NỘI DUNG1. Nắm được nội dung, nguyên tắc, các công thức Phương pháp quang phổ phân tử 1.1. Quang phổ hấp thụ UV VIS 1.2. Quang phổ hồng ngoại (IR) 1.3. Quang phổ huỳnh quang 2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
KIỂM NGHIỆM THUỐC Hướng dẫn: Bùi Thu Phương Nội dung môn học 01 Đại cương kiểm nghiệm thuốc 02 Kiểm nghiệm thuốc pp hóa học 03 Các pp hóa lý kiểm nghiệm thuốc 04 Kiểm nghiệm thuốc pp sinh học 05 Kiểm nghiệm dạng bào chế 06 Độ ổn định tuổi thọ thuốc Chương Kiểm nghiệm thuốc pp Vật lý NỘI DUNG Phương pháp quang phổ phân tử 1.1 Quang phổ hấp thụ UV - VIS 1.2 Quang phổ hồng ngoại (IR) 1.3 Quang phổ huỳnh quang Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chương 1: Phương pháp quang phổ phân tử PHẦN PHẦN 1 PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP PHÁP QUANG QUANG PHỔ PHỔ PHÂN PHÂN TỬ TỬ I Quang phổ hấp thụ UV-VIS II Quang phổ hồng ngoại (IR) III Quang phổ huỳnh quang I.I QUANG QUANG PHỔ PHỔ HẤP HẤP THỤ THỤ UV-VIS UV-VIS Độ hấp thụ Khi cho xạ đơn sắc qua mơi trường có chứa chất hấp thụ độ hấp thụ xạ tỷ lệ với nồng độ chất hấp thụ chiều dày môi trường hấp thụ (dung dịch chất hấp thụ) Mối quan hệ tuân theo định luật Lam bert – Beer biểu diễn phương trình sau: A Trong đó: T : Độ truyền qua I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau truyền qua dung dịch K : hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ L : chiều dài lớp dung dịch C : nồng độ chất tan dung dịch I.I QUANG QUANG PHỔ PHỔ HẤP HẤP THỤ THỤ UV-VIS UV-VIS Độ hấp thụ I.I QUANG QUANG PHỔ PHỔ HẤP HẤP THỤ THỤ UV-VIS UV-VIS Điều kiện áp dụng - Ánh sáng phải đơn sắc, - Khoảng nồng độ phải thích hợp: định luật Lambert-Beer giới hạn định nồng độ - Dung dịch phải suốt - Chất thử phải bền dung dịch bền tác dụng ánh sáng UV-VIS Máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis -Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ vùng tử ngoại khả kiến gồm hệ q uang học có khả tạo ánh sáng đơn sắc vùng từ 200 đến 800nm thiế p bị thích hợp để đo độ hấp thụ -Nguồn sáng cho vùng tử ngoại: đèn deuteri hydro, -Nguồn sáng cho vùng khả kiến: đèn tungsten -Cuvet thạch anh (quartz): dùng đo vùng tử ngoại khả kiến -Cuvet thuỷ tinh: đo vùng khả kiến 10 Tiến Tiến hành hành tách tách sắc sắc ký ký • Chuẩn bị mẫu thử • Tiêm mẫu Dung mơi phải đáp ứng yêu cầu sau: Độ tinh khiết cao để khơng có pic lạ Có cách tiêm mẫu vào cột Có thể hịa lẫn với dung mơi rửa giải Dùng bơm tiêm Cho đáp ứng nhỏ với detector Dung môi dung dịch thử phải lọc qua màng lọc 0,45 Dùng van tiêm mẫu thể tích xác định 50 www.trungtamtinhoc.edu.vn Đo Đo tín tín hiệu hiệu detector detector (detector (detector UV-VIS) UV-VIS) b) Tín hiệu detector a) Detector phải đáp ứng yêu cầu sau: • • • • Hoạt động vùng tuyến tính Có độ hấp thụ nhỏ dung mơi • Tín hiệu detector đo chất khỏi cột sắc ký máy ghi lại dạng pic Tránh lọt khơng khí vào cột detector Giữ cell làm thường xuyên 51 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7 CÁC CÁC PHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP PHÁP ĐỊNH ĐỊNH LƯỢNG LƯỢNG Phương pháp chuẩn hóa điện tích 04 Phương pháp chuẩn ngoại 01 03 Phương pháp thêm chuẩn 02 52 Phương pháp chuẩn nội www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.1 7.1 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn ngoại ngoại - Phương pháp chuẩn ngoại phương pháp hai mẫ u chuẩn mẩu thử tiến hành điều kiện Phương pháp - So sánh diện tích (chiều cao) pic mẫu thử với diện tích (chi chuẩn hóa: ều cao) pic mẫu chuẩn tính nồng độ chất tr ong mẫu thử Một điểm Nhiều điểm 53 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.1 7.1 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn ngoại ngoại • Chuẩn hóa điểm: chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẩu thử Tính nồng độ mẫu thử theo cơng thức: Trong đó: CX: nồng độ mẫu thử CS: nồng độ chất chuẩn SX (HX): diện tích (chiều cao) pic mẫu thử SS (HS): diện tích (chiều cao) pic mẫu chuẩn 54 