HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) GIỚI THIỆU CHUNG Sắc ký nhóm phương pháp hóa lý dùng để tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha tiếp xúc không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động Sắc ký lỏng phương pháp tách sắc ký, pha động chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa cột CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Khái niệm HPLC phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hóa học với nhóm hữu CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.2 Các đại lượng đặc trưng Kết trình tách chất detector phát hiện, phóng đại ghi thành sắc ký đồ: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.2 Các đại lượng đặc trưng - Thời gian lưu tR (Retention time) - Hệ số phân bố (Distribution factor) - Hệ số dung lượng k' (Capacity factor) - Độ chọn lọc α (Selectivity-factor) hay gọi Độ lưu giữ tỷ đối r: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.2 Các đại lượng đặc trưng - Pic sắc ký - Hiệu cột số đĩa lý thuyết biểu kiến N (Theoretical plates) - Hệ số đối xứng As (Symmetry factor) hay hệ số kéo đuôi T (Tailing factor) CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.2 Các đại lượng đặc trưng - Tỷ số đỉnh-hõm (Peak-to-valley ratio) - Tỷ số tín hiệu nhiễu (Signal-to-noise ratio) - Độ lặp lại hệ thống (System repeatability) - Các thông số động học dỗng pic TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG: Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ pH biểu kiến pha động, lưu lượng, kích thước cột, nhiệt độ áp suất, đặc tính pha tĩnh, mức biến đổi hóa học độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu hạt, diện tích bề mặt riêng, trường hợp pha đảo mức độ biến đổi hóa học TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG: Nếu khơng có dẫn khác chun luận hệ thống phải đạt yêu cầu sau đây: Hệ số đối xứng pic phải khoảng 0,8 - 1,5, trừ có dẫn khác tiêu chuẩn Trừ có dẫn riêng, độ lệch chuẩn tối đa phép cho lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn 2,0% Yêu cầu áp dụng cho phép định lượng thành phẩm ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ: Để thỏa mãn tiêu chí yêu cầu tính phù hợp hệ thống, mà không làm thay đổi phương pháp, điều chỉnh thơng số sắc ký phạm vi định Với thông số quan trọng, việc điều chỉnh xác định rõ ràng tiêu chuẩn để đảm bảo tính phù hợp hệ thống Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ lúc gây tác động tích lũy hiệu hệ thống MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu tạo chi tiết tính 5.2.4 Cột phân tích Chất nhồi cột tùy theo loại cột kiểu SK Thông thường chất nhồi cột Silicagel Silicagel silan hóa bao lớp mỏng hữu Đối với phương pháp phân tích yêu cầu nhiệt độ cột cao thấp nhiệt độ phịng cột đặt phận điều nhiệt MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu tạo chi tiết tính 5.2.5 Detector Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiêu ghi sắc đồ để định tính định lượng Tuỳ theo tính chất chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu tạo chi tiết tính 5.2.6 Máy ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát detector truyền sang - Máy ghi đơn giản vẽ sắc đồ, ghi thời gian lưu , diện tích pic chiều cao pic,% diện tích pic - Phần mềm thiết bị ngồi khả ghi cịn có khả xử lý kết quả, lưu kết quả, bảo mật, phân quyền sử dụng KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.1 Chuẩn bị dụng cụ máy móc Máy HPLC phải hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo độ độ lặp lại kết Tiến hành hiệu chuẩn theo tài liệu hãng sản xuất theo SOP phịng thí nghiệm Đặc biệt cột sắc ký phải kiểm tra số đĩa lý thuyết định kỳ rửa quy định sau lần chạy KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.2 Chuẩn bị pha động Các hóa chất dung mơi phải loại tinh khiết HPLC Pha dung môi động, đặc biệt dung môi để tách hỗn hợp nhiều thành phần phải pha chế