Phương pháp quang phổ hấp thụ dựa vào hiện tượng hấp thụ năng lượng của các bức xạ ánh sáng chiếu vào chất nghiên cứu. Khi chiếu ánh sáng vào một chất nó sẽ làm thay đổi năng lượng của nguyên tử, phân tử. Vùng tử ngoại (ultraviolet) là các bức xạ có bước sóng khoảng 185 – 400 nm Vùng khả kiến (visible) là các bức xạ có bước sóng khoảng 400 – 760 nm
KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) Phương pháp quang phổ hấp thụ dựa vào tượng hấp thụ lượng xạ ánh sáng chiếu vào chất nghiên cứu Khi chiếu ánh sáng vào chất làm thay đổi lượng nguyên tử, phân tử Vùng tử ngoại (ultraviolet) xạ có bước sóng khoảng 185 – 400 nm Vùng khả kiến (visible) xạ có bước sóng khoảng 400 – 760 nm QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Định luật Lambert – Beer - Độ truyền qua (T – Transmittance): Chiếu chùm tia đơn sắc có cường độ Io qua dung dịch có chiều dày l (cm) Sau bị dung dịch hấp thụ, cường độ chùm tia lại I Độ truyền qua T tính dạng % theo cơng thức: % QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Định luật Lambert – Beer - Độ hấp thụ (A – Absorbance): Độ hấp thụ A tính theo cơng thức: Độ hấp thụ A cịn gọi mật độ quang (D) độ tắt (E) QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Định luật Lambert – Beer Độ hấp thụ A dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ C dung dịch theo biểu thức : A = k.l.C - k hệ số hấp thụ phụ thuộc vào cấu tạo chất tan dung dịch - l chiều dày lớp dung dịch QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Định luật Lambert – Beer A = k.l.C - C tính theo mol/l l tính cm, ta có k = ε A = ε.l.C ε gọi hệ số hấp thụ mol ε phụ thuộc vào chất dung dịch, bước sóng chùm tia đơn sắc Để nhấn mạnh có viết: A = ε λ l.C QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Định luật Lambert – Beer A = k.l.C - C tính theo phần trăm (kl/tt), l theo cm, k gọi hệ số hấp thụ riêng hệ số tắt riêng, ký hiệu E A = E l.C A = E C = 1% l = 1cm Hệ số hấp thụ mol ε hay sử dụng mơ tả tính chất quang phổ chất hữu cơ, cịn phân tích kiểm nghiệm thường dùng hệ số hấp thụ riêng E QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Các yếu tố ảnh hưởng đến khả hấp thụ UV – VIS - Các yếu tố thuộc cấu trúc phân tử chất tan (hiệu ứng cảm ứng, liên hợp hiệu ứng không gian) - Các yếu tố thuộc môi trường: + Dung môi (DĐVN IV quy định: …Độ hấp thụ dung môi hỗn hợp dung môi đo đối chiếu với không khí khơng vượt q 0,4 tốt 0,2) + Tương tác lưỡng cực + Liên kết hydro + pH: C6H5OH (λ max = 285 nm) ↔ C6H5O- (λ max = 293 nm) + Nồng độ tương tác khác dung dịch QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Các yếu tố ảnh hưởng đến khả hấp thụ UV – VIS - Các yếu tố thuộc thiết bị - Ảnh hưởng tượng quang học khác: Phản xạ, khuếch tán, tán xạ QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Các điều kiện áp dụng định luật - Thiết bị phải có khả tạo chùm tia có độ đơn sắc định Độ đơn sắc cao tốt Cùng dung dịch đo máy khác thu trị số A khác Có nhiều nguyên nhân trước hết tính đơn sắc ánh sáng QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Các điều kiện áp dụng định luật - Chất thử phải bền dung dịch bền tác dụng tia UV – VIS - Dung dịch phải nằm khoảng nồng độ thích hợp - Dung dịch phải suốt ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định tính 1.1 Sử dụng cực đại hấp thụ - Dung dịch nước B12 có cực đại 278 ± nm, 361 ± nm 550 ± nm - Chloramphenicol có cực đại 278 nm - Dexamethason có cực đại 240 nm Theo DĐVN IV: Khi chuyên luận riêng đưa trị số riêng lẻ cho vị trí cực đại, điều hiểu trị số khảo sát lệch khơng q ± nm ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định tính 1.2 Sử dụng cực đại hấp thụ kết hợp với dạng phổ Cho biết mức độ tinh khiết chất : Ví dụ: Vitamin B12 (theo USP): A361/A278 từ 1,70 đến 1,90 A361/A550 từ 3,15 đến 3,40 ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định lượng 2.1 Chọn điều kiện định lượng * Chọn bước sóng Ta thường chọn bước sóng ứng với cực đại hấp thụ lớn Tại λ max, sai số bước sóng ảnh hưởng ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định lượng * Chọn khoảng nồng độ thích hợp Khoảng nồng độ quan hệ độ hấp thụ nồng độ tuyến tính Một số dược điển có ghi nồng độ phải chọn cho độ hấp thụ thu rơi vào khoảng vùng tối ưu 0,2 – 0,8 gần 0,43 tốt ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định lượng * Chọn điều kiện làm việc khác - Chiết, làm phản ứng tạo màu Ví dụ: + Để định lượng Vitamin B1 viên, sử dụng dung dịch HCl 0,1 N để chiết Vitamin B1 khỏi tá dược viên + Để định lượng Dexamethason chế phẩm, dùng phản ứng với Xanh Tetrazolium môi trường Tetramethyl amoni hydroxyd đo bước sóng 485 nm ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định lượng * Chọn điều kiện làm việc khác: - pH: Trong dung dịch nước, pH có ảnh hưởng lớn đến bước sóng hấp thụ cực đại (λ max) độ hấp thụ cực đại dung dịch (Amax) ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Ảnh hưởng pH phổ tử ngoại Phenobacbitone A: HCl 0,1M ; B: đệm borat 0,05M (pH = 9,2) ; C: NaOH 0,5M (pH = 13) ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Định lượng * Chọn điều kiện làm việc khác: - Dung môi Các dung môi phải tinh khiết Phần lớn chất mạch thẳng no dung mơi thích hợp cho vùng tử ngoại Khi chọn dung mơi sở để hồ tan dung mơi không phân cực tốt dung môi phân cực dung môi không phân cực cho đỉnh hấp thụ nhọn Bình thường nước alcol dung mơi cho vùng tử ngoại, cồn etylic có lẫn aldehyd bị hấp thụ mạnh phải lưu ý độ tinh khiết dung môi ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Các phương pháp định lượng - Phương pháp sử dụng E (1%, cm) - Các phương pháp sử dụng chất chuẩn: + Phương pháp đường chuẩn + Phương pháp so sánh + Phương pháp thêm - Chuẩn độ đo quang - Chiết đo quang (hay phương pháp acid màu) - Định lượng hỗn hợp ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC • Một số ý thực nghiệm - Bật máy trước 15 phút cho máy ổn định - Mẫu đem đo phải bảo đảm - Cốc đo phải tốt, thường cho phép sai số độ dày cốc ± 0,01 mm; ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC • Một số ý thực nghiệm - Để thu kết xác, nên sử dụng cốc đo với mẫu chuẩn mẫu thử - Đặt cốc đo phải thẳng đứng khoang đo mẫu, nên luôn hướng mặt cốc đo phía ánh sáng ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC • Một số ý thực nghiệm - Cốc đo phải tráng rửa lần dung dịch định đo - Cốc phải dùng cẩn thận để tránh xước, tránh để lại vết tay bề mặt cốc đo, dầu từ vết tay gây hấp thụ lớn ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC • Một số ý thực nghiệm - Khi đo mẫu chuẩn bị dung mơi dễ bay phải dùng nắp đậy trình đo mẫu, để tránh sai số nồng độ - Đối với mẫu yêu cầu nghiêm ngặt nhiệt độ phải có phận điều nhiệt suốt trình đo ... DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Các phương pháp định lượng - Phương pháp sử dụng E (1%, cm) - Các phương pháp sử dụng chất chuẩn: + Phương pháp đường chuẩn + Phương pháp so sánh + Phương pháp thêm... lượng nguyên tử, phân tử Vùng tử ngoại (ultraviolet) xạ có bước sóng khoảng 185 – 400 nm Vùng khả kiến (visible) xạ có bước sóng khoảng 400 – 760 nm QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV –... mơ tả tính chất quang phổ chất hữu cơ, cịn phân tích kiểm nghiệm thường dùng hệ số hấp thụ riêng E QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN (UV – VIS) * Các yếu tố ảnh hưởng đến khả hấp thụ UV –