKTMS(4) Tuy nhiên, hai biến thể gen phát bệnh nhân HKTMS châu Á(5) Bất thường yếu tố tăng đông khác bao gồm protein C, protein S antithrombin lại phổ biến dân số HKTMS người châu Á Sự khác biệt người phương Tây người châu Á có ý nghĩa lâm sàng yếu tố V Leiden Prothrombin G20210A yếu tố tăng đông yếu xét nghiệm khảo sát bất thường tăng đông không khuyến cáo Tuy nhiên, thay đổi protein C, protein S antithrombin lại yếu tố tăng đông mạnh làm gia tăng nguy HKTMS tái phát bệnh nhân Đáng ý rối loạn yếu tố tăng đông không đồng dân số người Châu Á Cụ thể rối loạn protein S phổ biến dân số Nhật Bản với đột biến chủ đạo K196E gen PROS1(6), đột biến lại không phát dân số Trung Quốc Hàn Quốc(7,8) Protein S cofactor, với phospholipid calci giúp cho protein C hoạt hóa bất hoạt yếu tố Va VIIIa cách cắt phân tử vị trí amino acid arginine đặc hiệu Chỉ có protein S tự (khoảng 40% protein S tổng số) tham gia vào q trình Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 cofactor protein C Thiếu hụt protein S phân thành dạng: dạng I dự thiếu hụt protein S tổng số protein S tự hoạt tính protein S giảm, dạng II có nồng độ protein S tổng số protein S tự bình thường hoạt tính protein S bị giảm, dạng III biểu qua giảm nồng độ protein S tự hoạt tính protein S giảm hàm lượng protein S tổng số bình thường(9) Các đột biến gen PROS1 thường dẫn đến tình trạng thiếu hụt sản phẩm protein đích phục vụ cho q trình ly giải huyết khối protein S Sự thiếu hụt có liên quan đến tình trạng tái phát HKTMS(10) Sự thiếu hụt protein di truyền theo kiểu di truyền trội nhiễm sắc thể thường Đối với bất thường di truyền liên quan đến protein S, việc xét nghiệm di truyền tư vấn di truyền cho cần thiết nguy tái phát cao bệnh nhân mang đột biến không điều trị phịng ngừa phù hợp(11) Do đó, thơng qua nghiên cứu này, tiến hành khảo sát tình trạng đột biến gen PROS1 yếu tố liên quan bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu vô ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân HKTMS thỏa tiêu chuẩn chẩn đoán hiệp hội tim mạch Châu Âu(12), với triệu chứng lâm sàng đặc trưng đau, đỏ, sưng phù chi chẩn đoán xác định siêu âm Doppler mạch máu, thu thập thông tin lâm sàng có liên quan đến bệnh lý bao gồm tuổi, giới, tiền gia đình, vị trí bị HKTMS Tiêu chuẩn loại trừ Các bệnh nhân ghi nhận có yếu tố nguy gây HKTMS bao gồm: Gãy xương lớn (chậu, đùi ) Thay khớp gối hay khớp hang Vửa trải qua phẫu thuật lớn Chấn thương Chấn thương cột sống Chun Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử 159 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Đang có bệnh lý ác tính (Abcam, Cambridge, Anh) kỹ thuật ELISA theo hướng dẫn nhà sản xuất Đang hóa trị Đang điều trị liệu pháp hormone Đang uống thuốc ngừa thai Nằm bất động giường >3 ngày Béo phì Có thai Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả Cỡ mẫu 50 bệnh nhân HKTMS thỏa tiêu chuẩn chọn tiêu chuẩn loại trừ Phương pháp thực Phân tích thống kê Các số liệu sau phân tích với phép kiểm thống kê t-test chi bình phương với ngưỡng giá trị p xem có ý nghĩa thống kê bé 0,05 Y đức Đề tài nghiên cứu chấp thuận Hội đồng đạo đức nghiên cứu Y sinh học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh với định số 452/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 18 tháng 12 năm 2018 KẾT