xác để ổn định theo thời gian quy định Lọc dung mơi qua màng lọc 0,2 - 0,45 µm, đuổi khí phương pháp: chạy siêu âm, đun nóng khuấy, sục khí trơ He, lọc áp suất giảm KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC Mẫu thử: Xử lý theo quy định tiêu chuẩn phải tn theo ngun tắc: + Dung mơi hịa tan hoạt chất phải tan pha động, nhiều trường hợp dùng dung mơi pha động để hịa tan + Phải loại bỏ chất không tan pha động không rửa giải cách lọc chiết + Phải lọc ly tâm, cuối lọc qua màng lọc 0,2 - 0,45 µm KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống mẫu thử dung môi, riêng nồng độ thành phần giống mẫu thử tốt nhất, ngồi dùng nồng độ khác phải nằm khoảng tuyến tính khảo sát thành phần KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.4 Cách đo HPLC Vận hành máy đo máy khác theo Hướng dẫn nhà sản xuất Cách đo tuân thủ quy định sau: + Chạy máy với dung môi động trước tiên phải đuổi bọt khí có hệ thống trước vào cột, đặt điều kiện chạy theo quy định chạy dung môi động để cân cột ổn định hệ thống tới đường thẳng, lấy đường theo điểm thực KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.4 Cách đo HPLC + Cài đặt điều kiện sắc ký theo quy trình phân tích + Xác định khả thích hợp hệ thống sắc ký (system suitability) + Tiêm dung dịch thử điều kiện với dung dịch chuẩn + Định tính: So sánh thời gian lưu, thời gian lưu tương đối, phổ UV, purity, similar factor ) + Định lượng: Dựa vào diện tích chiều cao pic chuẩn, thử, chuẩn nội (nếu có) KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.5 Những điều cần lưu ý sử dụng cột HPLC - Lọc đuổi khí dung mơi trước dùng: lọc qua giấy lọc 0,45 µm - Tất chất tương tác thêm vào pha động (muối, đệm, chất tạo cặp ion ) phải đạt độ tinh khiết cao (dùng cho HPLC ) KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.5 Những điều cần lưu ý sử dụng cột HPLC - Phải tính đến độ hịa tan chất hòa tan trường hợp chạy Gradient dung môi Khi tăng thành phần đệm pha động phải đảm bảo nồng độ muối tương thích (khơng bị kết tủa lại) pha động sau - Đối với mẫu có chứa thành phần tạp lưu giữ mạnh cột phải xử lý mẫu trước để loại thành phần KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.5 Những điều cần lưu ý sử dụng cột HPLC - Nhiệt độ cột pH pha động phải tuân theo Catalog kèm theo cột - Áp suất cột: không để cột làm việc liên tục áp suất cao (> 200 bar) - Phải rửa hết dung dịch đệm cột bảo quản cột dung mơi thích hợp sau sử dụng, Đậy chặt đầu cột KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.5 Những điều cần lưu ý sử dụng cột HPLC - Tránh tác động vật lý sử dụng sai: đánh rơi, gõ đập mạnh hay vặn chặt lắp cột - Sử dụng tiền cột thích hợp cho loại cột - Phục hồi cột HPLC nên tham khảo khuyến cáo nhà sản xuất (theo Catalog kèm theo cột tài liệu NSX cung cấp) KỸ THUẬT TIẾN HÀNH 6.5 Những điều cần lưu ý sử dụng cột HPLC - Khi tiến hành phân tích phải đảm bảo chắn dung mơi pha động trộn lẫn với dung mơi bảo quản cột Khi cột bị khô bảo quản trình vận chuyển phải phục hồi cột cách cho chạy qua cột hỗn hợp dung môi tinh khiết với số lượng dung môi sử dụng gấp 10 - 20 lần thể tích cột, sau tiến hành cân cột pha động Any question? Please don’t… ... nhồi 5 MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.1 Sơ đồ cấu tạo Bình chứa dung môi động Bơm cao áp Bộ phận tiêm mẫu Cột HPLC (pha tĩnh) Detector Máy ghi tín hiệu MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu... MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu tạo chi tiết tính 5.2.6 Máy ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát detector truyền sang - Máy ghi đơn giản vẽ sắc đồ, ghi thời gian lưu , diện tích pic chiều cao. .. nhiệt độ cột cao thấp nhiệt độ phịng cột đặt phận điều nhiệt 5 MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5.2 Cấu tạo chi tiết tính 5.2.5 Detector Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiêu ghi sắc đồ để