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.1 7.1 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn ngoại ngoại Chuẩn hóa nhiều điểm: Đối với mẫu chuẩn ta tiến hành sau: - Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần ti ến hành sắc ký - S1 X Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn tương quan diện t ích S pic với nồng độ chất chuẩn C S2 55 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.1 7.1 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn ngoại ngoại Đối với mẫu thử: Chuẩn bị dãy mẫu thử với nồng độ tăng dần s Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính: ắc ký Y = a + bCx - Áp kiện diện tích (chiều cao) pic chất thử vào đườn Trong đó: g chuẩn nồng độ Y : Diện tích pic a : Giao điểm đường chuẩn với trục tung b : Độ dốc đường chuẩn Cx: Nồng độ chất thử 56 www.trungtamtinhoc.edu.vn Lưu ý: Độ lớn diện tích ( chiều cao) Khoảng pic mẫu thử phải nằm đoạn tuyến tuyến tính đường chuẩn tính S1 x S2 57 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.2 7.2 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn nội nội Là phương pháp người ta thêm vào mẫu chuẩn lẫn mẫu thử lượng chất tinh k hiết, tiến hành sắc ký điều kiện Chất thêm gọi chuẩn nội 58 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.2 7.2 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn nội nội Yêu cầu chất chuẩn nội: Trong điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải tách hồn tồn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất phân tích Khơng phản ứng với thành phần mẫu thử Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử Phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử 59 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.2 7.2 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn nội nội Phương pháp chuẩn hóa điểm Đối với mẫu thử: • Là phương pháp nội vào hai mẫu chuẩ -Tachuẩn tiến hành song thêm song Hệ số đáppháp ứng Fx:chuẩn hóa nhiều điểm Phương - Chuẩn bị dãy chuẩn có chứa lượng (hoặc nồng độ) n mẫu thử được Tiến hành ký.nội với lượng thêm sắc chuẩn chất chuẩn khác tất chứa chứa nhưđộ thang Cơng thức tính lượngnồng hoặcđộ nồng chuẩn thành phần m lượng Trong đó:(hoặc nồng độ) chuẩn nội ẫu thử Tính lượng: -Tính tỉ số ST/Sis dựa vào - mC,mIShành lần lượtsắc khối đường chất chuẩnchuẩn chuẩn nội Tiến kílượng vẽ đường chuẩn tìm nồng CC,CIS nồng độ chuẩn chuẩn nội độ chất thử (CT) SC, SIS lần lược diện tích pic chuẩn chuẩn nội Tính nồng độ: 60 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.3 7.3 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn hóa hóa điện điện tích tích Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc đồ Yêu cầu: - Tất thành phần rửa giải phát - Tất thành phần đáp ứng detector 61 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.3 7.3 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn hóa hóa điện điện tích tích • Ví dụ: phân tách sắc ký hỗn hợp gồm thành phần: X,Y,Z - Hàm lượng phần trăm X ta tính sau: - Nếu xét đến đáp ứng khác detector cần xác định hệ số đáp ứng chất để hiệu sai khác 62 www.trungtamtinhoc.edu.vn 7.3 7.3 Phương Phương pháp pháp chuẩn chuẩn hóa hóa điện điện tích tích Cơng thức hệ số đáp liên hệ với chất chuẩn: Phương trình tính %X là: • • Trong đó: SS SX: diện tích pic chuẩn pic thử CS CX: nồng độ chất chuẩn chất thử fS: hệ số hiệu chỉnh chuẩn 63 www.trungtamtinhoc.edu.vn ... cương kiểm nghiệm thuốc 02 Kiểm nghiệm thuốc pp hóa học 03 Các pp hóa lý kiểm nghiệm thuốc 04 Kiểm nghiệm thuốc pp sinh học 05 Kiểm nghiệm dạng bào chế 06 Độ ổn định tuổi thọ thuốc Chương Kiểm nghiệm. .. dụng của phương phương pháp pháp vào vào kiểm kiểm nghiệm nghiệm thuốc thuốc Định tính khử tinh khiết: cực đại hấp thụ đặc trưng định tính chất 18 Các phương pháp định lượng: - Phương pháp đo... quản chúng cồn tuyệt đối để tránh mốc 16 5 Ứng Ứng dụng dụng của phương phương pháp pháp vào vào kiểm kiểm nghiệm nghiệm thuốc thuốc Định tính khử tinh khiết: cực đại hấp thụ đặc trưng định