QUẢ Các đặc điểm bệnh nhân tham gia nghiên cứu Giải trình tự gen PROS1 Quy trình giải trình tự gen PROS1 nghiên cứu chuẩn hóa nghiên cứu trước chúng tôi(13) với bước: Tách chiết DNA gene: Bệnh nhân thu thập lấy ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng có EDTA, lắc nhẹ nhàng Genomic DNA tế bào bạch cầu máu toàn phần tách chiết kit GeneJetTM whole blood genomic DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Phản ứng PCR khuếch đại giải trình tự gen mục tiêu: Điều kiện cặp mồi cho phản ứng PCR giải trình tự gen tồn exon vùng lân cận gen PROS1 mô tả nghiên cứu trước Phân tích kết quả: Kết giải trình tự xem có bất thường có thay đổi nucleotide so với trình tự tiêu chuẩn gen PROS1 mang mã số NG_009813.1 kho liệu Genebank Định lượng nồng độ protein S huyết tương Nồng độ protein C huyết tương định lượng kit Human Protein S ELISA Kit 160 Nghiên cứu Y học Chúng tiến hành chọn 50 bệnh nhân chẩn đoán HKTMS phù hợp với tiêu chuẩn chọn mẫu với đầy đủ thông tin lâm sàng cận lâm sàng Các đặc điểm 50 bệnh nhân chẩn đoán HKTMS tham gia nghiên cứu thể bảng Bảng 1: Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng 50 bệnh nhân HKTMS Đặc điểm Tuổi (TB ± ĐLC) Giới Nam (%) Nữ (%) Chân bị HKTMS Chân P Chân T Hai chân Tiền gia đình Có Khơng Nồng độ protein S (mg/dL) (TB ± ĐLC) Kết đột biến gen PROS1 Có Khơng Giá trị 44,9 ± 14,9 30% 70% 36% 54% 10% 8% 92% 0,03 ± 0,01 16% 84% Các đột biến gen PROS1 nồng độ protein S huyết tương bệnh nhân HKTMS Kết giải trình tự tồn exon mã hố vùng intron lân cận gen PROS1 50 bệnh Chuyên Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học nhân HKTMS cho thấy có đột biến sai nghĩa đột biến vơ nghĩa bệnh nhân Trong số này, có đột biến vô nghĩa đột biến sai nghĩa mô tả lần đầu y văn, bao gồm c.265C>T (p.L89*), c.715A>T (p.K239*), c.253T>C (p.Y85H) c.269G>T (p.R90L) Kết đột biến nồng độ protein S tương ứng thể Bảng Bảng 2: Tình trạng đột biến gen PROS1 nồng độ protein S huyết tương bệnh nhân có mang độ biến gen PROS1 nghiên cứu Bệnh Tình trạng đột biến Nồng độ protein S (mg/dL) nhân gen PROS1 (bình thường: 0,25 – 0,75) HK01 c.253T>C (p.Y85H) 0,0 HK02 c.233C>T (p.T78M) 0,0 HK03 c.269G>T (p.R90L) 0,0 HK11 c.265C>T (p.L89*) 0,7 HK17 c.1351 C>T (p.R451*) 0,0 HK42 c.253T>C (p.Y85H) 0,01 HK46 c.715A>T (p.K239*) 0,01 HK47 c.1351 C>T (p.R451*) 0,02 Trong số đột biến chúng tơi phát được, có đột biến vô nghĩa codon 451 báo cáo trước có liên quan đến bệnh lý HKTMS Bên cạnh đó, đột biến vơ nghĩa cịn lại xuất vị trí codon trước condon 451, đó, sản phẩm protein S bị ảnh hưởng nhiều khả đột biến liên quan với tình trang HKTMS Đối với đột biến sai nghĩa Mối liên hệ tình trạng đột biến gen PROS1 yếu tố liên quan: Bảng 3: Mối liên quan tình trạng đột biến gen yếu tố liên quan Biến số Tuổi (TB ± ĐLC) Giới Nam Nữ Chân bị HKTMS Chân P Chân T Hai chân Tiền gia đình Có Khơng Nhóm có đột Nhóm khơng Trị số p biến (N=8) đột biến (N=42) Nồng độ protein S (g/L) (TB ± ĐLC) 0,13 ± 0,2 0,03 ± 0,02 0,04 Chúng tiến hành so sánh biến số lâm sàng cận lâm sàng nhóm bệnh nhân có khơng có mang đột biến gen PROS1 Kết thể Bảng Có thể thấy bệnh nhân có mang đột biến gen PROS1 có nồng độ protein S thấp có ý nghĩa thống kê so với nhóm bệnh nhân khơng mang độ biến gen Ngồi ra, biến số khác khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm bệnh nhân BÀN LUẬN Protein S glycoprotein phụ thuộc vitamin K tổng hợp gan, với cấu trúc bao gồm vùng vùng GIa, vùng nhạy cảm thrombin, vùng EGF-like, SHBG-like Các bất thường gen PROS1 trải dài vùng gen khảo sát khơng có bất thường di truyền K196E phát hiện, đột biến phổ biến dân số người Nhật Bản(6) Trong số đột biến gen ghi nhận gen PROS1, đột biến vô nghĩa tạo mã dừng vị trí codon 89 239 đột biến nhiều khả gây bệnh, đột biến tạo mã dừng codon 451 báo cáo đột biến gây bệnh trước đây(14) Ngoài ra, đột biến codon 78 báo cáo đột biến gây giảm hoạt tính protein S(15) Các đột biến sai nghĩa lần đầu mô tả tiến hành dự đoán khả gây bệnh phần mền SIFT Polyphen-2(16,17) Kết dự đoán thể Bảng Bảng 4: Kết dự đoán khả gây bệnh đột biến sai nghĩa lần đầu mô tả 44,1 ± 12,9 45,1 ± 15,8 0,85 13 29 0,76 Biến thể 13 25 0,67 c.253T>C (p.Y85H) 37 c.269G>T (p.R90L) 0,43 Nhóm có đột Nhóm khơng Trị số p biến (N=8) đột biến (N=42) Biến số Chỉ số dự đoán theo SIFT 0,00 Ảnh hưởng chức protein 0,17 Dung nạp Chỉ số dự đốn theo Polyphen-2 0,99 Có thể tổn thương 0,01 Lành tính Cả hai đột biến mơ tả lần đầu c.253T>C (p.Y85H) c.269G>T (p.R90L) có liên quan Chuyên Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử 161 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 với kiểu hình giảm nồng độ protein S máu Sự thay tyrosine histidine codon 85 nằm vùng GIa protein S, thay đổi acid amin vùng báo cáo làm cho mRNA gấp cuộn sai lệch, thối hóa tính ổn định, làm cho sản phẩm protein đích bị giảm đáng kể(18) Mặc dù kết dự đoán từ phần mềm cho việc thay arginine vị trí codon 90 leucine không ảnh hưởng đến chức protein S, nhiên, nghiên cứu thực nghiệm lại cho thấy arginine vị trí có tính bảo tồn cao loài động vật hữu nhũ thay arginine histidine vị trí báo cáo ảnh hưởng lớn đến việc giảm sản xuất protein S(15,19) Nghiên cứu Y học 10 11 12 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy đột biến gây bệnh gen PROS1 chiếm tỷ lệ 16% nguyên nhân gây bệnh bệnh nhân HKTMS vơ Tình trạng đột biến có liên hệ chặt chẽ với giảm protein S huyết tương bệnh nhân tham gia nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Lee LH, Gallus A, Jindal R, Wang C, Wu CC (2017) Incidence of Venous Thromboembolism in Asian Populations: A Systematic Review Thromb Haemost, 117(12):2243-2260 Lip GYH, Wang K-L, Chiang CE (2015) Non-vitamin K antagonist oral anticoagulants (NOACs) for stroke prevention in Asian patients with atrial fibrillation: time for a reappraisal Int J Cardiol, 180:246-254 Nakamura M, Wang YQ, Wang C, et al (2015) Efficacy and safety of edoxaban for treatment of venous thromboembolism: a subanalysis of East Asian patients in the Hokusai-VTE trial J Thromb Haemost JTH, 13(9):1606-1614 Seligsohn U, Lubetsky A (2001) Genetic susceptibility to venous thrombosis N Engl J Med, 344(16):1222-1231 Angchaisuksiri P (2011) Venous thromboembolism in Asia an unrecognised and under-treated problem? Thromb Haemost, 106(4):585-590 Kimura R, Honda S, Kawasaki T, et al (2006) Protein S-K196E mutation as a genetic risk factor for deep vein thrombosis in Japanese patients Blood, 107(4):1737-1738 Tang L, Guo T, Yang R, et al (2012) Genetic background analysis of protein C deficiency demonstrates a recurrent 162 13 14 15 16 17 18 19 mutation associated with venous thrombosis in Chinese population PloS One, 7(4):e35773 Kim HJ, Seo JY, Lee KO, et al (2014) Distinct frequencies and mutation spectrums of genetic thrombophilia in Korea in comparison with other Asian countries both in patients with thromboembolism and in the general population Haematologica, 99(3):561-569 Gupta A, Tun AM, Tuma F Protein S Deficiency (2020) In: StatPearls Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK544344/ Mahmoodi BK, Brouwer J-LP, Ten Kate MK, et al (2010) A prospective cohort study on the absolute risks of venous thromboembolism and predictive value of screening asymptomatic relatives of patients with hereditary deficiencies of protein S, protein C or antithrombin J Thromb Haemost JTH, 8(6):1193-1200 Satpanich P, Rojnuckarin P (2019) Risk factors for venous thromboembolism (VTE) recurrences in Thai patients without cancer Hematol Amst Neth, 24(1):159-165 Mazzolai L, Aboyans V, Ageno W, et al (2018) Diagnosis and management of acute deep vein thrombosis: a joint consensus document from the European Society of Cardiology working groups of aorta and peripheral vascular diseases and pulmonary circulation and right ventricular function Eur Heart J, 39(47):4208-4218 Lê Gia Hoàng Linh, Phạm Văn Dũng, Nguyễn Hoài Nam, et al (2020) Khảo sát bất thường di truyền gen pros1 bệnh lý huyết khối tĩnh mạch Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 24(2):163 Caspers M, Pavlova A, Driesen J, et al (2012) Deficiencies of antithrombin, protein C and protein S - practical experience in genetic analysis of a large patient cohort Thromb Haemost, 108(2):247-257 Gandrille S, Borgel D, Eschwege-Gufflet V, et al (1995) Identification of 15 different candidate causal point mutations and three polymorphisms in 19 patients with protein S deficiency using a scanning method for the analysis of the protein S active gene Blood, 85(1):130-138 Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, et al (2010) A method and server for predicting damaging missense mutations Nat Methods, 7(4):248-249 Kumar P, Henikoff S, Ng PC (2009) Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm Nat Protoc, 4(7):1073-1081 Ikejiri M, Tsuji A, Wada H, et al (2010) Analysis three abnormal Protein S genes in a patient with pulmonary embolism Thromb Res, 125(6):529-532 Chu MD, Sun J, Bird P (1994) Cloning and sequencing of a cDNA encoding the murine vitamin K-dependent protein S Biochim Biophys Acta, 1217(3):325-328 Ngày nhận báo: 30/06/2020 Ngày nhận phản biện nhận xét báo: 20/02/2021 Ngày báo đăng: 10/03/2021 Chun Đề Chẩn Đốn Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử ... đột biến liên quan với tình trang HKTMS Đối với đột biến sai nghĩa Mối liên hệ tình trạng đột biến gen PROS1 yếu tố liên quan: Bảng 3: Mối liên quan tình trạng đột biến gen yếu tố liên quan Biến. .. chúng tơi tiến hành khảo sát tình trạng đột biến gen PROS1 yếu tố liên quan bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu vô ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân HKTMS thỏa tiêu chuẩn... (p.R90L) Kết đột biến nồng độ protein S tương ứng thể Bảng Bảng 2: Tình trạng đột biến gen PROS1 nồng độ protein S huyết tương bệnh nhân có mang độ biến gen PROS1 nghiên cứu Bệnh Tình trạng đột biến